本發(fā)明屬于中藥制備技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種復(fù)方丹參有效成分組合物及其制備方法和應(yīng)用。

二、

背景技術(shù)：

早老性癡呆(Alzheimer’s Disease，AD)是伴隨老齡化社會(huì)出現(xiàn)的高發(fā)病，是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要以神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)、β-淀粉樣斑塊的積累、神經(jīng)元損失和炎癥為病理標(biāo)記，以記憶力減退、認(rèn)知障礙等神經(jīng)功能障礙為主要表現(xiàn)。目前，我國(guó)的老年癡呆患者有600萬(wàn)左右，而且患病率逐年增加，已成為僅次于心臟病、癌癥和腦卒中的第四位導(dǎo)致患者死亡的疾病。2050年，估計(jì)全球老年癡呆患者將超過(guò)一億。AD患者的生活不能完全自理，伴有精神和行為障礙，需要長(zhǎng)期監(jiān)護(hù)，無(wú)疑給全球醫(yī)療、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)尤其是患者家屬帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)。目前，美國(guó)每年用于老年癡呆患者的治療費(fèi)用已經(jīng)達(dá)到57000美元/人。現(xiàn)在，獲準(zhǔn)用于治療AD的藥物全球市場(chǎng)銷(xiāo)售額也在逐年增加，這潛在的市場(chǎng)對(duì)企業(yè)也存在巨大的吸引力。

近年來(lái)，AD藥物研究進(jìn)展非常迅速，主要涉及改善認(rèn)知功能的藥物和防止或延緩病程的藥物兩大類(lèi)，前者包括膽堿能激動(dòng)劑、促智藥、鈣拮抗劑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等，后者主要有抗炎藥、抗氧化劑、抗β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)聚集藥物等。而用于臨床的AD藥物主要包括膽堿脂酶抑制劑(如石杉?jí)A甲、多奈哌齊等)和NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受體拮抗劑(如鹽酸美金剛等)；減少氧化應(yīng)激和胞內(nèi)鈣超載的藥物如維生素E、司來(lái)吉蘭以及艾地苯醌，在臨床上均有一定效果；干擾Aβ形成和沉積的藥物，如β-環(huán)糊精、利福霉素、層粘連蛋白、蒽環(huán)類(lèi)抗生素、褪黑激素等均可抑制Aβ的纖維形成；Aβ免疫療法可望成為AD的一種新的治療方法。

目前市場(chǎng)上雖然有多種藥物，但治療效果卻不明顯，因此尋找能修復(fù)大腦學(xué)習(xí)和記憶功能的藥物，對(duì)于改善AD患者的病情具有十分重要的臨床意義。已有研究表明，復(fù)方丹參在對(duì)AD的治療中表現(xiàn)出巨大潛力，作為改善冠狀動(dòng)脈和腦部循環(huán)的經(jīng)典中藥處方，復(fù)方丹參能夠提高心腦血管功能、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、改善機(jī)體微循環(huán)，且對(duì)腦局部慢性缺血具有代償性的修復(fù)功能。

中國(guó)藥典2005年版記載，復(fù)方丹參片由丹參450g、三七141g和冰片8g組成。其功效為活血化瘀，理氣止痛。用于氣滯血瘀所致的胸痹，癥見(jiàn)胸悶、心前區(qū)刺痛；臨床用于胸中憋悶、冠心病、心絞痛等。

闡明復(fù)方配伍的化學(xué)物質(zhì)成分以及多靶點(diǎn)效應(yīng)機(jī)制，是解決中藥與國(guó)際醫(yī)藥發(fā)展趨勢(shì)接軌問(wèn)題的必經(jīng)之路?，F(xiàn)代研究中藥方劑配伍組方的方法，主要是在組分層次上研究中藥有效組分的配伍組方，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物配伍組方的定量分析，有助于明確中藥有效組分的作用靶點(diǎn)，探討中藥方劑的可能作用機(jī)制，為中藥現(xiàn)代化研究奠定基礎(chǔ)，為中藥拓展國(guó)際市場(chǎng)提供依據(jù)。

目前，海外中藥市場(chǎng)上，中國(guó)擁有專(zhuān)利權(quán)的中藥僅為0.3％；全球中藥市場(chǎng)銷(xiāo)售額一年約800億美元，中國(guó)僅占10％。日本漢藥企業(yè)借組中醫(yī)藥占領(lǐng)了國(guó)際中成藥市場(chǎng)的80％，賺取高額利潤(rùn)。將西藥的標(biāo)準(zhǔn)用于對(duì)中藥的研究開(kāi)發(fā)，將藥效和化學(xué)成分予以標(biāo)準(zhǔn)化呈現(xiàn)，這令全球各國(guó)更易接受日本生產(chǎn)的中成藥，即“漢藥”，這也是日本“漢藥”走向世界的根本。

因此，繼承和發(fā)展傳統(tǒng)中藥，并與現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)相結(jié)合，是中藥步入國(guó)際市場(chǎng)的關(guān)鍵所在。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是：提供一種復(fù)方丹參有效成分組合物及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

1.復(fù)方丹參有效成分組合物的組成

本發(fā)明所述復(fù)方丹參有效成分組合物由丹參酮IIA(Tanshinone IIA，Tan IIA，C₁₉H₁₈O₃)、三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，NG-R1，C₄₇H₈₀O₁₈)和龍腦(borneol，C₁₀H₁₈O)，三者按照不同的比例給出范圍進(jìn)行組合，產(chǎn)生復(fù)方丹參有效成分組合物。

丹參的主要有效成分為丹參酮IIA(Tanshinone IIA，C₁₉H₁₈O₃)，具有改善冠狀動(dòng)脈血循環(huán)、血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)、抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成、抗心肌肥厚等作用；主要用于冠心病、心絞痛、心肌梗死的醫(yī)治，也可用于室性早搏。三七的主要有效成分為三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，C₄₇H₈₀O₁₈)，具有散瘀止血、消腫定痛的功能。冰片的主要有效成分為龍腦(borneol，C₁₀H₁₈O)，具有發(fā) 汗、興奮、鎮(zhèn)痙、驅(qū)蟲(chóng)和腐蝕等功效。

本發(fā)明所述復(fù)方丹參有效成分組合物由2mg-4mg丹參酮IIA，10mg-20mg三七皂苷R1，10mg-20mg龍腦混和均勻組成，混和溶液中各有效組分的終濃度分別為丹參酮IIA 0.2-0.4mg/ml，三七皂苷R1 1.0-2.0mg/ml，龍腦1.0-2.0mg/ml。

