本發(fā)明涉及黃酮化合物在制備用于調(diào)節(jié)疾病PD-L1水平的藥物中的用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

腫瘤逃逸是目前腫瘤免疫治療公認(rèn)的障礙，患者腫瘤細(xì)胞自身的缺陷和免疫系統(tǒng)的功能障礙共同起作用促進(jìn)了腫瘤的瘋狂生長(zhǎng)。腫瘤的免疫逃逸機(jī)制與機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答之間存在著極為復(fù)雜的關(guān)系。腫瘤免疫治療的過程中早期腫瘤特異性的CD⁸⁺T細(xì)胞是激活的，隨著腫瘤生長(zhǎng)到后期，CD⁸⁺T細(xì)胞失去了殺傷的功能，腫瘤產(chǎn)生了抵抗力。總而言之，無論是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子還是免疫細(xì)胞的修飾都是為了極大限度地提高病人自身的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。不但要在體內(nèi)激活原有自身的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，還要讓已經(jīng)調(diào)動(dòng)的反應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)。

人PD-L1是1999年克隆的分子量約30-35KD、由290個(gè)氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白，為腫瘤壞死因子TNF超家族的成員之一。人PD-L1分子主要表達(dá)在靜止和活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞上，以及心臟、胎盤、血管上皮、肝臟、肺、腎和骨骼肌等非淋巴組織細(xì)胞表面，此外，PD-L1在肺癌、肝癌、乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌及卵巢癌等癌組織細(xì)胞上均有表達(dá)。許多癌組織被誘導(dǎo)后還可使PD-L1的表達(dá)上調(diào)。程序死亡受體1(PD-1)屬于B7家族，具有IgV和IgC樣區(qū)，跨膜區(qū)及胞漿區(qū)尾部，PD-L1與其T細(xì)胞上的受體PD1相互作用，當(dāng)兩者形成通路后，可以減弱T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，甚至導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能衰竭。在免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。腫瘤部位的微環(huán)境可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的PD-L1的表達(dá)，且表達(dá)廣泛。通過阻斷PD-L1/PD-1信號(hào)通路可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

因此，已經(jīng)提出抑制PD-L1信號(hào)傳導(dǎo)作為增強(qiáng)用于治療癌癥和感染的T細(xì)胞免疫力的手段。在公開號(hào)為CN102245640的中國專利申請(qǐng)中提出了抗PD-L1抗體及它們用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的用途。該申請(qǐng)中的抗體用于增強(qiáng)T細(xì)胞的功能，提供T細(xì)胞功能障礙病癥，其中該病癥包括感染(例如急性的和慢性的)和腫瘤免疫。

因此，以PD-L1為靶向的藥物已經(jīng)成了腫瘤以及免疫治療的新的研究方向。

黃酮化合物是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的一類化合物。已有研究證明黃酮化合物具有心血管系統(tǒng)活性、抗菌、抗病毒活性以及抗腫瘤活性。

阿可拉定，又名淫羊藿素、淫羊藿苷元，屬于黃酮化合物。阿可拉定是從中藥淫羊藿中提取分離得到的主要活性成分淫羊藿苷經(jīng)酶轉(zhuǎn)化得到的新的有效單體，其結(jié)構(gòu)如下式(Ⅱ)所示：

該化合物的制備方法公開于CN101302548，該方法以淫羊藿苷為原料，以β-葡萄糖苷酶進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物離心得到的沉淀用丙酮溶解，離心過濾得到上清液。再將離心得到的上清液用水進(jìn)行重結(jié)晶，得到阿可拉定純品。

在申請(qǐng)?zhí)枮?00780039276.9的中國專利中公開了一種用于治療與雌激素受體相關(guān)的疾病的化合物和方法，該專利中公開了阿可拉定用于治療與雌激素受體ER-α36相關(guān)的肝癌。

在現(xiàn)有技術(shù)中，并沒有針對(duì)阿可拉定這一類化合物對(duì)ER-α36以外的其他治療靶點(diǎn)的進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一類黃酮化合物能夠調(diào)節(jié)疾病中PD-L1水平。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供本發(fā)明的黃酮化合物在制備用于調(diào)節(jié)疾病中PD-L1水平的藥物中的用途。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種調(diào)節(jié)疾病中PD-L1水平的藥物，該藥物中含有本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)的黃酮化合物。

