本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體是連翹酯苷B與金石蠶苷配伍組合物及其應用。

背景技術：

出血是指血液從血管或心臟外出至組織間隙、體腔或身體表面。出血可以導致出血性休克、貧血，紫癜，也能夠引起局部組織破壞和功能障礙，如大腦內(nèi)囊出血可以引起對側(cè)肢體偏癱，視網(wǎng)膜出血引起失明。出血原因復雜，可造成陰血虧虛，機體衰弱，其涉及內(nèi)科和外科。對于內(nèi)科或外科的出血病癥，如不及時有效地控制出血現(xiàn)象，嚴重者可危及生命。目前臨床上應用止血藥存在較為嚴重的副作用：如血凝酶大劑量時引起纖維蛋白原降低，血液粘滯度下降以及靜脈血栓形成；氨甲環(huán)酸則導致血栓形成，因而禁用于尿道手術；抑肽酶則明顯增高過敏反應的發(fā)生率以及增加腎功能衰竭、心肌梗死、心臟衰竭、中風風險及死亡率，限制了它們在臨床上的廣泛應用。因此，利用毒副作用小的天然活性物質(zhì)治療各種出血癥的研究越來越受到重視。

廣東紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun)為馬鞭草科(Verbenaceae)紫珠屬(Callicarpa L.)植物，具有收斂止血，散瘀，清熱解毒之功效。用于衄血，咯血，吐血，便血，崩漏，外傷出血等，為民間臨床婦科及各科出血癥的常用藥物。發(fā)明人從臨床治療各種出血癥療效確切的廣東紫珠藥材出發(fā)，篩選出廣東紫珠總苯乙醇苷具有止血作用，化學研究表明，廣東紫珠總苯乙醇苷中化學成分復雜，主要含有連翹酯苷B和金石蠶苷。然而，單方連翹酯苷B、金石蠶苷對小鼠出血和凝血時間作用不明顯。因此，發(fā)明人在前期研究基礎上，以小鼠出血和凝血時間為指標，選擇連翹酯苷B與金石蠶苷兩個有效成分進行新配伍組合，發(fā)現(xiàn)連翹酯苷B與金石蠶苷配伍能明顯縮短小鼠的出血時間和凝血時間，具有顯著止血作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了治療出血癥的一種連翹酯苷B與金石蠶苷配伍的藥物組合物。

連翹酯苷B與金石蠶苷配伍的藥物組合物，連翹酯苷B與金石蠶苷重量份之比為1~5:1~5。

連翹酯苷B與金石蠶苷配伍的藥物組合物可直接藥用，或添加合適的輔料制成片劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑、注射劑等各種劑型進行使用。

本發(fā)明通過連翹酯苷B配伍金石蠶苷對小鼠出血和凝血時間進行研究，發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同增效作用(單用連翹酯苷B、金石蠶苷止血作用不明顯)。

本發(fā)明確證了連翹酯苷B與金石蠶苷配伍藥物止血作用是通過增加血小板數(shù)量，減少出血時間，達到止血的目的。

本發(fā)明中的原料連翹酯苷B和金石蠶苷按照下述方法制備：取廣東紫珠藥干燥莖枝和葉粗粉，以水浸潤，8~12倍量溶劑回流熱提取2~4次，每次1~3小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度為1.10~1.25，依次用等體積的乙酸乙酯、水飽和正丁醇分別萃取三次，收集正丁醇提取液，減壓濃縮至干。正丁醇提取浸膏水溶后上D101大孔樹脂柱，分別采用水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇洗脫，收集30%乙醇部分，減壓濃縮至干，加入等量反相硅膠拌樣，經(jīng)中壓制備液相色譜柱，以乙腈-水(85:15)等度洗脫，每500mL為一餾分，收集相應餾分，合并，減壓濃縮，餾分13~22得到連翹酯苷B，餾分36~45得到金石蠶苷，得率分別為1%~2%和0.5%~1%，純度均為92%~95%。

本發(fā)明的制備工藝方法為：以上兩味，混合，加輔料適量，混勻，制成臨床上可接受的口服制劑和注射劑。

本發(fā)明藥物的片劑的制備方法是：取以上兩味，加淀粉、羧甲基纖維素，制粒，壓片，得到片劑；

本發(fā)明藥物的膠囊劑的制備方法是：取以上兩味，加淀粉、羧甲基纖維素，制粒，灌裝，得到膠囊劑。

本發(fā)明的藥物注射液的制備方法是：取以上兩味，加水溶解、用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至6.0~8.0，過濾，濾液滅菌后灌封在安剖瓶中，滅菌，得到注射液。

附圖說明

圖1為連翹酯苷B、金石蠶苷單方及連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)給藥對小鼠出血時間的影響圖；