2.本發(fā)明所述復(fù)方丹參有效成分組合物的制備方法：

分別稱(chēng)取丹參酮IIA(2mg-4mg)、三七皂苷R1(10mg-20mg)和龍腦(10mg-20mg)，混合均勻，加入200μl 95％乙醇置于超聲(功率250W，頻率33kHz)處理30min促進(jìn)藥物溶解，然后加入2％Tween-20的生理鹽水至10ml，置于超聲(功率250W，頻率33kHz)處理30min，配制成丹參酮IIA、三七皂苷R1和龍腦的混和溶液，混和溶液中各有效組分的終濃度分別為丹參酮IIA0.2-0.4mg/ml，三七皂苷R1 1.0-2.0mg/ml，龍腦1.0-2.0mg/ml。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明基于臨床使用的中藥復(fù)方進(jìn)行改造，將其有效成分進(jìn)行合理組合，產(chǎn)生全新的組合藥物，即復(fù)方丹參有效成分組合物。該組合物既保留了復(fù)方丹參的有效成分，又明確了藥物的組成，確保質(zhì)量的可控性。由于復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參滴丸等為臨床使用藥物，因此，該組合物又具有可靠的安全性。該組合物具備了創(chuàng)新藥物所具有的特征，可制備成治療老年性癡呆、冠心病、心絞痛、心肌梗死的藥物，也可以制備成治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、關(guān)節(jié)疼痛、瘡瘍腫痛的藥物，還可在制備治療鎮(zhèn)靜催眠、慢性肝炎、慢性膽囊炎藥物或輔助藥物中應(yīng)用。本發(fā)明將中藥與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，將西藥的標(biāo)準(zhǔn)用于中藥的研究開(kāi)發(fā)，將藥效和化學(xué)成分予以標(biāo)準(zhǔn)化呈現(xiàn)，并研究開(kāi)發(fā)出安全、穩(wěn)定、質(zhì)量可控的現(xiàn)代中藥。該組合物具備了藥品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性三大要素。這有利于解決中藥與國(guó)際醫(yī)藥發(fā)展趨勢(shì)接軌問(wèn)題，有助于實(shí)現(xiàn)中藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化。繼承和發(fā)展傳統(tǒng)中藥，并與現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)相結(jié)合，是中藥步入國(guó)際市場(chǎng)的關(guān)鍵所在。

四附圖說(shuō)明

圖1、模型小鼠的水迷宮訓(xùn)練期測(cè)試結(jié)果。在時(shí)長(zhǎng)為60s的訓(xùn)練期中，實(shí)驗(yàn)小鼠的逃離潛伏期(秒)，模型組小鼠到達(dá)平臺(tái)所用時(shí)間顯著增加，經(jīng)石杉?jí)A甲和復(fù)方丹參組合物處理后，相比于模型組小鼠，到達(dá)平臺(tái)所用時(shí)間顯著下降。數(shù)據(jù)以均值±SD顯示，**p<0.01， compared with control；#p<0.05，##p<0.01，compared with model。

圖2模型小鼠在水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)結(jié)果。A:目標(biāo)平臺(tái)撤走后，小鼠穿越目標(biāo)平臺(tái)位置的次數(shù)，模型組小鼠穿越次數(shù)明顯減少，經(jīng)石杉?jí)A甲或復(fù)方丹參組合物處理后，小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)有所增加；B:小鼠在目標(biāo)象限所用時(shí)間占總測(cè)試時(shí)間的比例，模型小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間占比顯著減少，而經(jīng)石杉?jí)A甲或復(fù)方丹參組合物處理后，目標(biāo)象限停留時(shí)間占比顯著升高。數(shù)據(jù)以均值±SD顯示，*p<0.05。

圖3、實(shí)驗(yàn)小鼠血清中INF-γ和IL4的ELISA檢測(cè)結(jié)果。A:相比于正常組，模型組小鼠血清中的INF-γ水平顯著升高，經(jīng)石杉?jí)A甲或復(fù)方丹參組合物處理后，小鼠血清中的INF-γ水平顯著下降；B:各組小鼠血清中IL4含量均沒(méi)有顯著的變化。數(shù)據(jù)以均值±SD顯示，*p<0.05，**p<0.01，ns p>0.05。

圖4、復(fù)方丹參組合物對(duì)D-gal和AlCl₃引起的AD小鼠神經(jīng)細(xì)胞的影響。A:經(jīng)D-gal和AlCl₃誘導(dǎo)后，小鼠腦部皮層區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞著色淺、邊緣模糊、形態(tài)萎縮，接受石杉?jí)A甲或復(fù)方丹參組合物處理后，這一情況得到明顯改善；B:模型小鼠海馬CA1區(qū)的椎體細(xì)胞邊緣模糊、結(jié)構(gòu)松散，經(jīng)石杉?jí)A甲或復(fù)方丹參組合物處理后，細(xì)胞的邊緣清晰、排列緊密。

圖5、MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的MTT檢測(cè)結(jié)果。為了觀察MIF對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的作用，加入梯度劑量的MIF誘導(dǎo)36h，呈劑量依賴(lài)性使細(xì)胞活力下降。數(shù)據(jù)以均值±SD顯示，***p<0.001，compared with control。

圖6、復(fù)方丹參組合物及其組分孵育SH-SY5Y的MTT檢測(cè)結(jié)果。為了觀察復(fù)方丹參組合物及其組分對(duì)細(xì)胞活力是否有影響，分別以梯度劑量的丹參酮IIA(Tan IIA)、三七皂苷R1(NG-R1)、龍腦(Borneol)以及復(fù)方丹參有效組分復(fù)合物(Danshen Compound)誘導(dǎo)36h，A-D：分別為T(mén)an IIA，NG-R1，Borneol及Danshen Compound孵育SH-SY5Y細(xì)胞的MTT檢測(cè)結(jié)果，顯示細(xì)胞的活力均沒(méi)有顯著的影響。數(shù)據(jù)以均值±SD顯示。