本發(fā)明一方面提供了本發(fā)明的黃酮化合物在制備用于調(diào)節(jié)疾病中PD-L1水平的藥物中的用途

R選自氫、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、含有一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代的(C₁-C₄)烷基、鹵素、氰基或者含有一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代的(C₁-C₄)烷氧基。

優(yōu)選地，其中R選自甲氧基或者鹵原子取代的甲基。

優(yōu)選地，其中所述的鹵原子為氟。

優(yōu)選地，其中所述的式(I)黃酮化合物為具有如下式(II)所示結(jié)構(gòu)的化合物

優(yōu)選地，其中所述的式(I)黃酮化合物為具有如下式(Ⅲ)所示結(jié)構(gòu)的化合物

優(yōu)選地，所述疾病為腫瘤。

優(yōu)選地，所述的腫瘤選自乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、白血病、肝癌、骨髓癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、子宮癌、肺癌和黑色素瘤中的一種或幾種。

優(yōu)選地，所述的藥物為口服制劑或注射劑。

優(yōu)選地，所述的注射劑為肌肉注射劑或靜脈注射劑。

本發(fā)明另一方面還提供了一種調(diào)節(jié)疾病中PD-L1水平的藥物，該藥物含有本發(fā)明的黃酮化合物。

優(yōu)選地，所述的疾病為腫瘤。

更優(yōu)選地，所述的腫瘤選自乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、白血病、肝癌、骨髓癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、子宮癌、肺癌和黑色素瘤中的一種或幾種。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的黃酮化合物在調(diào)節(jié)疾病中的PD-L1水平取得了非常好的效果，對(duì)于PD-L1高表達(dá)的腫瘤表現(xiàn)出了良好的藥學(xué)效果，通過治療，將PD-L1的水平有所降低，從而將腫瘤進(jìn)行了抑制。因此，本發(fā)明為黃酮化合物在PD-L1相關(guān)治療中提供了進(jìn)一步的研究方向。

附圖說明

圖1表示實(shí)施例3的阿可拉定對(duì)肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5中的PD-L1蛋白表達(dá)水平抑制圖。

圖2表示實(shí)施例4的阿可拉定對(duì)肺癌細(xì)胞H460中的PD-L1蛋白表達(dá)水平抑制圖。

圖3表示實(shí)施例5阿可拉定對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375中的PD-L1蛋白表達(dá)水平抑制圖。

圖4表示式(III)化合物對(duì)肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5中的PD-L1蛋白表達(dá)水平的抑制圖。

圖5表示實(shí)施例7阿可拉定對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A875中的PD-L1蛋白表達(dá)水平抑制圖。

圖6表示實(shí)施例8阿可拉定對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266細(xì)胞中的PD-L1蛋白表達(dá)水平抑制圖。

圖7表示在11例服用阿可拉定的肝癌患者中，血液PD-L1的變化趨勢(shì)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行示例性說明，不用于限制本發(fā)明，在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)所做的修改、改變、變型等都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

術(shù)語“疾病中PD-L1水平”指的是疾病相關(guān)的組織細(xì)胞或血清中的PD-L1表達(dá)水平。

術(shù)語“調(diào)節(jié)疾病中PD-L1水平”指的是通過本發(fā)明藥物的治療，病人腫瘤細(xì)胞，腫瘤組織或患者血液中的PD-L1表達(dá)量進(jìn)行下調(diào)。

術(shù)語“肌肉注射劑”指的是注射于肌肉組織中的注射劑。

術(shù)語“靜脈注射劑”指的是注入靜脈進(jìn)入血液的注射劑。

本發(fā)明中的“人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5”購自于日本癌癥研究銀行Japanese Cancer Research Bank(JCRB)，Tokyo，Japan，商品名稱PLC/PRF/5，商品編號(hào)為JCRB0406。

除非另外說明，本文中的“肺癌H460細(xì)胞”購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，商品名稱為NCI-H460，商品編號(hào)為3111C0001CCC000355。

除非另外說明，本文中的“黑色素瘤A375細(xì)胞”購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，商品名稱為A375，商品編號(hào)為3111C0001CCC000126。

除非另外說明，本文中的“黑色素瘤A875細(xì)胞”購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，商品名稱為A875，商品編號(hào)為3111c0001ccc000094。