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；

1. 空白對照組 2. 陽性藥組(云南白藥) 3. 連翹酯苷B低劑量組4. 連翹酯苷B中劑量組5. 連翹酯苷B高劑量組 6. 金石蠶苷低劑量組 7. 金石蠶苷中劑量組 8.金石蠶苷高劑量組9. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)低劑量組 10. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)中劑量組 11. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)高劑量組 12. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(2:1)低劑量組 13. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(2:1)中劑量組 14. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(2:1)高劑量組。

圖2為連翹酯苷B、金石蠶苷單方及連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)給藥對小鼠凝血時間的影響圖。

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；

1. 空白對照組 2. 陽性藥組(云南白藥) 3. 連翹酯苷B低劑量組4. 連翹酯苷B中劑量組5. 連翹酯苷B高劑量組 6. 金石蠶苷低劑量組 7. 金石蠶苷中劑量組 8.金石蠶苷高劑量組9. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)低劑量組 10. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)中劑量組 11. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)高劑量組 12. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(2:1)低劑量組 13. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(2:1)中劑量組 14. 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(2:1)高劑量組。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步闡述。必須說明下述實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

實施例1：連翹酯苷B、金石蠶苷單方給藥及連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)給藥對小鼠出血時間的影響

動物：km小鼠140只，雄性，體重20±2g，來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(湘)2011-0003。

試藥：藥物翹酯苷B和金石蠶苷為自制，含量均98%以上；云南白藥(云南白藥集團股份有限公司，批號：ZLA1425)；羧甲基纖維素鈉(J&K scientific LTD，批號：L460M09)；水為純化水。

試驗方法：將小鼠固定，露尾于外，用手術刀片切割左側(cè)尾靜脈1/2處(嚴格控制切割深度深3mm寬2mm)，待血液自行溢出開始用秒表計時，每隔30s用濾紙吸去血滴一次，直至血流自然停止(濾紙吸時無血)為止，即為出血時間。

小鼠隨機分為8組，每組10只，雄性。分別為空白對照組(0.5% CMC-Na)、連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)低、中、高劑量組和陽性對照組(云南白藥)。各組連續(xù)灌胃給藥3天，末次給藥1h后測小鼠的出血時間。各組試驗數(shù)據(jù)見表1和圖1。

試驗結果：跟空白對照組相比，陽性藥組(云南白藥)的出血時間明顯縮短(P＜0.01＝；連翹酯苷B、金石蠶苷單方給藥低、中、高劑量組小鼠出血時間的影響來看，作用不明顯(P＞0.05)。連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥中、高劑量組的出血時間明顯縮短(P＜0.01)；連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(2:1)給藥低、中劑量組的出血時間明顯縮短(P＜0.01)；連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(2:1)給藥高劑量組的出血時間明顯縮短(P＜0.05)；

表1連翹酯苷B、金石蠶苷單方給藥及連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)給藥對小鼠出血時間的影響(n = 10)

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；

實施例2：連翹酯苷B、金石蠶苷單方給藥及連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)給藥對小鼠凝血時間的影響：

動物：km小鼠140只，雄性，體重20±2g，來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(湘)2011-0003。

試藥：藥物翹酯苷B和金石蠶苷為自制，含量均98%以上；云南白藥(云南白藥集團股份有限公司，批號：ZLA1425)；羧甲基纖維素鈉(J&K scientific LTD，批號：L460M09)；水為純化水。

試驗方法：將小鼠固定，用內(nèi)徑為1mm的毛細管插入小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢取血，達5cm血柱，平放桌面。每隔30s折斷毛細管一小截，檢查有無凝血出現(xiàn)。記錄從毛細管采血到出現(xiàn)血凝絲的時間，即為凝血時間。

小鼠隨機分為8組，每組10只，雄性。分別為空白對照組(0.5% CMC-Na)、連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)低、中、高劑量組和陽性對照組(云南白藥)。各組連續(xù)灌胃給藥3天，末次給藥1h后測小鼠的凝血時間。各組試驗數(shù)據(jù)見表2和圖2。

試驗結果：跟空白對照組相比，陽性藥組(云南白藥)的出血時間明顯縮短(P＜0.01)；連翹酯苷B、金石蠶苷單方給藥低、中、高劑量組小鼠凝血時間的影響來看，作用不明顯(P＞.05)；連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥低、中、高劑量組的凝血時間明顯縮短(P＜0.01)；連翹酯苷B與金石蠶苷(2:1)配伍給藥低、中劑量組的凝血時間明顯縮短(P＜0.01)。表明連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)有明顯縮短出血時間和凝血時間。

表2連翹酯苷B、金石蠶苷單方給藥及連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1；2:1)給藥對小鼠凝血時間的影響(n = 10)

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；

實施例3：連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥對大鼠凝血四項及血小板計數(shù)的影響：

動物：SD大鼠50只，雄性，體重200~220g，來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(湘)2013-0004。

試藥：藥物翹酯苷B和金石蠶苷為自制，含量均98%以上；云南白藥(云南白藥集團股份有限公司，批號：ZLA1425)；羧甲基纖維素鈉(J&K scientific LTD，批號：L460M09)；水為純化水。

