本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及枸櫞酸乙胺嗪的新用途，具體涉及枸櫞酸乙胺嗪的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

枸櫞酸乙胺嗪為一種驅(qū)蟲藥，對絲蟲成蟲(除盤尾絲蟲外)及微絲蚴均有殺滅作用，對易感微絲蚴有兩種作用一為抑制肌肉活動，使蟲體固定不動，此可能為本藥哌嗪部分的過度極化作用，促進(jìn)蟲體由其寄居處脫開所致；二為改變微絲蚴體表膜，使之更易遭受宿主防御功能的攻擊和破壞。

迄今為止，尚未見枸櫞酸乙胺嗪及其藥物組合物與糖尿病合并牙周炎的相關(guān)性報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種枸櫞酸乙胺嗪的藥物組合物，該藥物組合物中含有枸櫞酸乙胺嗪和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，枸櫞酸乙胺嗪和該天然產(chǎn)物可協(xié)同治療糖尿病合并牙周炎。

本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)，

一種枸櫞酸乙胺嗪的藥物組合物，包括枸櫞酸乙胺嗪、如權(quán)利要求1所述的化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。

進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。

進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。

上述化合物(Ⅰ)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將龍膽粉碎，用85～95％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用8％乙醇洗脫10個柱體積，再用70％乙醇洗脫12個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)。

進(jìn)一步地，化合物(Ⅰ)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。

上述化合物(Ⅰ)在制備治療糖尿病合并牙周炎的藥物中的應(yīng)用。

上述枸櫞酸乙胺嗪的藥物組合物在制備治療糖尿病合并牙周炎的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的枸櫞酸乙胺嗪的藥物組合物中含有枸櫞酸乙胺嗪和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，枸櫞酸乙胺嗪、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時，對糖尿病合并牙周炎具有治療作用；枸櫞酸乙胺嗪和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，對糖尿病合并牙周炎的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療糖尿病合并牙周炎的藥物。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證

試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。

分離方法：(a)將龍膽(2kg)粉碎，用90％乙醇熱回流提取(20L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水飽和的正丁醇(4L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用8％乙醇洗脫10個柱體積，再用70％乙醇洗脫12個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1(8個柱體積)、20:1(8個柱體積)、10:1(8個柱體積)和5:1(10個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1(8個柱體積)、5:1(10個柱體積)和2:1(5個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(純度大于98％)。

結(jié)構(gòu)確證：無定型固體，HR-ESI-MS顯示[M+H]⁺為m/z 303.1559，結(jié)合核磁特征可得分子式為C₁₈H₂₂O₄，不飽和度為8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ_H(ppm，CDCl₃，500MHz)：H-1(5.64，d，J＝9.3Hz)，H-2(5.41，dd，J＝9.3，2.8Hz)，H-3(5.86，m)，H-6(6.03，d，J＝4.4Hz)，H-7(2.71，ddd，J＝4.4，13.1，4.6Hz)，H-8α(1.74，m)，H-8β(1.82，ddt，J＝13.5，4.2，13.2Hz)，H-9α(1.45，dt，J＝3.2，13.2Hz)，H-9β(1.59，ddd，J＝13.2，4.2，2.7Hz)，H-13(6.29，d，J＝3.3Hz)，H-13(5.76，d，J＝3.3Hz)，H-14(0.92，s)，H-15(5.17，s)，H-15(4.97，s)，3-OAc(2.12，s)，12-OMe(3.77，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ_C(ppm，CDCl₃，125MHz)：142.5(CH，1-C)，123.4(CH，2-C)，79.2(CH，3-C)，152.1(C，4-C)，143.2(C，5-C)，123.7(CH，6-C)，41.4(CH，7-C)，25.8(CH₂，8-C)，35.2(CH₂，9-C)，42.7(C，10-C)，144.6(C，11-C)，167.3(C，12-C)，124.9(CH₂，13-C)，20.3(CH₃，14-C)，105.6(CH₂，15-C)，171.5(C，3-OAc)，21.7(CH₃，3-OAc)，52.4(CH₃，12-OMe)。¹³C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有18個碳信號，包括三個甲基(一個甲氧基和一個乙酰甲基)，四個亞甲基(兩個烯烴碳)，五個次甲基(一個連氧碳和三個烯烴碳)，以及六個季碳(三個烯烴碳和兩個羰基碳)。以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為兩環(huán)結(jié)構(gòu)。¹H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示三個甲基質(zhì)子信號δ_H 0.92(3H，s)、2.12(3H，s)與3.77(3H，s)，兩對端烯烴質(zhì)子信號δ_H 6.29(1H，d，J＝3.3Hz)與5.76(1H，d，J＝3.3Hz)，5.17(1H，s)與4.97(1H，s)，一個連氧次甲基質(zhì)子信號δ_H 5.86(1H，m)，三個烯烴次甲基質(zhì)子信號δ_H 5.64(1H，d，J＝9.3Hz)，5.41(1H，dd，J＝9.3，2.8Hz)和6.03(1H，d，J＝4.4Hz)。NMR譜數(shù)據(jù)δ_H3.77(3H，s)與δ_C 52.4可知該化合物中存在甲氧基，HMBC譜中OMe與C-12的相關(guān)信號表明了甲氧基連接在C-12位。此外，NMR譜數(shù)據(jù)δ_H 2.12(3H，s)與δ_C 171.5、21.7可知該化合物中存在乙酰基，HMBC譜中OAc與C-3的相關(guān)信號表明了乙?；B接在C-3位。通過¹H-¹H COSY譜中H-1/H-2/H-3與H-6/H-7/H-8/H-9相關(guān)信號，以及HMBC譜中顯示的H-1與C-2、C-3和C-10，H-2與C-1和C-3，H-3與C-1、C-2、C-4和C-5，H-6與C-5、C-7、C-8和C-11，H-7與C-6、C-11、C-12和C-13，H-13與C-7、C-11和C-12，H-14與C-10相關(guān)信號，可以構(gòu)建該化合物的連接方式，并且上述波譜數(shù)據(jù)表明該化合物為桉葉烷型倍半萜。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：