除非另外說明，本文中的“人骨髓瘤U266細(xì)胞”購自北京北納生物技術(shù)研究院，商品名稱為U266，商品編號(hào)為BNCC337642。

除非另外說明，本發(fā)明中“阿可拉定”通過實(shí)施例1方法制備。

除非另外說明，本文中的“部分緩解(PR)”指的是經(jīng)過治療，病人得到了部分緩解。在治療結(jié)束時(shí)，通過影像檢測(cè)，如果病人腫瘤病灶未發(fā)生轉(zhuǎn)移，檢測(cè)腫瘤病灶最長(zhǎng)直徑；當(dāng)病人腫瘤轉(zhuǎn)移到了淋巴結(jié)以外的其他器官，檢測(cè)轉(zhuǎn)移病灶的最長(zhǎng)直徑，當(dāng)檢測(cè)到的腫瘤病灶最長(zhǎng)徑總和縮小≥30％或者更多，即稱為部分緩解；如果病人的腫瘤病灶轉(zhuǎn)移到了淋巴結(jié)，通過檢測(cè)病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶的最短直徑，如果檢測(cè)到的轉(zhuǎn)移病灶最短徑總和縮小≥30％或者更多，即被稱為部分緩解。

除非另外說明，本文中的“疾病穩(wěn)定(SD)”指的是經(jīng)過治療，病人的疾病穩(wěn)定。在治療結(jié)束時(shí)，通過影像檢測(cè)，如果病人腫瘤病灶未發(fā)生轉(zhuǎn)移，檢測(cè)腫瘤病灶最長(zhǎng)直徑；當(dāng)病人腫瘤轉(zhuǎn)移到了淋巴結(jié)以外的器官，檢測(cè)轉(zhuǎn)移病灶的最長(zhǎng)直徑，當(dāng)檢測(cè)到的腫瘤病灶最長(zhǎng)徑總和縮小未達(dá)到30％或者增加未達(dá)到20％，即稱為疾病穩(wěn)定；如果病人的腫瘤轉(zhuǎn)移到了淋巴結(jié)，通過檢測(cè)病人淋巴結(jié)腫瘤的最短直徑；如果檢測(cè)到的轉(zhuǎn)移病灶總和縮小未達(dá)到30％或者增加未達(dá)到20％，即稱為疾病穩(wěn)定。.

除非另外說明，本文中的“疾病進(jìn)展(PD)”指的是經(jīng)過治療，病人出現(xiàn)疾病進(jìn)展。在治療結(jié)束時(shí)，通過影像檢測(cè)，如果病人腫瘤病灶未發(fā)生轉(zhuǎn)移，檢測(cè)腫瘤病灶最長(zhǎng)直徑；當(dāng)病人腫瘤轉(zhuǎn)移到了淋巴結(jié)以外的器官，檢測(cè)轉(zhuǎn)移病灶的最長(zhǎng)直徑，當(dāng)檢測(cè)到的腫瘤病灶最長(zhǎng)徑總和增加達(dá)到20％，即稱為疾病進(jìn)展；如果病人的腫瘤轉(zhuǎn)移到了淋巴結(jié)，通過檢測(cè)病人淋巴結(jié)腫瘤的最短直徑，如果檢測(cè)到的轉(zhuǎn)移病灶最短直徑總和增加達(dá)到20％，即稱為疾病進(jìn)展。

用于蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)的PD-L1抗體購自于細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司(Cell Signaling Technology)，商品編號(hào)為#13684。

實(shí)施例1

阿可拉定的制備

阿可拉定又名淫羊藿素，是從中藥淫羊藿中提取分離得到。

在公開號(hào)為CN101302548的專利中公開了淫羊藿的制備方法。該方法以淫羊藿苷為原料，以β-葡萄糖苷酶進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物離心得到的沉淀用丙酮溶解，離心過濾得到上清液。再將離心得到的上清液用水進(jìn)行重結(jié)晶，得到淫羊藿純品。本發(fā)明中的淫羊藿苷購自陜西嘉禾植物化工有限責(zé)任公司公司，純度90％。

實(shí)施例2

式(I)化合物的制備

式(I)化合物的制備路線如下：

在該方法中，P為保護(hù)基團(tuán)，將化合物v的保護(hù)基脫除可得到化合物ⅵ。根據(jù)保護(hù)基不同，去除的方法也相應(yīng)變化，主要參見“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”(Greene T.W等著。John Wiley&Sons，紐約，1991)其中的方法。優(yōu)選的保護(hù)基為芐基、苯甲酰基、芐氧羰基、TBDMS(叔丁基二甲基硅基)、THP(四氫吡喃基)、甲基、MOM(甲氧基甲基)、PMB(對(duì)甲氧基芐基)等。