儀器：高速冷凍離心機(ST16R，Thermo Fisher 公司，德國)；全自動凝血分析儀(ACL 7000，Instrumentation Laboratory .Co，美國)；全自動五分類血液分析儀(TEK8510，江西特康科技有限公司)

試驗方法：SD大鼠50只，雄性，隨機分為5組。分別為空白對照組(0.5% CMC-Na)、連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)低(6mg/kg)、中(12mg/kg)、高劑量(24mg/kg)組和陽性對照組(云南白藥，0.33g/kg)。各組每日分別灌胃給藥，連續(xù)給藥10天，末次給藥1h后，用3%戊巴比妥將大鼠麻醉，打開大鼠腹腔，暴露腹主動脈，用一次性頭皮針接于3.8%枸櫞酸鈉抗凝真空采血管及EDTA抗凝真空采血管腹主動脈取血，輕輕混勻。置于3.8%枸櫞酸鈉抗凝真空采血管中的全血，4℃ 3000rpm離心10分鐘，取上清液，采用ACL7000全自動凝血分析儀測凝血四項指標；置于EDTA抗凝真空采血管中的全血，采用全自動血細胞分析儀觀察血小板的變化。結果見表3和4。

試驗結果：跟空白對照組相比，連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)各劑量組APTT、PT時間明顯縮短(P＜0.01)，其中低劑量組(P＜0.05)；其可能是通過增加血小板數(shù)量，減少出血時間，達到止血的目的。

表3 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥對大鼠凝血四項指標的影響(n= 10,)

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；

表4 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥對大鼠血小板計數(shù)的影響(n= 10,)

注：與空白對照組比較**P＜0.01；

實施例4：連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥ELISA法檢測TAT、P-選擇素、TXB2、6-K-PG對血小板的影響：

動物：SD大鼠50只，雄性，體重200~220g，來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(湘)2013-0004。

試藥：藥物連翹酯苷B和金石蠶苷為自制，含量均98%以上；云南白藥(云南白藥集團股份有限公司，批號：ZLA1425)；羧甲基纖維素鈉(J&K scientific LTD，批號：L460M09)；水為純化水。

儀器：高速冷凍離心機(ST16R，Thermo Fisher 公司，德國)；全自動凝血分析儀(ACL 7000，Instrumentation Laboratory .Co，美國)；全自動五分類血液分析儀(TEK8510，江西特康科技有限公司)

試驗方法：大鼠隨機分為5組，每組10只，雄性。分別為空白對照組(0.5% CMC-Na)、連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)低(6mg/kg)、中(12mg/kg)、高劑量(24mg/kg)組和陽性對照組(云南白藥，0.33g/kg)。各組每日分別灌胃給藥，連續(xù)給藥10天，末次給藥1h后，用3%戊巴比妥將大鼠麻醉，打開大鼠腹腔，暴露腹主動脈，用一次性頭皮針接于3.8%枸櫞酸鈉抗凝真空采血管及EDTA抗凝真空采血管腹主動脈取血，輕輕混勻。分別用 EDTA 、3.8%枸櫞酸鈉(枸櫞酸鈉:血液 = 1：9)作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000 g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃ 或-80℃保存，但應避免反復凍融。采用ELISA法檢測定血小板中TAT、P-選擇素、TXB2、6-K-PG含量。結果見表5~8。

試驗結果：連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)對血小板中凝血酶/抗凝血酶復合物、6-keto-PGFIa均無影響，無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)，而對于TXB2、P-selectin的含量均有影響，有顯著性差異(P < 0.01)。上述結果提示，連翹酯苷B和金石蠶苷配伍(1:1)的止血作用可能與其血小板活性有關。

表5 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥對大鼠血漿中TAT含量的影響(n = 10,)

表6 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥對大鼠血漿中P-選擇素含量的影響(n = 10,)

表7 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥對大鼠血漿中TXB2含量的影響(n=10,)

表8 連翹酯苷B與金石蠶苷配伍(1:1)給藥對大鼠血漿中6-K-PG含量的影響(n=10,)

實施例5：

取連翹酯苷B 1g，金石蠶苷1g，以注射用水加熱攪拌以充分溶解，再加水至1000ml，調(diào)節(jié)pH值至7，攪勻，過濾分裝于中性玻璃容器中，用流通蒸汽100℃30min滅菌，過濾，精濾，灌封，滅菌，檢驗，得注射液。

實施例6：

取連翹酯苷B 2g，金石蠶苷1.5g，加入淀粉、微晶纖維素、滑石粉、5%淀粉漿適量，混勻，制成顆粒，干燥，裝入膠囊，質(zhì)檢包裝即得。

實施例7：

取連翹酯苷B 1.2g，金石蠶苷2g，加入淀粉、微晶纖維素、滑石粉、5%淀粉漿適量，混勻，制成顆粒，干燥，壓片，質(zhì)檢包裝即得。