本發(fā)明涉及生物工程薄膜材料制備方法，尤其涉及構(gòu)建有肌腱組織微環(huán)境的可植入薄膜的制備方法，具體的，是一種可植入的點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
：骨肌腱結(jié)合部位撕裂是常見的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的損傷，這種損傷常常是外力引起的肌肉突然猛力的收縮進(jìn)而導(dǎo)致的肌腱起止點(diǎn)的完全或部分?jǐn)嗔言斐啥蝿?chuàng)傷，是長(zhǎng)期困擾運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界的難題。干細(xì)胞是一種具有分化潛能的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生高度分化的功能細(xì)胞。干細(xì)胞的分化方向，是基于細(xì)胞自身的狀態(tài)和微環(huán)境因素所決定。其中微環(huán)境因素，包括干細(xì)胞與周圍細(xì)胞，干細(xì)胞與胞外基質(zhì)以及干細(xì)胞與可溶性因子的相互作用。誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肌腱組織，是治療骨肌腱撕裂的一個(gè)重要的研究方向。目前，有研究表明，生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)可以有效促使干細(xì)胞分化為肌腱細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)受損肌腱組織的愈合，然而生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴，且大多僅適用于體外誘導(dǎo)，在現(xiàn)實(shí)的臨床手術(shù)中難以應(yīng)用，限制了體外研究向體內(nèi)臨床化應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為解決以上技術(shù)問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一種可植入體內(nèi)用于構(gòu)建肌腱組織微環(huán)境的薄膜的制備方法，具體為一種點(diǎn)擊化學(xué)改性檸檬酸1，8辛二酯薄膜，本發(fā)明是采用如下方案實(shí)現(xiàn)的：一種可植入的點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜，原料包括含有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯和含有炔基的聚檸檬酸1，8辛二酯。一種制備以上所述的點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜的方法，包括如下步驟：步驟一，準(zhǔn)備肌腱組織，進(jìn)行冷凍切片，得到肌腱組織切片；步驟二，將聚二甲基硅氧烷基體與固化劑混合，澆筑于肌腱組織切片上進(jìn)行固化，然后再將固化后的聚二甲基硅氧烷基體從肌腱組織切片上取下，形成了聚二甲基硅氧烷模具；步驟三，將含有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯與含有炔基的聚檸檬酸1，8辛二酯混合澆筑在聚二甲基硅氧烷模具上，加熱進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜。優(yōu)選地，制備點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜的方法還包括：將步驟三中形成的點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯浸泡于i型膠原蛋白醋酸溶液，i型膠原蛋白在點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜的表面形成i型膠原蛋白涂層，然后將具有i型涂層的聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從i型膠原蛋白醋酸溶液中取出，干燥形成具有涂層的點(diǎn)擊化學(xué)改性的聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜。其中，步驟一中，肌腱組織切片的厚度為15μm～25μm。其中，步驟二中，聚二甲基硅氧烷基體與固化劑的混合的比例為10：1～1：1.其中，步驟二中，聚二甲基硅氧烷基體在肌腱組織上的固化時(shí)間為2h～72h。其中，步驟二中，聚二甲基硅氧烷基體在肌腱組織上的固化溫度為37℃～95℃。其中，步驟三中，具有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯與具有炔基基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯混合比例為1:10到1:1。其中，步驟三中，具有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯與具有炔基基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為24-120小時(shí)。其中，干燥后，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜的表面的i型膠原蛋白涂層的濃度為30μg/c㎡～300μg/c㎡。