圖7、復(fù)方丹參有效組分及其組合物對(duì)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的MTT檢測(cè)。預(yù)先分別使用4μg/ml Tan IIA、20μg/ml NG-R1、20μg/ml Borneol以及Danshen Compound孵育SH-SY5Y細(xì)胞1h，然后加入50ng/ml的MIF進(jìn)行誘導(dǎo)，Tan IIA以及Danshen Compound能夠顯著地減緩MIF抑制細(xì)胞活力的效果。數(shù)據(jù)以均值±SD顯示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖8、MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果。50ng/ml MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞24h，細(xì)胞向右偏移，細(xì)胞膜通透性增加，Annexin V進(jìn)入胞質(zhì)，意味著細(xì)胞處于前期凋亡期，呈現(xiàn)出與4μM Aβ_1-42相似的促細(xì)胞凋亡作用；MIF與Aβ共孵育，向右偏移更加嚴(yán)重，表現(xiàn)出更強(qiáng)的促細(xì)胞凋亡作用

圖9復(fù)方丹參組合物及其組分與MIF共同孵育SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分別加入4μg/ml丹參酮IIA(Tan IIA)、20μg/ml三七皂苷R1(NG-R1)、20μg/ml龍腦(Borneol)以及復(fù)方丹參有效組分復(fù)合物(Danshen Compound)預(yù)孵育SH-SY5Y細(xì)胞1h，然后加入50ng/ml MIF誘導(dǎo)24h，丹參酮IIA、三七皂苷R1以及組合物可顯著的減緩MIF促進(jìn)細(xì)胞向右偏移，抑制MIF的促凋亡作用。

圖10、MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞Bad的蛋白量上調(diào)。加入梯度劑量的MIF 誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞6h，MIF呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性促進(jìn)Bad含量的上調(diào)。數(shù)據(jù)以均值±SD顯示，**p<0.01，***p<0.001，compared with control。

圖11、復(fù)方丹參組合物及其組分抑制MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y的Bad上調(diào)作用。分別加入4μg/ml丹參酮IIA(Tan IIA)、20μg/ml三七皂苷R1(NG-R1)、20μg/ml龍腦(Borneol)以及復(fù)方丹參有效組分復(fù)合物(Danshen Compound)預(yù)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞30min，然后加入50ng/ml MIF誘導(dǎo)細(xì)胞6h，Tan IIA、NG-R1以及Danshen Compound呈現(xiàn)出顯著抑制MIF促進(jìn)Bad水平上調(diào)的作用。數(shù)據(jù)以均值±SD顯示，*p<0.05，***p<0.001。

五、具體實(shí)施方式

1.藥理實(shí)驗(yàn)

(1)復(fù)方丹參有效成分組合物對(duì)AlCl₃和D-半乳糖誘導(dǎo)的AD小鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力研究

所有研究均獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可，并遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)指南相關(guān)要求。使用AlCl₃和D-半乳糖腹腔注射10mg/kg AlCl₃和60mg/kg D-半乳糖，持續(xù)90天，構(gòu)建Alzheimer小鼠模型。

在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)模型組、石杉?jí)A甲陽(yáng)性藥物組、復(fù)方丹參有效成分組合物給藥組的實(shí)驗(yàn)小鼠，灌胃給藥持續(xù)兩周。

32只三周齡的雄性BALB/c小鼠(購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)，體重16±2g，隨機(jī)分成4組，分別標(biāo)記為A、B、C和D四組，每組8只。A為正常組，腹腔注射生理鹽水，B-D為AlCl₃和D-半乳糖干預(yù)組，腹腔注射10mg/kg AlCl₃和60mg/kg D-半乳糖，持續(xù)90天。造模結(jié)束后，A、B組灌胃注射生理鹽水，C組灌胃給藥0.05mg/kg石杉?jí)A甲(Hupeizine A)，D組灌胃給藥復(fù)方丹參有效成分組合物，每只小鼠每天給藥一次，每次0.2ml，實(shí)際給藥量為4mg/kg丹參酮IIA、20mg/kg三七皂苷R1和20mg/kg龍腦。造模和治療期間，正常供給水和食物，定期稱(chēng)量體重；給藥結(jié)束后，進(jìn)行行為學(xué)以及生化指標(biāo)的檢測(cè)。

小鼠給藥結(jié)束后，通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，觀察小鼠的學(xué)習(xí)、記憶和信息整理情況。測(cè)試開(kāi)始前5天，每天通過(guò)4次訓(xùn)練和引導(dǎo)，幫助實(shí)驗(yàn)鼠記憶水池中平臺(tái)的位置，并記錄他們的行經(jīng)和到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間；第6天測(cè)試學(xué)習(xí)和記憶能力，移除平臺(tái)，觀察和記錄模型鼠在目標(biāo)想象的停留時(shí)間和經(jīng)過(guò)次數(shù)，以及記錄原平臺(tái)位置的穿越次數(shù)。通過(guò)分析穿越平臺(tái)數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間和路程，判斷模型鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力是否受損。

(2)復(fù)方丹參有效成分組合物對(duì)AlCl₃和D-半乳糖誘導(dǎo)的AD小鼠血清中IL-4和IFN-γ含量的影響

使用乙醚麻醉小鼠，采用小鼠摘眼球方法取血，取血前先將小鼠胡須剪去以免溶血發(fā)生。血液室溫靜置2h，然后在12000rpm，4℃條件下離心15min，取離心后得到的上層血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA，使用ELISA檢測(cè)盒(Mouse IL-4ELISA Kit 96T，Mouse IFN-gamma ELISA Kit，聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，分別檢測(cè)血清中IL4和INF-γ的含量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用待測(cè)因子的高特異性單克隆抗體，提前包被在高親和力的酶標(biāo)版上，加入適度稀釋的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，其中的因子會(huì)與其單抗結(jié)合，洗去游離成分；加入生物素化的抗小鼠單克隆抗體，其余結(jié)合在單抗上的因子形成免疫復(fù)合物，洗去未結(jié)合的成分；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合，洗去未游離的酶結(jié)合物；然后加入顯色液，若反應(yīng)孔中有待測(cè)因子，辣根過(guò)氧化酶會(huì)致無(wú)色的顯色液呈藍(lán)色；加終止液后變黃。在Safire酶標(biāo)儀上檢測(cè)在波長(zhǎng)450nm下的OD值(OD ₄₅₀)。待測(cè)因子濃度與OD值呈正比。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出樣本中待測(cè)因子濃度。

(3)復(fù)方丹參有效成分組合物對(duì)AlCl₃和D-半乳糖誘導(dǎo)的AD小鼠大腦皮層和海馬區(qū)的中樞神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響