實(shí)施例2：藥理作用

本實(shí)施例使用腹腔注射鏈脲佐菌素，并以直徑0.20mm的絲線結(jié)扎大鼠雙側(cè)上頜第二磨牙頸部制備治療糖尿病合并牙周炎大鼠模型，觀察藥物降低牙齒松動度，提高大鼠外周血白細(xì)胞介素-2(IL-2)含量、降低白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等方面的抗糖尿病合并牙周炎作用。

1、材料與方法

1.1動物

選用10月齡SD大鼠，體重(400±50)g，雌雄各半，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施條件：成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院動物觀察室。

1.2試劑與樣品

枸櫞酸乙胺嗪購自中國藥品生物制品檢定所?；衔?Ⅰ)自制，制備方法見實(shí)施例1。

1.3大鼠分組及模型制備

大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為正常對照組、模型對照組、枸櫞酸乙胺嗪組(180mg·kg^-1)、化合物(Ⅰ)組(180mg·kg^-1)、枸櫞酸乙胺嗪與化合物(Ⅰ)組合物組【90mg·kg^-1枸櫞酸乙胺嗪+90mg·kg^-1化合物(Ⅰ)】。各組大鼠均以軟食飼養(yǎng)，按60mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素溶液，72h后測空腹血糖，高于16.7mmol/L為糖尿病模型建立成功。糖尿病模型建立成功1周后，開始建立糖尿病合并牙周炎模型，除正常對照組外，其余組大鼠均用2％戊巴比妥鈉30mg/kg全麻下，以直徑0.20mm的絲線結(jié)扎大鼠雙側(cè)上頜第二磨牙頸部，制造牙周炎動物模型。正常對照組不造模，各給藥組造模后開始藥物干預(yù)，按照上述劑量連續(xù)灌胃給藥7d，正常對照組與模型對照組大鼠灌胃給予純化水。給藥結(jié)束后，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4牙齒松動度測定實(shí)驗(yàn)

每只大鼠造模各2顆牙齒，頰舌向松動者計1分，頰舌向、近中遠(yuǎn)中向均松動者計2分；頰舌向、近中遠(yuǎn)中向和垂直向均松動者計3分。

1.5IL-2、IL-1β測定實(shí)驗(yàn)

5％水合氯醛全麻各大鼠，將全部大鼠經(jīng)腹主動脈取血5ml(加肝素鈉抗凝)，1000r/min離心10min，吸取上清液0.5ml，裝管標(biāo)記后，用IL-2、IL-1β試劑盒測定其濃度。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1對糖尿病合并牙周炎模型大鼠牙齒松動度的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠牙齒松動度評分明顯增加(P＜0.01)；與模型對照組比較，枸櫞酸乙胺嗪與化合物(Ⅰ)組合物組大鼠牙齒松動度評分明顯減小(P＜0.01)；與模型對照組比較，枸櫞酸乙胺嗪組、化合物(Ⅰ)組牙齒松動度評分減小(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

2.2對糖尿病合并牙周炎模型大鼠外周血中IL-2、IL-1β含量的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠的IL-2明顯降低(P＜0.01)，、IL-1β含量明顯升高(P＜0.01)。與模型對照組比較，枸櫞酸乙胺嗪與化合物(Ⅰ)組合物組IL-2明顯升高(P＜0.01)，IL-1β含量明顯降低(P＜0.01)；與模型對照組比較，枸櫞酸乙胺嗪組、化合物(Ⅰ)組IL-2升高(P＜0.05)，IL-1β含量降低(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1對糖尿病合并牙周炎模型大鼠牙齒松動度和外周血中IL-2、IL-1β含量的影響

早在1928年，William等通過研究認(rèn)為，糖尿病患者與非糖尿病患者的牙周炎具有不同特征，因此提出了“糖尿病性牙周炎”的概念。糖尿病患者因牙周組織中糖分解代謝、蛋白質(zhì)和脂肪合成代謝減弱，對局部致病因子敏感性增高，且多合并微循環(huán)障礙，導(dǎo)致牙周組織細(xì)菌繁殖加速，牙周炎已經(jīng)成為糖尿病繼神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、血管病變、腎病及傷口愈合不良之后的第六并發(fā)癥。

近年來，眾多研究顯示牙周炎的發(fā)病過程與細(xì)胞因子的分泌異常導(dǎo)致促炎/抑炎平衡失調(diào)有密切關(guān)系，多表現(xiàn)為Th1細(xì)胞功能相對亢進(jìn)，Th2細(xì)胞功能不足。IL-2、IL-1β等是細(xì)胞免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵因子，IL-2是引起T細(xì)胞增殖的主要細(xì)胞因子，能促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，抑制T細(xì)胞的凋亡、刺激NK細(xì)胞的生長和增強(qiáng)其殺傷功能、激發(fā)B細(xì)胞生長及抗體產(chǎn)生，已經(jīng)有部分學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證明其與牙周炎免疫狀態(tài)有關(guān)；IL-1β則在牙周炎的骨破壞過程中還發(fā)揮著重要作用，IL-1β可促進(jìn)骨吸收，且其水平與牙周附著喪失顯著相關(guān)。

上述結(jié)果表明，枸櫞酸乙胺嗪、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時，對糖尿病合并牙周炎具有治療作用；枸櫞酸乙胺嗪和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，對糖尿病合并牙周炎的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療糖尿病合并牙周炎的藥物。

上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。