本發(fā)明涉及疫苗生產(chǎn)制備領(lǐng)域，尤其涉及聯(lián)合疫苗，具體是指一種肺炎球菌-百白破聯(lián)合疫苗。
背景技術(shù)：
：肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)簡稱肺炎球菌(Pneumococcus)，寄居于正常人的鼻咽腔中，是細(xì)菌性大葉性肺炎、腦膜炎、中耳炎、肺炎、支氣管炎的主要病原菌。肺炎球菌導(dǎo)致的疾病一直是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，在全世界范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率和病死率，尤其是對2歲以下的兒童和老人。目前已上市的肺炎球菌莢膜糖疫苗和莢膜糖蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗，其設(shè)計都基于肺炎球菌莢膜糖，涵蓋了導(dǎo)致肺炎球菌性疾病的最常見血清型。但肺炎球菌莢膜糖為胸腺非依賴性抗原(Thymusindependentantigen，TI-Ag)，抗體反應(yīng)主要依賴于其重復(fù)單位組成的線性表位，在無T淋巴細(xì)胞輔助的情況下直接與B淋巴細(xì)胞表面的IgM受體交聯(lián)，所誘導(dǎo)的抗體主要為IgM和IgG2，缺少較好的補體活化能力，抗體水平不能維持足夠長的時間，且不能誘導(dǎo)免疫記憶，無法在2歲以下幼兒中產(chǎn)生免疫保護。莢膜糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致每一個血清型的免疫原性不同，無法產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。肺炎球菌結(jié)合疫苗包括血清型別多，各型別用于結(jié)合的特異性結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其每個型別的結(jié)合方法相異。對莢膜糖的修飾及與載體蛋白的結(jié)合要在保證莢膜糖特異基團不丟失、抗原性和免疫原性不受影響的前提下進行，同時為了避免糖鏈的過度交聯(lián)和結(jié)合物除菌過濾的要求，對莢膜糖及結(jié)合物分子的大小應(yīng)當(dāng)有一定控制。7價疫苗于2000年2月在美國獲準(zhǔn)使用。由于肺炎球菌型別多，在結(jié)合疫苗的制作過程需要結(jié)合蛋白成分，因蛋白成分可以引起局部反應(yīng)，所以生產(chǎn)包含12個型別以上的結(jié)合疫苗就很困難。結(jié)合疫苗在初次免疫后活的抗體濃度僅能維持幾個月，隨后就會下降到免疫前水平；并且結(jié)合疫苗的整個工藝過程中需要加入多種化學(xué)試劑參與反應(yīng)，并且莢膜糖蛋白結(jié)合疫苗的血清型覆蓋率低和非疫苗血清型肺炎球菌感染性疾病的增加使得更多研究者開始關(guān)注其他方向的肺炎球菌疫苗開發(fā)。百白破疫苗是我國現(xiàn)行的免疫規(guī)劃程序規(guī)定的針次最多、使用最廣泛的疫苗，包括無細(xì)胞百白破及全細(xì)胞百白破兩種聯(lián)合疫苗，近年來無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗由于其良好的免疫原性和安全性取代了全細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗而廣泛用于兒童的預(yù)防接種，已被納入許多國家的常規(guī)免疫計劃中。但百白破疫苗由于其疫苗本身的性質(zhì)導(dǎo)致其具有多種副作用，難以與其他疫苗進一步聯(lián)合使用。賽諾菲巴斯德公司生產(chǎn)的五聯(lián)疫苗一度成為免疫學(xué)歷史上的新高度，其中包括百白破疫苗及脊髓灰質(zhì)炎病毒及b型流感嗜血桿菌莢膜糖。肺炎球菌蛋白疫苗已成為近十年來肺炎疫苗的研發(fā)主流，具有種屬特異性抗原為基礎(chǔ)的疫苗廣受研發(fā)人員的重視，吸引了大量的目光。但由于蛋白本身的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的限制，很多肺炎球菌蛋白無法直接用于人體免疫，需要花費大量的人力和物力進行研究及臨床驗證。蛋白疫苗利用生物工程技術(shù)合成蛋白抗原，蛋白抗原由于其選用的均為高度保守的肺炎球菌特異性蛋白，從而消除了不同血清型之間的免疫差異，并且由于不需要其他類型的通用蛋白載體，消除了現(xiàn)有的肺炎球菌疫苗不能與通用載體蛋白同類型的疫苗同時聯(lián)合使用的障礙；其蛋白抗原本身也可以作為載體蛋白與肺炎球菌莢膜糖進行自發(fā)性綴合，因此免疫效果更好，實現(xiàn)了特異性免疫與廣泛免疫的聯(lián)合實現(xiàn)。