小鼠斷頸處死后，采用尼氏染色法觀察小鼠大腦皮層和海馬區(qū)的中樞神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)，了解小鼠腦部的健康狀況。小鼠處死后灌注4％多聚甲醛并取整腦浸泡24h固定。將腦組織用石蠟包埋，用冰凍切片機(jī)冠狀切片，片厚4-6μm。二甲苯脫蠟，分別用無(wú)水乙醇、90％乙醇和70％乙醇浸泡。清洗后置于尼氏體染色液中浸泡5min，接著分別浸泡于95％乙醇和70％乙醇，脫水晾干，中性樹(shù)膠封片。在普通光學(xué)顯微鏡下拍照并觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)變化。

(4)復(fù)方丹參有效成分及其組合物對(duì)MIF誘導(dǎo)的人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y損傷的保護(hù)作用

通過(guò)外源加入MIF誘導(dǎo)人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y，使用MTT細(xì)胞活力檢測(cè)方法、流式細(xì)胞技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測(cè)MIF對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制。同時(shí)，加入復(fù)方丹參有效成分及其組合物，檢測(cè)其是否具有保護(hù)作用。

人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y獲贈(zèng)于張辰宇實(shí)驗(yàn)室(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)。 細(xì)胞培養(yǎng)液使用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)按89:10:1的比例配制而成。細(xì)胞在37℃、含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至匯合度80％時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞1min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，在1000rpm條件下離心5min，棄上清。

加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并混勻，分至6孔(Western blot實(shí)驗(yàn))或96孔細(xì)胞板(MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn))中，待細(xì)胞貼壁后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液。分別加入1ml(6孔板)或100μl(96孔板)預(yù)先配制的、工作濃度為4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦以及復(fù)方丹參有效成分組合物溶液(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦)，處理1h(MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn))或30min(Western blot實(shí)驗(yàn))，然后每孔加入5μl(6孔板)或0.5μl(96孔板)10μg/ml MIF(實(shí)際工作濃度為50ng/ml)誘導(dǎo)6h(Western blot實(shí)驗(yàn))、24h(細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn))以及36h(MTT實(shí)驗(yàn))。接下來(lái)，進(jìn)一步進(jìn)行MTT檢測(cè)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)和Western blot檢測(cè)。

(A)MTT檢測(cè)

采用MTT方法，使用Safire酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值OD ₅₇₀值，間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。

在上述細(xì)胞培養(yǎng)液中，再加入10μl濃度為5mg/ml的MTT溶液(用無(wú)菌PBS配制，135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl DMSO低速震蕩混勻10min，使結(jié)晶充分溶解。選擇570nm波長(zhǎng)，在Safire酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔光吸收值OD ₅₇₀，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

(B)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin V/PI雙染色法，使用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Annexin V是一種Ca²⁺依賴(lài)性的磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸(PS)有高度親和力，通過(guò)與凋亡早期細(xì)胞的外側(cè)暴露的PS結(jié)合。對(duì)Annexin V進(jìn)行熒光素(FITC)標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，卻可透過(guò)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，而將細(xì)胞核染色。將Annexin V與PI合用，可區(qū)分處于不同凋亡 時(shí)期的細(xì)胞。

在上述細(xì)胞培養(yǎng)液中，用無(wú)EDTA胰酶消化貼壁細(xì)胞1min，加入培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打至細(xì)胞脫落。在300g，4℃條件下離心5min，棄上清，收集細(xì)胞。然后用預(yù)冷的PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)洗滌細(xì)胞兩次，每次在300g，4℃條件下離心5min，收集細(xì)胞。根據(jù)AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的操作步驟，加入100μl Binding buffer重懸細(xì)胞，然后加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI Staining Solution，輕輕混勻；避光，室溫反應(yīng)10min。補(bǔ)加400μl Binding buffer混勻，樣品在1小時(shí)內(nèi)用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，Annexin V-FITC在FL1通道檢測(cè)，PI在FL3通道檢測(cè)。運(yùn)用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀自帶的CFlow軟件進(jìn)行分析，繪制單色散點(diǎn)圖，F(xiàn)L1為橫坐標(biāo)，F(xiàn)L3為縱坐標(biāo)。

(C)Western Blot檢測(cè)

在上述細(xì)胞培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)液吸出，用預(yù)冷的PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)洗一遍，每孔加入500μl胰酶消化1min，加入培液終止消化，將細(xì)胞收集到1.5ml EP管中，1000rpm離心5min；棄上清，再加入1ml預(yù)冷的PBS重懸，同條件離心5min；棄上清，加入80-100μl含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液混勻，置于冰上裂解30min，離心取蛋白上清。

通過(guò)BCA法進(jìn)行蛋白定量，選擇562nm波長(zhǎng)，在Safire酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔光吸收值OD₅₆₂，將數(shù)據(jù)制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出每個(gè)樣品的總蛋白量。

全蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分離后，采用半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜。之后，將PVDF膜置于1×TBS緩沖液中洗5min，加入含5％脫脂奶粉的1×TBS室溫封閉1h。裁剪含目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白的PVDF膜，用1×TBST緩沖液漂洗5×3min。將一抗用含5％BSA的1×TBST稀釋?zhuān)跤豢梗?℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜，用1×TBST洗膜5×3min。用含5％BSA的1×TBST稀釋二抗，加入二抗，室溫孵育1h，用1×TBST洗膜5×3min。使用ECL顯影液，在Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯示蛋白條帶；用Image J v4.7軟件分析并獲得蛋白灰度值。

(5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD) 表示。水迷宮的組間逃離潛伏期數(shù)據(jù)使用two-way ANOVA分析，其他數(shù)據(jù)多組間差異使用one-way ANOVA分析，兩兩間差異使用T檢驗(yàn)。結(jié)果p值小于0.05表示比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(A)復(fù)方丹參有效成分組合物對(duì)D-gal和AlCl₃誘致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和2所示。研究結(jié)果表明，模型組小鼠的逃避潛伏期并沒(méi)有明顯的趨勢(shì)變化，說(shuō)明學(xué)習(xí)和記憶能力受到損害；經(jīng)過(guò)石杉?jí)A甲和復(fù)方丹參有效成分組合物治療后，小鼠找到目標(biāo)平臺(tái)的所使用的時(shí)間均比模型組短，表明復(fù)方丹參有效成分組合物可以修復(fù)小鼠受損的空間學(xué)習(xí)能力(p<0.01)(圖1)。

