本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種提取物及其制備方法和包含該提取物的化妝品，尤其涉及一種黑米提取物及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：遠(yuǎn)古時(shí)代起，化妝品配方已有本草成分。隨著科學(xué)發(fā)展，目前已有很多新型技術(shù)可用于治療皮膚老化。然而，天然本草產(chǎn)品因其高效低毒等特點(diǎn)仍然具有很大的吸引力和廣闊的市場(chǎng)。研究已證實(shí)越來越多的本草化學(xué)物質(zhì)對(duì)皮膚具有益處，很多提取物和化合物具有顯著的治療皮膚老化的潛力，并已初步闡明其機(jī)制。針對(duì)皮膚老化，天然本草產(chǎn)品的應(yīng)用主要針對(duì)這些目標(biāo)：修復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)；抗細(xì)胞氧化應(yīng)激；抗皮膚細(xì)胞早衰等。萬壽菊花提取物通過抑制透明質(zhì)酸酶彈性蛋白酶MMP-1的活性，抑制皺紋產(chǎn)生，具有光防護(hù)作用。越來越多的證據(jù)表明，抗氧化劑可以預(yù)防甚至改善部分的皮膚老化。海藻糖和深海膠原蛋白兩種海洋活性提取物可提高超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活力。甜杏仁提取物可以通過影響谷胱甘肽和脂質(zhì)過氧化物，從而降低皮膚紫外線照射后的損傷。黑米為黑稻加工產(chǎn)品，屬于糯米類，是由禾本科植物稻經(jīng)長(zhǎng)期培育形成的一類特色品種。黑米呈黑色或黑褐色，營(yíng)養(yǎng)豐富，食用價(jià)值和藥用價(jià)值均很高，素有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美譽(yù)。申請(qǐng)?zhí)?00480011842.1，發(fā)明名稱：利用黑米提取物預(yù)防或治療過敏性疾病的組合物及其治療用途，公開了一種利用黑米提取物預(yù)防或治療過敏性疾病的方法，該黑米提取物能夠顯著地抑制由卵清蛋白誘發(fā)哮喘的小鼠肺中的炎癥。申請(qǐng)?zhí)枮?01410569678.1的發(fā)明專利公開了一種除斑祛痘面膜，其在該面膜中加入了黑米，這樣會(huì)導(dǎo)致如下不良后果：黑米顆粒較大，雜質(zhì)較多，直接將其應(yīng)用在面膜中會(huì)堵塞毛孔，并隨之出現(xiàn)一系列其他問題，如毛囊炎、毛孔粗大、黑頭等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種黑米提取物，并研究了該提取物在化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)方面在于提供一種黑米提取物，所述黑米提取物中包括矢車菊素，所述矢車菊素的含量為0.5％-50％，如3％、8％、35％，優(yōu)選為10％-30％，如20％。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黑米提取物中還包括矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，所述矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量含量為0.5％-50％，如3％、8％、35％，優(yōu)選為10％-30％，如20％。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黑米提取物為液體、膏狀、固體中的任意一種或幾種，優(yōu)選為固體。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黑米提取物的粒度為小于300μm，優(yōu)選為小于200μm，如100μm、50μm等。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黑米提取物中花色苷總質(zhì)量含量為10％-60％。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黑米提取物中花青素總質(zhì)量含量為5％-50％。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黑米提取物可以是水提物、醇提物、油提物、超臨界CO2提取物中的任意一種或幾種的組合。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述醇提物為C1-C6的醇，并優(yōu)選為脂肪醇，更優(yōu)選為一元醇和/或二元醇，如甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇和丁二醇等。本發(fā)明的第二個(gè)方面在于提供一種黑米提取物的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：步驟1、取清潔的黑米粉末，向其中加入5-20體積倍率的溶媒提取，得到提取液；步驟2、將步驟1中得到的提取液經(jīng)濃縮后，得到所述黑米提取物。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中所述溶媒為水，甲醇、乙醇、丙酮及其水溶液，石油醚、苯、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷中的任意一種或幾種組合。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中提取所述黑米粉末的壓力為0.5-1.5MPa，如0.6MPa、1.4MPa；優(yōu)選為0.7-1.2MPa，如0.8MPa、1.1MPa。