肺炎球菌由于其血清型多，導(dǎo)致其抗原本身的抗原結(jié)構(gòu)大穩(wěn)定性差，難以與其他疫苗聯(lián)合共存使用，并且現(xiàn)有的肺炎球菌莢膜糖蛋白結(jié)合疫苗均用白喉或破傷風(fēng)類毒素作為蛋白載體，這種疫苗的主要成分為血清型特異性的莢膜糖，對未包含在疫苗內(nèi)的其他血清型肺炎球菌感染無效，即缺乏交叉免疫保護效果；并將與已在兒童常規(guī)免疫接種中使用的白喉及破傷風(fēng)疫苗產(chǎn)生干擾，破壞現(xiàn)有的免疫效果。故不以肺炎球菌自身的蛋白抗原作為蛋白載體，肺炎球菌與破傷風(fēng)疫苗基本上不可能聯(lián)合使用，而這四種抗原所引起的疾病類型有很多的重疊并且在很多情況下會相互影響，在接種一種疫苗并間隔很長一段時間后才可以接種第二種疫苗會制約疾病的免疫效果，延誤病情或錯過最佳治療時機。因此研究一款自身免疫原性夠好能夠穩(wěn)定存在并能與百白破疫苗聯(lián)合起效的肺炎球菌-百白破聯(lián)合疫苗成為了疫苗研發(fā)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供了一種能夠?qū)崿F(xiàn)四種疾病同時預(yù)防的肺炎球菌-百白破聯(lián)合疫苗。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的肺炎球菌-百白破聯(lián)合疫苗，包括肺炎球菌疫苗和百白破疫苗，具體為：a.肺炎球菌疫苗為肺炎球菌莢膜糖PS與肺炎球菌蛋白結(jié)合物；b.百白破疫苗包括無細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類疫苗和破傷風(fēng)類疫苗；其中：肺炎球菌蛋白為肺炎球菌表達的高保守性并具有免疫原性的蛋白，與具有免疫原性的肺炎球菌莢膜糖自發(fā)綴合；無細(xì)胞百日咳疫苗為百日咳疫苗原液、白喉類疫苗為白喉類毒素和破傷風(fēng)類疫苗為破傷風(fēng)類毒素，且百白破疫苗為懸混液。肺炎球菌莢膜糖的血清型中包括：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和/或33F；更優(yōu)選地肺炎球菌莢膜糖的血清型中包括：4、6B、9V、14、18C、19F和23F。肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白的每種血清型與蛋白之間的質(zhì)量比為1.5～4.5:1，優(yōu)選地質(zhì)量比為2:1。肺炎球菌蛋白包括：肺炎球菌溶血蛋白及其改性衍生物，優(yōu)選地為肺炎球菌溶血蛋白Ply、改性肺炎球菌溶血蛋白ΔA146Ply、肺炎球菌溶血蛋白衍生物PlyD1、肺炎球菌溶血蛋白衍生物PlyDB、肺炎球菌溶血蛋白衍生物PlyDT；肺炎球菌表面蛋白及其改性衍生物，優(yōu)選地為肺炎球菌表面蛋白C；肺炎球具表面黏附蛋白及其改性衍生物，優(yōu)選地為肺炎球菌表面黏附蛋白A、肺炎球菌表面黏附蛋白C；肺炎球菌三組氨酸蛋白家族及其改性衍生物，優(yōu)選地為肺炎球菌三組氨酸蛋白D和/或肺炎球菌黏附毒力因子，優(yōu)選地為肺炎球菌黏附毒力因子A。肺炎球菌-百白破聯(lián)合疫苗還包括蔗糖，用于作為肺炎球菌疫苗的凍干制劑的凍干保護劑。優(yōu)選地，蔗糖的初始濃度不小于60％，優(yōu)選為大于70％。優(yōu)選地，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量為不大于20％；較佳地，為4～20％；作為一種較佳的實施方式，根據(jù)所需制備的疫苗的不同為7～10％、8～10％、10～15％或12～15％；最佳為7％、8％、10％或12％。優(yōu)選地，蔗糖選用工業(yè)級分析純或藥用級。作為一種優(yōu)選的實施方式，肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白的結(jié)合物包括：血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F與蛋白ΔA146Ply結(jié)合物。優(yōu)選地，肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白的結(jié)合物為凍干制劑，凍干保護劑為蔗糖。優(yōu)選地，肺炎球菌多疫苗的血清抗體水平≥0.35μg/mL。優(yōu)選地，無細(xì)胞百日咳疫苗效價≥4.0IU；白喉疫苗效價≥30IU；破傷風(fēng)疫苗效價≥40IU。優(yōu)選地，聯(lián)合疫苗在臨用前將百白破懸混液加入肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白結(jié)合物凍干制劑中，將肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白結(jié)合體復(fù)溶，混合均勻后肌肉注射。