實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過(guò)5天的學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練后，進(jìn)行空間摸索實(shí)驗(yàn)。撤出目標(biāo)平臺(tái)后，圖2A顯示AD鼠穿越目標(biāo)平臺(tái)的次數(shù)比正常組顯著減少，接受石杉?jí)A甲和復(fù)方丹參有效成分組合物治療后，穿越平臺(tái)位置的次數(shù)較模型組增多。圖2B顯示石杉?jí)A甲和復(fù)方丹參有效成分組合物組較AD組，在目標(biāo)象限的時(shí)間顯著增長(zhǎng)，說(shuō)明復(fù)方丹參有效成分組合物可修復(fù)小鼠因長(zhǎng)期攝入AlCl₃及D-Gal而受損的學(xué)習(xí)及記憶能力(p<0.01)。

(B)復(fù)方丹參有效成分組合物對(duì)D-gal和AlCl₃誘導(dǎo)小鼠INF-γ相關(guān)炎癥的緩解作用

炎癥反應(yīng)伴隨著AD的發(fā)生和發(fā)展。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，AD模型小鼠血漿里的INF-γ水平顯著升高(圖3A)，而IL4含量無(wú)明顯變化(圖3B)，說(shuō)明AlCl₃及D-Gal的慢性誘導(dǎo)會(huì)引起小鼠體內(nèi)INF-γ相關(guān)的炎癥反應(yīng)，而對(duì)IL4相關(guān)的炎癥作用并無(wú)顯著影響。石杉?jí)A甲和復(fù)方丹參有效成分組合物能夠顯著降低AD小鼠血清中IFN-γ的含量(p<0.05)(圖3A)。這說(shuō)明復(fù)方丹參組合物可緩解AD小鼠體內(nèi)與INF-γ相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

(C)復(fù)方丹參有效成分組合物對(duì)D-gal和AlCl₃致小鼠神經(jīng)損傷的修復(fù)作用

神經(jīng)元丟失是AD發(fā)生和發(fā)展的病因之一，通過(guò)觀察尼氏體可以了解模型動(dòng)物腦部的神經(jīng)元形態(tài)。

尼氏染色結(jié)果顯示，正常小鼠大腦皮層的尼氏體著色深、神經(jīng)元形態(tài)清晰，表示神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成作用旺盛；模型組的尼氏體著色淺、形態(tài)萎縮。石杉 堿甲和復(fù)方丹參有效成分組合物組的AD小鼠大腦皮層的尼氏體著色深，神經(jīng)元形態(tài)清晰、分布均勻，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著增多，形態(tài)更充盈(圖4A)；而且，AD小鼠腦部海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)比模型組更緊湊，邊緣更清晰，染色較深，細(xì)胞的形態(tài)得到明顯的改善(圖4B)。

(D)復(fù)方丹參有效組分及其組合物對(duì)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響

(a)復(fù)方丹參有效組分及其組合物對(duì)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的作用

首先，使用不同濃度的MIF處理SH-SY5Y細(xì)胞，孵育36h。之后，采用MTT方法檢測(cè)MIF對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。圖5顯示，MIF顯著地呈劑量依賴(lài)性抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)。而且，MIF濃度為50ng/ml時(shí)，能夠顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)。

其次，使用不同濃度的復(fù)方丹參有效組分及其組合物，處理SH-SY5Y細(xì)胞，孵育36h之后，采用MTT方法，檢測(cè)復(fù)方丹參有效組分及其組合物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。圖6顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，復(fù)方丹參有效組分及其組合物對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性。而且，丹參酮IIA、三七皂苷R1和龍腦的濃度分別為4μg/ml、20μg/ml和20μg/ml時(shí)可能有效較小。

最后，進(jìn)一步使用終濃度為4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦以及復(fù)方丹參有效組分復(fù)合物(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1和20μg/ml龍腦)，分別孵育SH-SY5Y細(xì)胞1h，再加入50ng/ml MIF誘導(dǎo)細(xì)胞36h，MTT檢測(cè)復(fù)方丹參有效組分及其組合物對(duì)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的作用。結(jié)果如圖7所示，丹參酮IIA與組合物組對(duì)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用。

(b)復(fù)方丹參有效組分及其組合物對(duì)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

MIF是一種炎癥介導(dǎo)因子，有研究顯示，AD患者的腦部MIF含量比正常人高。為了研究MIF對(duì)神經(jīng)元的影響，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)MIF對(duì)細(xì)胞的凋亡作用。寡聚化的Aβ_1-42對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有顯著的毒性作用，可作為神經(jīng)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性指標(biāo)。圖8顯示，分別用4μM寡聚化的Aβ_1-42和50ng/ml MIF孵育以及共孵育細(xì)胞24h，采用Annexin V-FITC/PI雙染方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Aβ_1-42和MIF能夠分別促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，共孵育可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生大部分早期凋亡以及少部分晚期凋亡?？梢?jiàn)，終濃度為50ng/ml的MIF能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡。

類(lèi)似地，采用Annexin V-FITC/PI雙染方法檢測(cè)復(fù)方丹參有效組分及其組合物對(duì)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用。分別加入終濃度為4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦以及復(fù)方丹參有效成分組合物(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1和20μg/ml龍腦)，孵育SH-SY5Y細(xì)胞1h，然后加入50ng/ml MIF誘導(dǎo)刺激細(xì)胞24h。圖9顯示，丹參酮IIA、三七皂苷R1以及組合物可以改善MIF對(duì)細(xì)胞的損傷作用，能夠有效地保護(hù)細(xì)胞。以及組合物可顯著的減緩MIF促進(jìn)細(xì)胞向右偏移，抑制MIF的促凋亡作用。

(c)復(fù)方丹參有效組分及其組合物抑制SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

首先，采用Western Blot方法，檢測(cè)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中Bad的表達(dá)。使用濃度梯度的MIF孵育SH-SY5Y細(xì)胞，6h后收樣，通過(guò)Western Blot檢測(cè)細(xì)胞的Bad蛋白量。圖10顯示，MIF呈劑量濃度依賴(lài)性促進(jìn)細(xì)胞Bad蛋白量上調(diào)。而且，MIF濃度為50ng/ml時(shí)，能夠顯著地誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中Bad表達(dá)上升。

其次，采用Western Blot方法，檢測(cè)復(fù)方丹參有效成分及其組合物對(duì)MIF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞Bad表達(dá)上調(diào)的作用。分別加入終濃度為4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦以及復(fù)方丹參有效成分組合物(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1和20μg/ml龍腦)，預(yù)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞30min，再加入終濃度為50ng/ml的MIF誘導(dǎo)6h。如圖11所示，丹參酮IIA、三七皂苷R1和組合物均能夠顯著地抑制MIF致SH-SY5Y細(xì)胞中Bad表達(dá)量的上升。