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述黑米粉末的提取工藝在精餾塔中進(jìn)行，所述精餾塔為填料塔、板式塔的任意一種或幾種組合。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述填料塔的填料為θ環(huán)填料、馬鞍環(huán)填料、玻璃環(huán)填料中的一種或幾種。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述溶媒的進(jìn)料流率為3-10L/min，塔頂?shù)幕亓鞅葹?.1-10。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述提取液經(jīng)濃縮后，還包括純化步驟，所述純化步驟為大孔吸附樹脂純化、高效液相色譜柱純化、層析純化、活性炭吸附和硅膠吸附中的任意一種或幾種組合，優(yōu)選為大孔吸附樹脂純化。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，將提取液濃縮至黑米粉末體積的3-5倍得到濃縮液，將所述第一濃縮液在大孔吸附樹脂中吸附2-4h，吸附過程的pH值＝4-6，溫度為25℃-50℃，優(yōu)選為30℃-40℃，所述大孔吸附樹脂的型號(hào)為AB-8型、D-101、ADS-5中的任意一種或幾種。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，吸附結(jié)束后，采用體積含量為0-95％的乙醇溶液洗脫，乙醇溶液的流速為2-4BV/h，所述乙醇溶液的濃度可以為5％、30％、50％、80％、90％等。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述噴霧干燥過程中，高壓泵在80-120MPa壓力下將所述過濾液通過霧化器形成100-200μm的顆粒，與所述顆粒接觸的熱空氣的溫度為60-100℃，接觸時(shí)間為5-50s。本發(fā)明的第三個(gè)方面在于提供上述任意一種黑米提取物的應(yīng)用。所述黑米提取物優(yōu)選為施用于皮膚外表面，更優(yōu)選為應(yīng)用于制備涂覆于皮膚外表面的制品。其中，本發(fā)明所述黑米提取物應(yīng)用于制備日化用品，優(yōu)選為應(yīng)用于制備化妝品和/或護(hù)膚品。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品和/或護(hù)膚品中，所述黑米提取物的含量為0.001％-50％，如0.003％，40％，優(yōu)選為0.005％-30％，如0.008％，20％，更優(yōu)選為0.01％-10％。本發(fā)明的第四個(gè)方面在于提供一種包含上述任意一種黑米提取物的日化用品，優(yōu)選為包含上述任意一種黑米提取物的化妝品和/或護(hù)膚品，更優(yōu)選為所述化妝品和/或護(hù)膚品中，優(yōu)選為化妝品和/或護(hù)膚品中，還可以包括營(yíng)養(yǎng)性添加劑。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述營(yíng)養(yǎng)性添加劑可以為可用于化妝品和/或護(hù)膚品的任意一種或幾種添加劑的組合，如蜂蜜、煙酰胺、乳清酸、蘆薈苷、甘氨酸等。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品和/或護(hù)膚品中，所述黑米提取物的含量為0.001％-50％，如0.003％，40％，優(yōu)選為0.005％-30％，如0.008％，20％，更優(yōu)選為0.01％-10％。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品和/或護(hù)膚品中，還可以根據(jù)不同的需要，調(diào)整化妝品的配方，常用于化妝品的各種組分均可用于本發(fā)明，如角鯊烯等液狀油，蜂蠟醇等固狀油，各種活性劑，甘油，丁二醇等保濕劑。本發(fā)明提供的黑米提取物，活性成分的含量高，除了具有美白作用外，還具有良好的抗衰老能力，能夠通過促進(jìn)膠原蛋白的分泌，保持皮膚彈性；能夠去除人體細(xì)胞中的自由基，進(jìn)而起到抗衰老的效果，可以作為一種復(fù)合型添加劑加入到護(hù)膚品中。附圖說明圖1為自然狀態(tài)下黑米提取物對(duì)HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響；圖2為過氧化氫對(duì)細(xì)胞存活率的影響；圖3為黑米提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響；圖4為黑米提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響；圖5為黑米提取物對(duì)DPPH清除率的影響；圖6為黑米提取物對(duì)透明質(zhì)酸含量的影響；圖7為黑米提取物對(duì)過氧化氫損傷的HaCat細(xì)胞LOR含量的影響；圖8為黑米提取物對(duì)過氧化氫損傷的HaCat細(xì)胞AQP3含量的影響；圖9為黑米提取物對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響。具體實(shí)施方式黑米提取物的制備實(shí)施例一取10kg干燥的黑米，去離子水洗滌兩遍后熱風(fēng)吹干，粉碎，并過80目篩，將過篩后的黑米加入到塔釜體積為150L、裝有直徑為5mmθ環(huán)的精餾塔中，精餾塔的理論塔板數(shù)為20。進(jìn)料口設(shè)在第5層，自進(jìn)料口向塔釜加入100L去離子水，浸泡2h，調(diào)節(jié)精餾塔壓力至0.8MPa，塔釜加熱煮沸，并保持沸騰2h，設(shè)定塔頂回流比為5，進(jìn)料口的流量為3L/min，塔釜連續(xù)采出提取液，塔頂采出的去離子水返回溶媒槽循環(huán)使用。提取液在5kPa、30℃濃縮至原體積的20％，得到濃縮液。