作為一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗為：包括由肺炎球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C、19F及23F與肺炎球菌蛋白ΔA146Ply結(jié)合物組成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括無細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類疫苗和破傷風(fēng)類疫苗，優(yōu)選的肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白結(jié)合物采用單一組分的蔗糖作為凍干劑型的凍干保護劑，使用時百白破疫苗作為肺炎球菌疫苗的復(fù)溶劑。作為另一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗為：包括由肺炎球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C、19F及23F與肺炎球菌蛋白PsaA結(jié)合物組成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括無細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類疫苗和破傷風(fēng)類疫苗，優(yōu)選的肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白結(jié)合物采用單一組分的蔗糖作為凍干劑型的凍干保護劑，使用時百白破疫苗作為肺炎球菌疫苗的復(fù)溶劑。本申請的另一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗為：包括由肺炎球菌莢膜糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F與肺炎球菌蛋白ΔA146Ply結(jié)合物組成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括無細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類疫苗和破傷風(fēng)類疫苗，優(yōu)選的肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白結(jié)合物采用單一組分的蔗糖作為凍干劑型的凍干保護劑，使用時百白破疫苗作為肺炎球菌疫苗的復(fù)溶劑。本申請的另一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗為：包括由肺炎球菌莢膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F與肺炎球菌蛋白PlyDT結(jié)合物組成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括無細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類疫苗和破傷風(fēng)類疫苗，優(yōu)選的肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白結(jié)合物采用單一組分的蔗糖作為凍干劑型的凍干保護劑，使用時百白破疫苗作為肺炎球菌疫苗的復(fù)溶劑。本申請的另一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗為：包括由肺炎球菌莢膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F與肺炎球菌蛋白ΔA146Ply結(jié)合物組成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括無細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類疫苗和破傷風(fēng)類疫苗，優(yōu)選的肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白結(jié)合物采用單一組分的蔗糖作為凍干劑型的凍干保護劑，使用時百白破疫苗作為肺炎球菌疫苗的復(fù)溶劑。