本發(fā)明中，對(duì)聚檸檬酸1，8辛二酯，進(jìn)行化學(xué)點(diǎn)擊改性，聚檸檬酸1，8辛二酯中兩個(gè)取代基團(tuán)，疊氮基團(tuán)與炔基在加熱的情況下發(fā)生了點(diǎn)擊反應(yīng)，形成了三唑環(huán)，其剛性好，環(huán)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，如此，可減緩聚檸檬酸1，8辛二酯降解的時(shí)間，能給干細(xì)胞分化為肌腱細(xì)胞提供適宜的微環(huán)境與充分的時(shí)間。本發(fā)明中，制備的點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜具有優(yōu)良的親水性，使得干細(xì)胞在薄膜上具有更好的依附性，大大增加可分化干細(xì)胞的數(shù)量。本發(fā)明對(duì)聚檸檬酸1，8辛二酯進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)改性，并采用生物壓印的方法制備出具有肌腱組織微環(huán)境的可植入薄膜。通過(guò)控制反應(yīng)的條件和反應(yīng)物的配比以及施加誘導(dǎo)性膠原蛋白涂層，該薄膜可精確模擬肌腱組織微環(huán)境，在不需要任何生長(zhǎng)因子的情況下高效地誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化。本發(fā)明制備的構(gòu)建有肌腱組織微環(huán)境的聚檸檬酸1，8辛二酯的可植入薄膜可以通過(guò)誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化的方式促進(jìn)撕裂的骨肌腱結(jié)合部位的愈合，減少愈合時(shí)間和二次創(chuàng)傷的幾率。此外，制備該薄膜的原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，可以有效的降低患者與醫(yī)療系統(tǒng)的成本。因此這種構(gòu)建有肌腱組織微環(huán)境的聚檸檬酸1，8辛二酯的可植入薄膜具有廣闊的生物醫(yī)用前景。在本發(fā)明所采用的方案中，利用聚二甲基硅氧烷基體作為模具，可清晰的形成肌腱組織紋路，且模具穩(wěn)定，不會(huì)與聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并且脫模時(shí)不會(huì)黏附于薄膜上。本發(fā)明所采用的原料，聚檸檬酸1，8辛二酯在人體內(nèi)可降解，點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯降解產(chǎn)物為人體可吸收的檸檬酸鹽，檸檬酸鹽是常用的抗凝血?jiǎng)?，則由該材料制成的聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜具有良好的生物相容性和可降解性。本發(fā)明中，通過(guò)嚴(yán)格控制反應(yīng)的時(shí)間，溫度以及反應(yīng)原料的配比，該薄膜可以精確地模擬肌腱組織的力學(xué)性能(楊氏模量)。本發(fā)明中，制備的點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜完美地還原了肌腱組織的表面紋理，薄膜的紋理的深度以及分辨率均與肌腱組織相當(dāng)，可以有效地引導(dǎo)干細(xì)胞在薄膜上的排列，生長(zhǎng)及分化。并且該薄膜具有相對(duì)緩慢的降解速度且力學(xué)性能穩(wěn)定。本發(fā)明利用i型膠原蛋白附著于點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜上，進(jìn)一步誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為肌腱細(xì)胞。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1、以下實(shí)施例1與其他實(shí)施例所采用的實(shí)際藥品的來(lái)源如表1。表1本發(fā)明中實(shí)施例所采用的部分試劑藥品來(lái)源名稱生產(chǎn)廠家聚二甲基硅氧烷基體dowcorningsylgard固化劑dowcorningsylgard聚檸檬酸1，8辛二酯--i型膠原蛋白gibco本發(fā)明的含有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯與含有炔基的聚檸檬酸1，8辛二酯是參照已發(fā)表的制備流程進(jìn)行制備的。本實(shí)施例是利用點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯制備可植入人體內(nèi)用于構(gòu)建肌腱組織微環(huán)境的薄膜，具體過(guò)程為：1、取肌腱組織，冷凍切片，切片厚度為15μm，得到肌腱組織切片。2、取聚二甲基硅氧烷基體與固化劑，兩者按質(zhì)量比為5：1，混合，并攪拌，將其混合均勻后澆筑于肌腱組織切片上，加熱，溫度為37℃，此時(shí)聚二甲基硅氧烷在固化劑的作用下，在肌腱組織切片上進(jìn)行固化，固化將會(huì)形成肌腱組織紋理，固化2h后，將二甲基硅氧烷從肌腱組織切片上取下，這樣形成了聚二甲基硅氧烷模具。3、將含有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯與含有炔基的聚檸檬酸1，8辛二酯按1：5的配比混合澆筑于聚二甲基硅氧烷模具上，加熱至120℃，進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，24小時(shí)后，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜。4、將聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從二甲基硅氧烷模具上取下，浸沒(méi)于膠原蛋白i型膠原蛋白配制的膠原蛋白醋酸溶液，i型膠原蛋白醋酸溶液中的i型膠原蛋白物理性吸附于聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜的表面，形成i型膠原蛋白涂層。5、將具有i型涂層的聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從i型膠原蛋白醋酸溶液中取出，低溫干燥，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜，涂層的薄膜的濃度為30μg/c㎡。實(shí)施例2、1、取肌腱組織，冷凍切片，切片厚度為20μm，得到肌腱組織切片。2、取聚二甲基硅氧烷與固化劑按質(zhì)量比為8：1混合，并攪拌，將其混合均勻后澆筑于肌腱組織切片上，加熱，溫度為48℃，此時(shí)聚二甲基硅氧烷在固化劑的作用下，在肌腱組織切片上進(jìn)行固化，固化將會(huì)形成肌腱組織紋理，固化8h后，將二甲基硅氧烷從肌腱組織切片上取下，這樣形成了聚二甲基硅氧烷模具。3、將含有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯與含有炔基的聚檸檬酸1，8辛二酯按1：6的配比混合澆筑于聚二甲基硅氧烷模具上，加熱至115℃進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，72小時(shí)后，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜。4、將聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從聚二甲基硅氧烷模具上揭下，浸沒(méi)于膠原蛋白i型膠原蛋白配制的膠原蛋白醋酸溶液，i型膠原蛋白醋酸溶液中的i型膠原蛋白物理性吸附于聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜的表面，形成i型膠原蛋白涂層。5、將具有i型涂層的聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從i型膠原蛋白醋酸溶液中取出，低溫干燥，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜，涂層的薄膜的濃度為58μg/c㎡。實(shí)施例3、1、取肌腱組織，冷凍切片，切片厚度為20μm，得到肌腱組織切片。2、取聚二甲基硅氧烷與固化劑，兩者按質(zhì)量比為8：1，混合，并攪拌，將其混合均勻后澆筑于肌腱組織切片上，加熱，溫度為70℃，此時(shí)聚二甲基硅氧烷在固化劑的作用下，在肌腱組織切片上進(jìn)行固化，固化將會(huì)形成肌腱組織紋理，固化12h后，將聚二甲基硅氧烷從肌腱組織切片上取下，這樣形成了聚二甲基硅氧烷模具。3、將含有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯與含有炔基的聚檸檬酸1，8辛二酯按1：7的配比混合澆筑于聚二甲基硅氧烷模具上，加熱至110℃進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，84小時(shí)后，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜。4、將聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從二甲基硅氧烷模具上揭下，浸沒(méi)于膠原蛋白i型膠原蛋白配制的膠原蛋白醋酸溶液，i型膠原蛋白醋酸溶液中的i型膠原蛋白物理性吸附于聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜的表面，形成i型膠原蛋白涂層。5、將具有i型涂層的聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從i型膠原蛋白醋酸溶液中取出，低溫干燥，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜，涂層的薄膜的濃度為105μg/c㎡。實(shí)施例4、1、取肌腱組織，冷凍切片，切片厚度為21μm，得到肌腱組織切片。2、取聚二甲基硅氧烷與固化劑，兩者按質(zhì)量比為3：1，混合，并攪拌，將其混合均勻后澆筑于肌腱組織切片上，溫?zé)?，溫度?0℃，此時(shí)聚二甲基硅氧烷在固化劑的作用下，在肌腱組織切片上進(jìn)行固化，固化后將會(huì)形成肌腱組織紋理，固化24h后，將二甲基硅氧烷從肌腱組織切片上取下，這樣形成了聚二甲基硅氧烷模具。3、將含有疊氮基團(tuán)的聚檸檬酸1，8辛二酯與含有炔基的聚檸檬酸1，8辛二酯按1：10的配比混合澆筑于聚二甲基硅氧烷模具上，加熱112℃進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，96小時(shí)后，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜。4、將聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從二甲基硅氧烷模具上揭下，浸沒(méi)于膠原蛋白i型膠原蛋白配制的膠原蛋白醋酸溶液，i型膠原蛋白醋酸溶液中的i型膠原蛋白物理性吸附于聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜的表面，形成i型膠原蛋白涂層。5、將具有i型涂層的聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜從i型膠原蛋白醋酸溶液中取出，低溫干燥，形成點(diǎn)擊化學(xué)改性聚檸檬酸1，8辛二酯薄膜，涂層的薄膜的濃度為300μg/c㎡。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12