調(diào)節(jié)濃縮液pH值＝3，將提取液采用D-101型大孔吸附樹脂吸附至飽和，然后使用去離子水、30％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液梯度洗脫，常溫、常壓洗脫大孔吸附樹脂，10KPa、45℃下減壓濃縮，回收其中的乙醇，純化后的濃縮液即得到黑米提取物，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀分析可知，該黑米提取物中矢車菊素的質(zhì)量含量為3％，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量含量為5％，花色苷總質(zhì)量含量為10％，花青素的總質(zhì)量含量為8％。液相色譜的分析條件為：乙腈：0.2％磷酸＝12：88，檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，C18色譜柱。實(shí)施例二取10kg干燥的黑米，去離子水洗滌兩遍后熱風(fēng)吹干，粉碎，并過60目篩，將過篩后的黑米加入到塔釜體積為250L、裝有直徑為5mmθ環(huán)的精餾塔中，精餾塔的理論塔板數(shù)為15。進(jìn)料口設(shè)在第7層，自進(jìn)料口向塔釜加入200L70％甲醇溶液，浸泡2h，塔釜加熱煮沸，并保持沸騰2h，設(shè)定塔頂回流比為5，進(jìn)料口的流量為5L/min，塔釜連續(xù)采出提取液，塔頂采出的甲醇返回溶媒槽循環(huán)使用。調(diào)節(jié)提取液pH值＝4，采用ADS-5大孔吸附樹脂吸附至飽和，分別使用去離子水、20％乙醇水溶液、50乙醇水溶液于50℃洗脫大孔吸附樹脂，混合每次的洗脫液，10KPa、45℃下減壓濃縮洗脫液，回收其中的乙醇，濃縮液經(jīng)噴霧干燥后得到黑米提取物，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀分析可知，該黑米提取物中矢車菊素的質(zhì)量含量為10％，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量含量為5％，花色苷總質(zhì)量含量為10％，花青素的總質(zhì)量含量為8％。液相色譜的分析條件為：乙腈：0.2％磷酸＝12：88，檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，C18色譜柱。實(shí)施例三取10kg干燥的黑米，去離子水洗滌兩遍后熱風(fēng)吹干，粉碎，并過80目篩，將過篩后的黑米加入到提取塔中，然后向其中加入50L去離子水，浸泡2h，在1.1MPa壓力下加熱煮沸，并保持沸騰2h，得到提取液一，然后向剩余殘?jiān)屑尤?00L三氯甲烷，在1.1MPa壓力下加熱煮沸，并保持沸騰2h，得到提取液二，混合提取液一與提取液二，分別濃縮提取液一和提取液二至加入體積的30％，然后將濃縮后的提取液一、提取液二分別使用ADS-5大孔吸附樹脂吸附至飽和，然后分別使用去離子水、30％乙醇溶液、60％乙醇溶液洗脫大孔吸附樹脂，混合洗脫液，并于10KPa、45℃下減壓濃縮，回收其中的乙醇，濃縮液在70℃電加熱干燥后得到黑米提取物，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀分析可知，該黑米提取物中矢車菊素的質(zhì)量含量為20％，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量含量為10％，花色苷總質(zhì)量含量為30％，花青素的總質(zhì)量含量為40％。液相色譜的分析條件為：乙腈：0.2％磷酸＝12：88，檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，C18色譜柱。對(duì)比實(shí)施例取10kg粉碎過60目篩的黑米粉，加入一定量蒸餾水，70℃糊化5min后，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)酶解pH值＝6.0，分別加入纖維素酶240U/g黑米，α-淀粉酶28U/g黑米，在料液比1：20、溫度50℃條件下進(jìn)行磁力攪拌酶解60min。滅酶后再5000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，收集上層清液旋轉(zhuǎn)濃縮，凍干得黑米花色苷產(chǎn)品，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀分析可知，該黑米提取物中矢車菊素的質(zhì)量含量為15％，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量含量為20％，花色苷總質(zhì)量含量為35％，花青素的總質(zhì)量含量為30％。。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷一般以鹽酸鹽的形式保存或使用，其鹽酸鹽結(jié)構(gòu)如下：黑米提取物對(duì)HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞存活率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、濃度為105個(gè)/mL的人HDF細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞液100μL。最終所鋪的細(xì)胞孔數(shù)取決于樣品數(shù)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。將終濃度為1mg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL的黑米提取物加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，向?qū)φ战M加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。