本申請的另一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗為：包括由肺炎球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C、19F及23F與肺炎球菌蛋白PsaA結(jié)合物組成的肺炎球菌疫苗；及百白破疫苗包括無細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類疫苗和破傷風(fēng)類疫苗，優(yōu)選的肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白結(jié)合物采用單一組分的蔗糖作為凍干劑型的凍干保護劑，使用時百白破疫苗作為肺炎球菌疫苗的復(fù)溶劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首創(chuàng)的實現(xiàn)了可同時實現(xiàn)四種疾病免疫的肺炎球菌-百白破聯(lián)合疫苗，其中肺炎球菌疫苗的蛋白-莢膜糖結(jié)合體可在不同的血清型間起到誘導(dǎo)交叉免疫保護作用；并且蛋白本身的作為毒力因子可誘導(dǎo)更強的免疫保護作用，對莢膜糖在免疫上起補充作用，從而增強了疫苗的免疫保護作用；同時肺炎球菌的自身蛋白可以避免與其他疫苗如白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生免疫沖突，使得本結(jié)合疫苗的實現(xiàn)成為了可能。本結(jié)合疫苗提高了接種者的肺炎球菌感染的免疫記憶應(yīng)答；肺炎球菌蛋白的加入使得肺炎球菌的免疫需要依賴胸腺免疫，因此使得肺炎球菌的免疫實現(xiàn)了全年齡段及全部血清型的長效、全覆蓋式免疫；肺炎球菌莢膜糖與肺炎球菌蛋白偶聯(lián)之后提高了體內(nèi)免疫應(yīng)答的速度及擴展了其免疫的深度和廣度，二者之間的協(xié)同作用雖然沒有單獨每種疫苗的效果好，但減少了接種次數(shù)，提高了接種效率，減輕了被接種者的身體負(fù)擔(dān)。肺炎球菌與百白破疫苗的聯(lián)合從源頭上解決了一系列上呼吸道感染性疾病，隨著肺炎球菌蛋白莢膜糖結(jié)合疫苗的不斷發(fā)展，該聯(lián)合疫苗具有廣泛的推廣和實用價值，對肺炎球菌及相關(guān)疫苗的研究有著深遠(yuǎn)的影響。具體實施方式為了能夠更清楚地描述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例來進行進一步的描述。實施例1制備肺炎球菌疫苗原液1、制備肺炎球菌莢膜糖a.取現(xiàn)有的7價肺炎球菌的常見致病血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的肺炎球菌培養(yǎng)；b.分別提純以上各種血清型肺炎球菌中抗原性強的莢膜多糖4、9V、14、19F及23F，寡糖18C及多糖6B；c.肺炎球菌滅活后離心收集上清液，經(jīng)超濾濃縮，根據(jù)各肺炎球菌血清型特性分別加入適量(體積分?jǐn)?shù)為70％的)預(yù)冷乙醇，離心收集，得粗制莢膜糖；將粗制莢膜糖溶于乙酸鈉溶液中，然后按1：2比例以冷酚混勻，離心去除蛋白，反復(fù)酚提5-6次，收集上清，用蒸餾水透析，透析后液體加2mol/L氯化鈣溶液，加入乙醇攪拌，離心去除核酸，收集上清，補加乙醇攪拌(終濃度80％)，離心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗滌沉淀，脫水干燥后得精制莢膜糖，置-20℃保存?zhèn)溆谩?、肺炎球菌表達的高保守性并具有免疫原性的蛋白ΔA146Ply根據(jù)GenBank公布的Ply基因(序列登錄號：X52474)，改性肺炎球菌溶血蛋白ΔA146Ply的設(shè)計引物序列如下：引物序列(5’-3’)F-ΔA146Ply-NGGAATTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATR-ΔA146Ply-NCGAGCTCGTCATTTTCTACCTTATCCTCTF-ΔA146Ply-CCGGCGGCCGCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGR-ΔA146Ply-CCCCTCGAGTTACTAGTCATTTTCTACCTTATCCTCT其中劃線部分為相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點。根據(jù)常規(guī)實驗方法將ΔA146Ply基因PCR擴增后，1％凝膠電泳，回收目標(biāo)DNA片段，將目標(biāo)DNA片段連接入pET-28a質(zhì)粒中，在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21內(nèi)轉(zhuǎn)化抽提重組DNA質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，確定表達量及表達形式后進行Ni-NTA樹脂純化；采用0.2％福爾馬林溶液去除內(nèi)毒素，即溶血活性，得到去除內(nèi)毒素后的ΔA146Ply蛋白。ΔA146Ply蛋白為Ply蛋白第146位丙氨酸缺失的改性蛋白，蛋白純度達到80％以上，檢測證明具有免疫原性且殘留的內(nèi)毒素含量低于0.1EU/μg。3、制備肺炎球菌蛋白-莢膜糖結(jié)合體與本實施例中，采用氨基還原法將肺炎球菌表面蛋白與莢膜糖進行偶聯(lián)，具體為將上述步驟獲得的ΔA146Ply蛋白與多種莢膜糖以1：2～4質(zhì)量比混合，以制備10mL疫苗原液為例，加入莢膜多糖4、9V、14、19F及23F各40μg，寡糖18C2μg及多糖6B80μg，ΔA146Ply蛋白160μg。