化合物ⅵ與異戊烯基溴在堿性條件下反應(yīng)，可制備化合物ⅷ。適用該反應(yīng)的溶劑包括：甲醇、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、THF(四氫呋喃)、水、甲苯、DME(1，2-二甲氧基乙烷)以及混合溶劑，如甲醇-水、DMF-水、四氫呋喃-水等等。在反應(yīng)中使用的溶劑優(yōu)選為水。適用于該反應(yīng)的堿包括：如氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸銫、甲醇鈉、氫化鈉、叔丁醇鉀、DBU(1,8-二氮雜二環(huán)-雙環(huán)(5,4,0)-7-十一烯)、正丁基鋰、LDA(二異丙基氨基鋰)、LHMDS(六甲基二硅基氨基鋰)等等，反應(yīng)溫度通常在約0-100℃之間，反應(yīng)時(shí)間為1-20小時(shí)。

其中式(ⅰ)化合物間苯三酚購自Acros公司，商品號(hào)為131040250。

式(Ⅲ)化合物的制備

式(Ⅲ)化合物按照方案1制備路線，其中P為甲基，化合物購自Acros公司，商品號(hào)為125660050；化合物購自Acros公司，商品號(hào)為303420010。

實(shí)施例3

檢測(cè)阿可拉定對(duì)肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的抑制。

實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞培養(yǎng)：首先將密度為90％的生長(zhǎng)在有酚紅的含有體積濃度為10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)的PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞，分配到無酚紅體積濃度為2.5％的胎牛血清(CS-FBS)的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)24小時(shí)；細(xì)胞密度在30％左右時(shí)進(jìn)行阿可拉定處理加藥處理。2小時(shí)后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在有IL-6存在的組別中對(duì)細(xì)胞用IL-6(10ng/ml)處理，與阿可拉定共同作用48小時(shí)收取細(xì)胞。

4個(gè)組別依次是在培養(yǎng)體系中只加入DMSO對(duì)照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、加入5μmol/L阿可拉定DMSO溶液、加入10ng/ml的IL-6、加入5μmol/L阿可拉定DMSO溶液和10ng/ml的IL-6的混合溶液，混合溶液中DMSO和IL-6的體積相等。

將4個(gè)組別收下來的細(xì)胞雜交甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和PD-L1抗體，蛋白質(zhì)印跡法(western blot)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果通過圖1上半圖可見，與DMSO對(duì)照組相比，加入5μmol/L阿可拉定的肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5中的PD-L1蛋白表達(dá)明顯降低；加入10ng/ml的IL-6的肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5中的PD-L1蛋白表達(dá)水平與只加DMSO對(duì)照比升高；在阿可拉定和IL-6共同存在的情況下，IL-6作用下表達(dá)升高的PD-L1也能被阿可拉定抑制。通過圖1下半圖可見，各組細(xì)胞中內(nèi)參蛋白GAPDH表達(dá)水平?jīng)]有改變。

實(shí)施例4

不同濃度阿可拉定分別作用肺癌H460細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后，PD-L1表達(dá)水平檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞培養(yǎng)：首先將密度為90％的生長(zhǎng)在有酚紅的含有體積濃度為10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)的H460肺癌細(xì)胞，分配到無酚紅體積濃度為2.5％的胎牛血清(CS-FBS)的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)24小時(shí)；細(xì)胞密度在30％左右時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行阿可拉定處理(DMSO體積終濃度1:1000)；

加入二甲基亞砜(DMSO)和阿可拉定：在培養(yǎng)體系中分別加入DMSO對(duì)照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、10μmol/L阿可拉定DMSO溶液和20μmol/L的阿可拉定DMSO溶液，分別收取作用12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后細(xì)胞；

收下來的細(xì)胞雜交甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和PD-L1抗體，蛋白質(zhì)印跡法(western blot)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果通過圖2上半圖可見，與DMSO對(duì)照組相比，在12小時(shí)結(jié)束后，加入10μmol/L和20μmol/L的阿可拉定的肺癌細(xì)胞H460中的PD-L1蛋白表達(dá)與DMSO對(duì)照組相比有一定下降趨勢(shì)；在24小時(shí)結(jié)束后，加入10μmol/L阿可拉定的肺癌細(xì)胞H460中的PD-L1蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組DMSO有一定下降趨勢(shì)，加入20μmol/L阿可拉定的肺癌細(xì)胞H460中的PD-L1蛋白表達(dá)降低量非常明顯；藥物處理48小時(shí)對(duì)PD-L1的抑制作用與藥物處理24小時(shí)結(jié)果類似。通過圖2下半圖可見，10μmol/L阿可拉定、20μmol/L阿可拉定對(duì)于細(xì)胞中GAPDH表達(dá)不產(chǎn)生任何改變。