于37℃、包含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h。然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTT100μL，于37℃、包含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中黑暗條件下孵育4h。去除上清液，加入150μLDMSO，震蕩以570nm為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)，630nm為參照波長(zhǎng)，檢測(cè)吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果如表1所示：表1，黑米提取物對(duì)人HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞存活率的影響以細(xì)胞存活率高于80％為對(duì)人HDF細(xì)胞和Hacat細(xì)胞無毒的標(biāo)準(zhǔn)，由表1可知，本發(fā)明提供的黑米提取物對(duì)人HDF細(xì)胞無毒的最高濃度為0.1mg/mL，本發(fā)明提供的黑米提取物對(duì)人Hacat細(xì)胞無毒的最高濃度為0.1mg/mL，因此，確定黑米提取物濃度0.1mg/mL為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)濃度。黑米提取物的抗衰老性能自然狀態(tài)下黑米提取物對(duì)HDF膠原蛋白分泌的影響為了考察本發(fā)明提供的黑米提取物對(duì)HDF膠原蛋白分泌的影響，本實(shí)施例將試驗(yàn)分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、濃度為105個(gè)/mL細(xì)胞，每孔100μL，于37℃、含有CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度離心10min，取上清液。向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50μL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒?yàn)組中加入10μL上清液和40μL本發(fā)明提供的黑米提取物的稀釋液，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入10μL上清液和40μL對(duì)比實(shí)施例提供的黑米提取物的稀釋液，空白組中不加樣品，分別于37℃孵育1h，并洗板5次，每組樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。向四組樣品中分別加入生物素標(biāo)記的抗-lgG抗體50μL，于37℃溫育30min，洗滌5次。向四組樣品中分別加入50μL的鏈霉素和素-HRP，輕輕震蕩混勻，于37℃溫育30min，洗滌5次。向四組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μL，輕輕震蕩混勻，于37℃避光孵育30min，向四組樣品中加入終止液50μL。以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各組的吸光度，結(jié)果如表2和圖1所示。表2，黑米提取物對(duì)HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響組別I型膠原蛋白含量(％)實(shí)驗(yàn)組120.85對(duì)照實(shí)驗(yàn)組103.26空白組100膠原蛋白主要包括I型膠原和III型膠原，外界誘導(dǎo)促使真皮細(xì)胞中氧化水平提高是細(xì)胞損傷的主要因素，氧化水平提高的直接結(jié)果是降低了I型膠原蛋白的表達(dá)及I型膠原蛋白被基質(zhì)金屬蛋白酶MPP-1降解，兩種情況造成的結(jié)果均為I型膠原蛋白在皮膚中的含量減少，而I型膠原蛋白含量減少是皮膚形成皺紋的主要原因。由表2和圖1可知，向HDF細(xì)胞中添加本發(fā)明提供的濃度為0.1mg/mL黑米提取物后，皮膚中的I型膠原蛋白含量為120.85％，現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物中，I型膠原蛋白的含量為103.26％，說明本發(fā)明提供的黑米提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物能夠更加顯著的促進(jìn)I型膠原蛋白的表達(dá)，是潛在的抗老化添加劑。過氧化氫對(duì)HDF細(xì)胞存活率的影響選取不同濃度的過氧化氫，如50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM和1000μM，與HDF細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間，如3h、6h和9h等，采用MTT法檢測(cè)不同濃度的過氧化氫對(duì)HDF細(xì)胞存活率的影響。取培養(yǎng)至濃度為105個(gè)/mL的HDF細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL。于37℃、含有CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h，每板做復(fù)孔3個(gè)。使用不同濃度的過氧化氫分別孵育造模3h、6h和9h；向每個(gè)樣品孔中加入濃度為0.5mg/mL的MTT100μL，于37℃、含有CO2的培養(yǎng)箱中，黑暗條件下孵育4h。