經(jīng)過凝膠層析柱純化后測定莢膜糖含量。需要指出的是，由于肺炎球菌蛋白與肺炎球菌莢膜糖是同源的，因此二者之間具有協(xié)同作用，但本發(fā)明中的肺炎球菌蛋白與肺炎球菌莢膜糖之間的綴合不僅限于上述氨基還原法，只要是能實現(xiàn)該偶聯(lián)結(jié)果的方法均應(yīng)包括在本申請的發(fā)明范圍中。4、制備百白破疫苗由于本發(fā)明中的聯(lián)合疫苗以肺炎球菌疫苗與百白破疫苗減少相互影響，并且可以同時產(chǎn)生免疫為主要改進方向，故與本實施例中可采用現(xiàn)有技術(shù)制備百白破疫苗，具體方法在此不作贅述。但需要注意的是，本實施例中的百白破疫苗中無細(xì)胞百日咳疫苗效價≥4.0IU，白喉疫苗效價≥30IU且破傷風(fēng)疫苗效價≥40IU，且優(yōu)選為小水針劑型，其中含無細(xì)胞百日咳疫苗效價不低于4.0IU，白喉疫苗效價不低于30IU，破傷風(fēng)疫苗效價不低于40IU。將上述分別獲得的肺炎球菌和百白破疫苗留用，以《中華人民共和國藥典》2010版中要求分別進行穩(wěn)定性、免疫原性等疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié)果見后述。實施例2本實施例與實施例1的區(qū)別僅在于：肺炎球菌疫苗為凍干劑型，其中蔗糖作為凍干骨架，其中蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量不大于20％，凍干后得到肺炎球菌莢膜糖-蛋白疫苗凍干制劑。故本實施例與實施例1的進一步不同在于，百白破疫苗可作為肺炎球菌凍干疫苗的復(fù)溶液，即臨用前將百白破懸混液加入肺炎球菌凍干制劑中，復(fù)溶，混合均勻后肌肉注射。其中凍干步驟具體為：1.配制濃度為70％、經(jīng)121℃滅菌處理15min的蔗糖母液；2.將實施例1所得分離純化的肺炎球菌疫苗置于無菌容器內(nèi)，加入步驟1配制成的蔗糖母液，使蔗糖濃度至10％，得混勻制備成含有蔗糖保護劑的病毒原液半成品，再分別以1.0ml/瓶的規(guī)格灌裝于西林瓶內(nèi)以進行后續(xù)的凍干工藝；3.將步驟2所得半成品進行預(yù)凍，預(yù)凍時快速降溫至-55℃，維持15h～20h；4.將步驟4所得預(yù)凍后半成品進行第一階段干燥：升溫至-45℃～-40℃維持50h，升溫至-40℃～-33℃維持22h；5.將步驟4所得第一階段干燥后半成品進行第二階段干燥：設(shè)定不同時間內(nèi)升溫至0℃～30℃，不同升溫階段繼續(xù)維持28h；再制備凍干原液中蔗糖濃度為10％的肺炎球菌疫苗，凍干疫苗的制備方法可參考現(xiàn)有技術(shù)制備，在此不做贅述。將上述分別獲得的肺炎球菌和百白破疫苗留用，以《中華人民共和國藥典》2010版中要求分別進行穩(wěn)定性、免疫原性等疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié)果見后述。實施例3本實施例與實施例1的區(qū)別在于使用不同的肺炎球菌蛋白作為抗原及蛋白載體。本實施例中使用的蛋白載體為肺炎球菌表面黏附蛋白A(PsaA)。根據(jù)GenBank公布的PsaA基因(序列登錄號：U53509)設(shè)計引物序列如下：引物序列(5’-3’)F-PasACATGCCATGGCTGCTAGCGGAAAAAAAGATR-PasACGCAAGCTTTTATTTTGCCAATCCTTCAG其中劃線部分為相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點。根據(jù)常規(guī)實驗方法將PsaA基因PCR擴增后，1％凝膠電泳，回收目標(biāo)DNA片段，將目標(biāo)DNA片段連接入pET-28a質(zhì)粒中，在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21內(nèi)轉(zhuǎn)化抽提重組DNA質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，確定表達量及表達形式后進行Ni-NTA樹脂純化；得到PsaA蛋白，測試濃度，蛋白純度達到80％以上。將上述分別獲得的肺炎球菌和百白破疫苗留用，以《中華人民共和國藥典》2010版中要求分別進行穩(wěn)定性、免疫原性等疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié)果見后述。實施例4本實施例與實施例3的區(qū)別僅在于：肺炎球菌疫苗為凍干劑型，其中蔗糖作為凍干骨架，其中蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量不大于20％，凍干后得到肺炎球菌莢膜糖-蛋白疫苗凍干制劑。