復(fù)方丹參組合物治療，可顯著緩解AlCl₃和D-gal誘致小鼠的神經(jīng)毒性作用、降低炎癥反應(yīng)、修復(fù)小鼠智力。而且，復(fù)方丹參組合物能夠使MIF誘導(dǎo)人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y的Bad表達(dá)量下降，干預(yù)MIF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，復(fù)方丹參組合物具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))

所有研究均獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可，并遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)指南相關(guān)要求。

BALB/c純系小鼠(購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物中心)，清潔級(jí)，體重16±2g，雄性。適應(yīng)性喂養(yǎng)。

32只三周齡的雄性balb/c小鼠(購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)，體重16±2g， 隨機(jī)分成4組，分別標(biāo)記為A、B、C和D四組，每組8只。

A組為正常組，腹腔注射生理鹽水，持續(xù)90天；B、C和D三組為AlCl₃和D-半乳糖(D-Galactose，D-Gal)干預(yù)組(AD小鼠模型組)，持續(xù)90天。

BALB/c小鼠(A組，正常組)

BALB/c純系小鼠(購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物中心)，清潔級(jí)，體重16±2g，雄性。腹腔注射生理鹽水，持續(xù)90天。

AlCl₃和D-半乳糖致Alzheimer’s disease小鼠模型的構(gòu)建(AD小鼠模型組)

分別稱(chēng)取10mg AlCl₃和60mg D-Gal，共溶于10ml生理鹽水中，配制成AlCl₃和D-半乳糖混和溶液(含1mg/ml AlCl₃和6mg/ml D-gal)。

實(shí)驗(yàn)前一天，剔去小鼠腹部的毛。次日，腹腔注射已經(jīng)配制的AlCl₃和D-半乳糖混和溶液。每只小鼠每次腹腔注射0.2ml，實(shí)際上，小鼠體內(nèi)的終濃度為10mg/kg AlCl₃和60mg/kg D-Gal。持續(xù)90天。

造模結(jié)束后，A組灌胃注射生理鹽水0.2ml(即正常組)，B組灌胃注射生理鹽水0.2ml(即AD模型組)，C組灌胃給藥0.2ml石杉?jí)A甲(即陽(yáng)性藥組)，D組灌胃給藥0.2ml復(fù)方丹參有效成分組合物(即實(shí)驗(yàn)用藥組)，持續(xù)兩周。

石杉?jí)A甲(Hupeizine A)陽(yáng)性藥物實(shí)驗(yàn)(陽(yáng)性藥物組)

精密稱(chēng)取5mg石杉?jí)A甲，加入1ml 95％乙醇置于超聲(功率250W，頻率33kHz)處理30min促進(jìn)藥物溶解。然后加入2％Tween-20的生理鹽水至10ml，置于超聲(功率250W，頻率33kHz)處理30min，制成100×的石杉?jí)A甲溶液0.5mg/ml，使用時(shí)用含2％Tween-20的生理鹽水稀釋至0.005mg/ml。

取AD小鼠8只，每只小鼠每天灌胃給藥一次，每次0.2ml，實(shí)際給藥濃度為10mg/kg。持續(xù)兩周。

復(fù)方丹參有效成分組合物的制備與給藥(簡(jiǎn)稱(chēng)組合物給藥組)

根據(jù)中國(guó)藥典2015年版第一部規(guī)定，每片復(fù)方丹參片規(guī)格要求如下：丹參以丹參酮IIA計(jì)，含量不得少于0.6mg；三七以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1以及人參皂苷Re總量計(jì)不得少于6.0mg；冰片無(wú)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。每天推 薦服用9片，按人體重60kg計(jì)算，小鼠的藥物攝入量應(yīng)為：丹參酮IIA＝0.6mg/60kg×9×12.33＝1.1097mg/kg；三七皂苷R1＝6mg/kg×9×12.33＝11.097mg/kg。

同時(shí)，參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)而確定復(fù)方丹參有效成分組合物的最終給藥濃度為4mg/kg丹參酮IIA、20mg/kg三七皂苷R1和20mg/kg龍腦。

實(shí)際上，分別稱(chēng)取4mg丹參酮IIA、20mg三七皂苷R1和20mg龍腦，混合，加入200μl 95％乙醇置于超聲(功率250W，頻率33kHz)處理30min，促進(jìn)藥物溶解，然后加入2％Tween-20的生理鹽水至10ml，置于超聲(功率250W，頻率33kHz)處理30min，配制成丹參酮IIA、三七皂苷R1和龍腦的混和溶液，混和溶液中各有效組分的終濃度分別為丹參酮IIA0.4mg/ml，三七皂苷R1 2.0mg/ml，龍腦2.0mg/ml。

取AD小鼠8只，每只每次灌胃給藥0.2ml藥液，每日給藥一次。實(shí)際給藥劑量丹參酮IIA為4mg/kg、三七皂苷R1為20mg/kg和龍腦為20mg/kg。持續(xù)兩周。

造模和治療期間，各組小鼠在相同環(huán)境下正常飼養(yǎng)，喂食SPF維持型鼠糧和雙蒸水，定期稱(chēng)量體重。

3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(體外實(shí)驗(yàn))

(1)TBS緩沖液的制備

用天平稱(chēng)取6g三羥甲基氨基甲烷(Tris)和9g NaCl。先將6g Tris倒入廣口瓶，加蒸餾水約800-900ml，攪動(dòng)，使Tris充分溶解后，用注射器抽取約5ml 37％濃鹽酸，注入約3.8ml，攪動(dòng)，用pH計(jì)測(cè)pH值。根據(jù)pH值再滴加鹽酸，邊滴邊攪，直至pH值為7.6。再加入9g NaCl攪拌，待完全溶解后加蒸餾水至1000ml。得到由Tris配制的緩沖生理鹽水(即TBS緩沖液)。

(2)PBS緩沖液的配制

稱(chēng)7.9g NaCl、0.2g KCl、0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L，得到PBS(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,8mM K2HPO4，pH 7.4)緩沖液。保存于4℃冰箱中即可。

(3)MTT溶液的配制

稱(chēng)取MTT 0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液(PBS)中，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，得到濃度為5mg/ml的MTT溶液。4℃避光保存待用。