實(shí)施例5

不同濃度阿可拉定對(duì)于人黑色素瘤細(xì)胞A375的PD-L1表達(dá)水平檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞培養(yǎng)：首先將密度為90％的生長(zhǎng)在有酚紅的含有體積濃度為10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)的A375黑色素瘤細(xì)胞，分配到無酚紅體積濃度為2.5％的胎牛血清(CS-FBS)的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)24小時(shí)；在30％左右時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行阿可拉定處理(DMSO體積終濃度1:1000)；

加入二甲基亞砜(DMSO)和阿可拉定：在培養(yǎng)體系中分別加入DMSO對(duì)照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、10μM濃度的阿可拉定DMSO溶液和20μM濃度的阿可拉定DMSO溶液，并使每個(gè)反應(yīng)體系中DMSO體積濃度的終值為0.1％。

藥物處理12小時(shí)后收細(xì)胞，收下來的細(xì)胞裂解液雜交甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和PD-L1抗體，蛋白質(zhì)印跡法(western blot)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果通過圖3上半圖可見，加入10μM阿可拉定12小時(shí)，黑色素瘤A375細(xì)胞的PD-L1蛋白表達(dá)有一定下降趨勢(shì)，加入20μM阿可拉定12小時(shí)，黑色素瘤A375細(xì)胞的PD-L1蛋白明顯下降。通過圖3下半圖可見，阿可拉定對(duì)于細(xì)胞中GAPDH表達(dá)不產(chǎn)生任何改變。

實(shí)施例6

在IL-6存在或不存在的條件下，式(III)化合物對(duì)肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的抑制。

實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞培養(yǎng)：首先將密度為90％的生長(zhǎng)在有酚紅的含有體積濃度為10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)的肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞，分配到無酚紅體積濃度為2.5％的胎牛血清(CS-FBS)的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)24小時(shí)；細(xì)胞密度在30％左右時(shí)對(duì)細(xì)胞加入式(III)化合物處理(DMSO在溶液中的體積中濃度為1:1000)；2小時(shí)后根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在有IL-6存在的組別中對(duì)細(xì)胞分別用IL-6(10ng/ml)處理，式(III)化合物(3μM)處理，等體積的式(III)化合物(3μM)與IL-6共同作用48小時(shí)收取細(xì)胞。

4個(gè)組別依次是在培養(yǎng)體系中只加入DMSO對(duì)照(即不含式(III)化合物的DMSO溶液)、加入3μmol/L式(III)化合物的DMSO溶液、加入10ng/ml的IL-6、加入3μmol/L式(III)化合物的DMSO溶液和10ng/ml的IL-6的混合溶液。

收下來的細(xì)胞雜交甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和PD-L1抗體，蛋白質(zhì)印跡法(western blot)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果通過圖4上半圖可見，加入式(III)化合物的肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5中的PD-L1表達(dá)水平與DMSO組相比明顯降低；加入IL-6的肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5中的PD-L1與DMSO對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)；加入IL-6和式(III)化合物混合溶液的肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5中的PD-L1表達(dá)水平與只加入IL-6組相比下降明顯。通過圖4下半圖可見，阿可拉定對(duì)于細(xì)胞中GAPDH不產(chǎn)生任何改變。

實(shí)施例7

不同濃度阿可拉定對(duì)于人黑色素瘤細(xì)胞A875的PD-L1表達(dá)水平檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞培養(yǎng)：首先將密度為90％的生長(zhǎng)在有酚紅的含有體積濃度為10％胎牛血清的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)的A875人黑色素瘤細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于100mm直徑的培養(yǎng)皿中，用含10％的胎牛血清的有酚紅的氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)，在37℃，5％CO₂的溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)；

加入二甲基亞砜(DMSO)和阿可拉定：在培養(yǎng)體系中分別加入DMSO對(duì)照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、5μM濃度的阿可拉定DMSO溶液、10μM濃度的阿可拉定DMSO溶液和20μM濃度的阿可拉定DMSO溶液，并使每個(gè)反應(yīng)體系中DMSO體積濃度的終值為0.1％。