故本實施例與實施例3的進一步不同在于，百白破疫苗可作為肺炎球菌凍干疫苗的復(fù)溶液，即臨用前將百白破懸混液加入肺炎球菌凍干制劑中，復(fù)溶，混合均勻后肌肉注射。具體的凍干步驟請參見實施例2。對比例1采用市售七價肺炎球菌莢膜糖-蛋白綴合疫苗(商品名：沛兒)作為對比例，其用量及使用方法同說明書，同上述各實施例所得疫苗一并進行疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié)果見后述。對比例2采用單蛋白作為對比例，具體制備方法見《粘膜免疫DnaJ-ΔA146Ply融合蛋白對小鼠肺炎鏈球菌感染的保護效果及機制研究》，其用量及使用方法同臨床數(shù)據(jù)，同上述各實施例所得疫苗一并進行疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié)果見后述。對比例3采用市售百白破作為對比例(商品名：吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗)，其用量及使用方法同說明書，同上述各實施例所得疫苗一并進行疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié)果見后述。疫苗效價評估實驗一、Western-blot分析肺炎球菌蛋白抗原性將抗ΔA146Ply、抗PsaA小鼠血清分別進行Western-blot分析，重組表達的ΔA146Ply蛋白、PsaA蛋白可與小鼠血清發(fā)生免疫原性結(jié)合，在ΔA146Ply蛋白在53-kDa附近見目的蛋白條帶，PsaA蛋白在37-kDa附近見目的蛋白條帶，表明表達的蛋白具有較好的抗原性，都保留了兩種蛋白的抗原表位。二、穩(wěn)定性液體肺炎球菌疫苗：4℃避光保存24個月，蛋白無變性，抗原性良好。凍干制劑肺炎球菌疫苗：-20℃避光保存24個月，蛋白無變性，抗原性良好。三、滴度評估1.肺炎球菌免疫原性評估以本發(fā)明所產(chǎn)生的肺炎球菌疫苗腹腔注射接種3周齡幼小鼠，接種沛兒組：第1、2、3組每只小鼠每次接種的結(jié)合疫苗中多糖含量分別為0.25μg、1.0μg、4.0μg，每次每只鼠注射量均為0.5ml，接種3次；接種完成后采血，采用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗PS莢膜糖19F的抗體IgG水平；接種肺炎球菌蛋白疫苗組：采用腹腔注射接種，每只小鼠均于3周齡時首種，第1組小鼠接種后l周腋動脈采血；第2組小鼠首種后l周復(fù)種1次，復(fù)種后1周腋動脈采血，；第3組小鼠首種后每隔l周復(fù)種l次，第3次接種后1周腋動脈采血；第1～3組每只小鼠每次接種的結(jié)合疫苗中含蛋白量為1μg，注射量為0.5ml；接種完成后采血，采用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗Ply蛋白的抗體IgG水平；肺炎球菌莢膜糖-蛋白結(jié)合物疫苗組：采用腹腔注射接種，每只小鼠均于3周齡時首種，第1組小鼠接種后l周腋動脈采血；第2組小鼠首種后l周復(fù)種1次，復(fù)種后1周腋動脈采血，；第3組小鼠首種后每隔l周復(fù)種l次，第3次接種后1周腋動脈采血；第1～3組每只小鼠每次接種的結(jié)合疫苗中含莢膜糖量為3μg，注射量為0.5ml，接種完成后用ELISA法檢測小鼠血清中抗肺炎球菌莢膜糖PS及抗Ply的IgG抗體水平。小鼠血清中抗肺炎球菌莢膜糖PS及抗Ply的IgG抗體幾何平均滴度GMT(OD450值)見下表1。表1：血清抗PS/抗Ply抗體IgGGMT第一組第二組第三組P值對比例118.0528.8536.09＜0.001對比例244.82107.51180.6＜0.001實施例132.25/36.2142.07/80.7172.41/138.3(0.001325)**實施例232.78/35.8841.85/80.0972.08/137.7(0.001019)**實施例331.72/36.0041.58/78.9672.33/137.9(0.001684)**實施例432.05/36.1141.93/80.3171.84/138.1(0.001101)**2.肺炎球菌-百白破聯(lián)合疫苗免疫原性水平評估聯(lián)合疫苗的滴度水平檢測根據(jù)實施例分組進行。每組的給藥劑量及給藥方式同上述免疫原性評估實驗，不同點在于百白破疫苗檢測破傷風(fēng)抗毒素GMT。對比例1的給藥劑量及給藥方式同上述免疫原性評估實驗；百白破組注射常規(guī)百白破疫苗，每針劑量0.5mL，間隔一個月，共免疫3針；實施例1肺炎球菌-百白破聯(lián)合疫苗給藥劑量0.5mL，間隔一月，共免疫3針。接種完成后用ELISA法檢測小鼠血清中抗肺炎球菌莢膜糖PSIgG抗體水平，采用ELISA法檢測抗破傷風(fēng)抗體GMT。評估結(jié)果如下表2。表2：血清抗PS抗體IgG/抗破傷風(fēng)抗體GMT在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。當(dāng)前第1頁1 2 3