(4)細(xì)胞培養(yǎng)液的配制

使用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗(青霉素、鏈霉素)按89:10:1的比例配制而成。

(5)誘導(dǎo)劑配制

將0.1mg Aβ_1-42干粉溶于DMSO配制為濃度4mM的母液，于-20℃儲(chǔ)存；使用前取5μl母液加入35μl 1×PBS稀釋成濃度為500μM，并于37℃靜置3天，使其寡聚化；使用時(shí)取8μl濃度為500μM的Aβ_1-42與1ml細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，制成4μM寡聚化的Aβ_1-42溶液。

將2μg MIF溶于0.2ml含有0.1％BSA的無(wú)菌1×PBS中，混勻制成濃度為10μg/ml的母液，于-20℃儲(chǔ)存，使用時(shí)取5μl濃度10μg/ml的MIF溶液與1ml細(xì)胞培養(yǎng)液混勻制成50ng/ml的MIF溶液。

(6)藥物配制

稱(chēng)取2mg丹參酮IIA、10mg NG-R1和10mg龍腦，分別加入2ml 95％乙醇溶解，超聲(功率250W，頻率33kHz)處理30min以促溶，配制成濃度為1mg/ml丹參酮IIA溶液、5mg/ml三七皂苷R1溶液和5mg/ml龍腦溶液，儲(chǔ)存待用。使用時(shí)，取4μl丹參酮IIA、4μl三七皂苷R1、4μl龍腦溶液，分別與1ml細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，制成4μg/ml丹參酮IIA工作液、20μg/ml三七皂苷R1工作液和20μg/ml龍腦工作液。

稱(chēng)取2mg丹參酮IIA、10mg三七皂苷R1和10mg龍腦，混合均勻，加入2ml95％乙醇溶解，采用超聲處理(功率250W，頻率33kHz)30min以促溶，制備出復(fù)方丹參有效成分組合物溶液(含1mg/ml丹參酮IIA、5mg/ml三七皂苷R1、5mg/ml龍腦)。取4μl復(fù)方丹參有效成分組合物溶液與1ml細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，制成復(fù)方丹參有效成分組合物工作液(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦)。

(7)人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y

人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y獲贈(zèng)于張辰宇實(shí)驗(yàn)室(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)。細(xì)胞培養(yǎng)液使用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)按89:10:1的比例配制而成。細(xì)胞在37℃、含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至匯合度80％時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞1min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，在1000rpm條件下離心5min，棄上清。

加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并混勻，分至6孔(Western blot實(shí)驗(yàn))或96孔細(xì)胞板(MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn))中，待細(xì)胞貼壁后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液。分別加入1ml(6孔板)或100μl(96孔板)預(yù)先配制的、工作濃度為4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦以及復(fù)方丹參有效成分組合物溶液(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦)，處理1h(MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn))或30min(Western blot實(shí)驗(yàn))，然后每孔加入5μl(6孔板)或0.5μl(96孔板)10μg/ml MIF(實(shí)際工作濃度為50ng/ml)誘導(dǎo)6h(Western blot實(shí)驗(yàn))、24h(細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn))以及36h(MTT實(shí)驗(yàn))。接下來(lái)，進(jìn)一步進(jìn)行MTT檢測(cè)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)和Western blot檢測(cè)。

(8).實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

(A)空間學(xué)習(xí)及記憶能力檢測(cè)

小鼠給藥治療結(jié)束后，將其安置在已經(jīng)設(shè)定好的水迷宮實(shí)驗(yàn)室內(nèi)24h，熟悉環(huán)境；小鼠雖然天生就會(huì)游泳，但其厭惡處于水中的狀態(tài)，將其放入水中，會(huì)本能找到平臺(tái)休息。通過(guò)水迷宮的檢測(cè)，來(lái)觀察模型鼠的學(xué)習(xí)、記憶和信息整理情況。測(cè)試開(kāi)始前5天，每天通過(guò)4次不同方位的訓(xùn)練和引導(dǎo)，每次訓(xùn)練時(shí)間為60s，在平臺(tái)逗留時(shí)間為15s，幫助實(shí)驗(yàn)鼠記憶水池中平臺(tái)的位置，并記錄他們的行經(jīng)和到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間；第6天測(cè)試學(xué)習(xí)和記憶能力，移除平臺(tái)，觀察和記錄模型鼠在目標(biāo)想象的停留時(shí)間和經(jīng)過(guò)次數(shù)，以及記錄原平臺(tái)位置的穿越次數(shù)。通過(guò)分析穿越平臺(tái)數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間和路程，判斷模型鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力是否受損。

(B)血清中INF-γ及IL4的含量檢測(cè)

采用小鼠摘眼球方法取血，取血前先將小鼠胡須剪去以免溶血發(fā)生。取血前，使用乙醚麻醉小鼠，然后用左手抓住小鼠身體，并用拇指和食指抓緊頭部使眼球充血突出，然后用小鑷子夾住眼球迅速取出，使血液流入EP管并輕按小鼠心臟部位，以獲取更多血液，取血完畢后進(jìn)行斷頸處死小鼠。血液室溫靜置2h，然后在12000rpm，4℃條件下離心15min，小心吸取上清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA，使用ELISA檢測(cè)盒(Mouse IL-4ELISA Kit96T，Mouse IFN-gamma ELISA Kit，聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，測(cè)定IL4及INF-γ的表達(dá)量。

試劑準(zhǔn)備

提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫；

洗滌液的配制：取2.5ml濃縮洗滌液，加入47.5ml ddH₂O，配制成ddH₂O洗滌液，渦旋混勻待用；

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：取0.5ml標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液(1b)加入凍干標(biāo)準(zhǔn)品(1a)中，制成濃度2000pg/ml，渦旋、待徹底溶解后靜置15min。然后進(jìn)行梯度稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)下的濃度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml；

生物素化抗體工作液：用生物素化抗體稀釋液(2b)稀釋濃縮生物素化抗體(2a)，稀釋比例1:100，待用；

酶結(jié)合物工作液：以酶結(jié)合物稀釋液(3b)稀釋濃縮酶結(jié)合物(3a)，比例為1:100，待用。

實(shí)驗(yàn)操作

從平衡至室溫的密封袋中，取出所需96孔板；

除空白孔外，分別取血清和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品100μl加入孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，在37℃孵箱中反應(yīng)90min；