藥物處理48小時(shí)后收細(xì)胞，收下來的細(xì)胞裂解液雜交甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和PD-L1抗體，蛋白質(zhì)印跡法(western blot)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果通過圖5上半圖可見，加入10μM阿可拉定48小時(shí)，黑色素瘤A875細(xì)胞的PD-L1蛋白表達(dá)有一定下降趨勢(shì)，加入20μM阿可拉定48小時(shí)，黑色素瘤A875細(xì)胞的PD-L1蛋白明顯下降。通過圖5下半圖可見，阿可拉定對(duì)于細(xì)胞中GAPDH表達(dá)不產(chǎn)生任何改變。

實(shí)施例8

不同濃度的阿可拉定對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞培養(yǎng)：首先將密度為90％以上的生長(zhǎng)在有酚紅的含有體積濃度為10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)的U266人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，分配至有酚紅，2.5％的胎牛血清1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。

加入二甲基亞砜(DMSO)和阿可拉定：在培養(yǎng)體系中分別加入DMSO對(duì)照(即不含有阿可拉定的DMSO溶液)、10μM濃度的阿可拉定DMSO溶液、20μM濃度的阿可拉定DMSO溶液和30μM濃度的阿可拉定DMSO溶液，并使每個(gè)反應(yīng)體系中DMSO體積濃度的終值為0.1％。

藥物處理48小時(shí)后收細(xì)胞，收下來的細(xì)胞裂解液雜交甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和PD-L1抗體，蛋白質(zhì)印跡法(western blot)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果通過圖6上半圖可見，加入10μM阿可拉定48小時(shí)，人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266的PD-L1蛋白表達(dá)有一定下降趨勢(shì)，分別加入20μM和30μM的阿可拉定48小時(shí)，人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266的PD-L1蛋白明顯下降。通過圖6下半圖可見，阿可拉定對(duì)于細(xì)胞中GAPDH表達(dá)不產(chǎn)生任何改變。

實(shí)施例9

阿可拉定對(duì)血液中PD-L1表達(dá)值的下調(diào)。

實(shí)驗(yàn)方法：

1.樣品的收集

采集受試者靜脈血5ml至無抗凝劑的采血管。室溫條件下，將血液靜置30分鐘，1000g離心15分鐘，收集血清，并進(jìn)行快速分析。

2.分析方法

實(shí)驗(yàn)前一天采用俘獲抗體包被ELISA平板，孵育過夜。

正式開始檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前將所有的試劑和樣品放置于室溫下平衡。

去除板中包被液，每孔加入400μL洗滌液，洗滌后在干凈的吸水紙上拍干充分去除殘留液體。重復(fù)洗滌四次。

向每個(gè)檢測(cè)孔加入100μL分析稀釋液，之后向?qū)?yīng)的實(shí)驗(yàn)孔分別加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品或者樣品。封板后將樣品置于水平軌道式(0.12”orbit)搖床，500轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)室溫震蕩培養(yǎng)2小時(shí)。

去除板中反應(yīng)液，洗滌平板四次。

向每個(gè)孔加入200μL的PD-1絡(luò)合物，封板后在搖床上室溫繼續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)。

抽吸、洗滌平板四次。

向每個(gè)孔加入200μL底物溶液，室溫條件下避光孵育30分鐘。

向每個(gè)孔加入50μL終止溶液，孔內(nèi)顏色由藍(lán)變黃，如顏色變化不均一則輕拍平板徹底混勻孔中液體。

30分鐘內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定每孔的吸光度，如果波長(zhǎng)校正是有效的，設(shè)為540nm或570nm。如果波長(zhǎng)校正不可用，從450nm波長(zhǎng)讀數(shù)減去540nm或570nm波長(zhǎng)讀數(shù)。這種方法可以校正板的光學(xué)缺陷。直接在450nm而無校正讀數(shù)可能會(huì)偏高或偏低。

3.計(jì)算結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對(duì)照品以及樣品的OD值減去空白孔的OD值，取兩個(gè)復(fù)孔的均值。以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的Log值為縱坐標(biāo)，濃度的log值為橫坐標(biāo)，通過能夠產(chǎn)生4參數(shù)擬合曲線的計(jì)算機(jī)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取樣品所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中PD-L1的實(shí)際濃度。

結(jié)論：

見圖7，病人服用阿可拉定后，PR與SD病人血液中的PD-L1出現(xiàn)降低或維持相對(duì)穩(wěn)定(病例A04、A08-1、A07、00502、0121)，但PD病人血液中的PD-L1則出現(xiàn)顯著升高(病例0212、0411、00501、0108、A05、A06)，提示藥物可能通過調(diào)節(jié)PD-L1信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。