手動(dòng)洗板4次：將板中液體倒掉，在衛(wèi)生紙上拍去孔內(nèi)殘留的液體，每孔加入350μl洗滌液，30s后倒掉，在衛(wèi)生紙上拍去殘留洗液，重復(fù)4次；

除空白對(duì)照孔外，加入100μl/生物素化抗體工作液，用封板膠紙封住反應(yīng)孔， 在37℃孵箱中孵育60min；

重復(fù)手動(dòng)洗板4次；

除空白孔外，加入100μl酶結(jié)合物工作液。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，在37℃條件下孵育30min；

重復(fù)手動(dòng)洗板4次；

每孔加入100μl顯色劑，板子外部包上一層錫箔紙，避光37℃孵箱孵育10-20min。每孔加入100μl終止液，混勻后5min內(nèi)即刻在Safire酶標(biāo)儀上測(cè)量OD 450值。

(C)腦組織尼氏染色

小鼠斷頸處死后，灌注4％多聚甲醛并取整腦浸泡24h固定。將腦組織用石蠟包埋，用冰凍切片機(jī)冠狀切片，片厚4-6μm。二甲苯脫蠟，分別用無(wú)水乙醇、90％乙醇和70％乙醇浸泡。清洗后置于尼氏體染色液尼氏染色液(貨號(hào)C0117，碧云天生物技術(shù)有限公司)中浸泡5min，接著分別浸泡于95％乙醇和70％乙醇，脫水晾干，中性樹(shù)膠封片。在普通光學(xué)顯微鏡下拍照并觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)變化。

(D)MTT檢測(cè)

加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并混勻，分至96孔細(xì)胞板中，，每孔約3000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，然后分別加入100μl預(yù)先配制好的、工作濃度為4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦和復(fù)方丹參有效成分組合物溶液(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦)，處理1h，然后加入0.5μl濃度為10μg/ml的MIF到細(xì)胞中至工作濃度為50ng/ml誘導(dǎo)36h。

再加入10μl濃度為5mg/ml的MTT溶液(用無(wú)菌PBS配制，pH＝7.4)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl DMSO低速震蕩混勻10min，使結(jié)晶充分溶解。選擇570nm波長(zhǎng)，在Safire酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔光吸收值OD₅₇₀，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

(E)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并混勻，分至96孔細(xì)胞板中，每孔約3000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，然后分別加入100μl預(yù)先配制好的、工作濃度為4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦和復(fù)方丹參有效成分組合物溶液(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦)，處理1h，然后加入0.5μl濃度為10μg/ml的MIF到細(xì)胞中至工作濃度為50ng/ml誘導(dǎo)24h。

用無(wú)EDTA胰酶消化貼壁細(xì)胞1min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打至細(xì)胞脫落。在300g，4℃條件下離心5min，棄上清，收集細(xì)胞。然后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次在300g，4℃條件下離心5min，收集細(xì)胞。根據(jù)AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的操作步驟，加入100μl Binding buffer重懸細(xì)胞，然后加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI Staining Solution，輕輕混勻；避光，室溫反應(yīng)10min。補(bǔ)加400μl Binding buffer混勻，樣品在1小時(shí)內(nèi)用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，Annexin V-FITC在FL1通道檢測(cè)，PI在FL3通道檢測(cè)。運(yùn)用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀自帶的CFlow軟件進(jìn)行分析，繪制單色散點(diǎn)圖，F(xiàn)L1為橫坐標(biāo)，F(xiàn)L3為縱坐標(biāo)。

2.6Western blotting檢測(cè)

蛋白提取

加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并混勻，分至6孔中，每孔約10⁶個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，然后分別加入1ml預(yù)先配制好的、工作濃度為4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦和復(fù)方丹參有效成分組合物溶液(含4μg/ml丹參酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龍腦)，處理30min，然后加入5μl濃度為10μg/ml的MIF到細(xì)胞中至工作濃度為50ng/ml誘導(dǎo)6h。

然后，將培養(yǎng)液吸出，用預(yù)冷的PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)洗一遍，每孔加入500μl胰酶消化1min，加入培液終止消化，將細(xì)胞收集到1.5ml EP管中，1000rpm離心5min；棄上清，再加入1ml預(yù)冷的PBS重懸，同條件離心5min；棄上清，加入80-100μl含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液混勻，置于冰上裂解30min，離心取蛋白上清。

蛋白定量

從BCA試劑盒中取A、B液根據(jù)50:1的比例，配制3ml BCA工作液，并混勻待用，200μl分裝，按表1加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品；

取8μl濃度為5mg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(BSA Standard)與72μl PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)配制成濃度為0.5mg/ml混勻待用；

在96孔板上，按表1方案加入樣品；

表1 BCA蛋白質(zhì)定量加樣方案

置于搖床上，37℃搖30min，充分反應(yīng)；

然后在562nm波長(zhǎng)下，放入酶標(biāo)儀測(cè)OD值，將數(shù)據(jù)制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出每個(gè)樣品的總蛋白量。

目標(biāo)蛋白檢測(cè)

按表2的配方制作SDS-PAGE，待膠凝結(jié)后，將蛋白樣品加至上樣孔中，加入電泳液，在濃縮膠90V、分離膠120V的條件下，分離目的蛋白。電泳結(jié)束后，使用PVDF膜濕轉(zhuǎn)，加入含15％甲醇的預(yù)冷轉(zhuǎn)膜液，置于冰盒中，在300mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置于TBS中洗5min，而后加入含5％脫脂奶粉的1X TBS室溫封閉1h，根據(jù)目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白的大小，裁剪PVDF膜，然后用1X TBST漂洗3次，每次5min。將目標(biāo)蛋白的一抗(1:1000for Bad)或內(nèi)參抗體(1:3000forβ-Actin)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中的比例用含5％的BSA的1X TBST稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，回收一抗，用1X TBST洗滌蛋白膜3次，每次5min；按1:5000的比例用含5％BSA的1X TBST稀釋二抗，室溫孵育1h，回收二抗，用1X TBST洗滌蛋白膜3次，每次5min。使用ECL顯影液，使用Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白的豐度。用Image J v4.7軟件分析蛋白灰度值。

表2分離膠及濃縮膠配方

10％Separation Gel

(F)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。水迷宮的組間逃離潛伏期數(shù)據(jù)使用two-way ANOVA分析，其他數(shù)據(jù)多組間差異使用one-way ANOVA分析，兩兩間差異使用T檢驗(yàn)。結(jié)果p值小于0.05表示比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。