去除上清液，向樣品中加入150μLDMSO，震蕩，以570nm為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)，630nm為參照波長(zhǎng)，檢測(cè)每個(gè)樣品的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。測(cè)試結(jié)果如圖2所示，人HDF細(xì)胞于濃度為50-800μM的過氧化氫共孵育3-9h后，人HDF細(xì)胞的存活率明顯下降，當(dāng)孵育濃度超過400μM時(shí)，細(xì)胞存活率低于50％。200μM過氧化氫作用6h后，細(xì)胞存活率降到70％。黑米提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響取培養(yǎng)至密度為105個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL。于37℃，含有CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h，加入本發(fā)明提供的黑米提取物，利用過氧化氫損傷建模。向每孔加入0.5mg/mL的MTT100μL，于37℃、5％CO2的黑暗條件下孵育4h。去除上清液，加入DMSO150μL，震蕩檢測(cè)吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率，并以供試物不同濃度和細(xì)胞的存活率作圖。結(jié)果如圖3所示，經(jīng)過過氧化氫孵育后，HDF細(xì)胞的存活率降低至70％以下，如陰性對(duì)照組所述，向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的黑米提取物后，人HDF細(xì)胞的存活率達(dá)到92％，而向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入對(duì)比實(shí)施例制備的黑米提取物后，人HDF細(xì)胞的存活率為80％，明顯低于本發(fā)明提供的黑米提取物對(duì)受損細(xì)胞I型膠原蛋白的分泌能力，即本發(fā)明提供的黑米提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物能夠顯著減輕過氧化氫對(duì)HDF細(xì)胞的損傷。黑米提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞分泌膠原蛋白的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、濃度為105個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1mL。于37℃、含有CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。向?qū)嶒?yàn)組加入本發(fā)明提供的黑米提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組加入對(duì)比實(shí)施例制備的黑米提取物，空白組和陰性對(duì)照組不加樣品。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組利用過氧化氫損傷建模。小心收集每孔中的上清培養(yǎng)液，離心，按照ELISA試劑盒說明書，取細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以空白孔調(diào)零，反應(yīng)終止15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的吸光度值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)組的吸光度，利用回歸方程計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組中對(duì)應(yīng)的I型膠原蛋白的分泌量。表3，黑米提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞分泌膠原蛋白的影響組別I型膠原蛋白含量(％)空白組100陰性對(duì)照組74實(shí)驗(yàn)組83對(duì)照實(shí)驗(yàn)組76結(jié)果如表3和圖4所示，經(jīng)過過氧化氫損傷后，HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌量變?yōu)槲磽p傷時(shí)的74％，如陰性對(duì)照組所示。而向經(jīng)過過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的黑米提取物后，人HDF細(xì)胞中I型膠原蛋白的含量達(dá)到83％。而向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物后，人HDF細(xì)胞中I型膠原蛋白的含量為76％，明顯低于加入本發(fā)明提供的黑米提取物后人HDF細(xì)胞中I型膠原蛋白的含量，即本發(fā)明提供的黑米提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物，具有優(yōu)良的修復(fù)細(xì)胞損傷的能力，能夠顯著修復(fù)過氧化氫對(duì)HDF細(xì)胞造成的損傷，是優(yōu)良的抗衰老化妝品添加劑。黑米提取物對(duì)DPPH自由基的影響1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，它的穩(wěn)定性主要來自3個(gè)苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用及空間障礙，使夾在中間的氮原子上不成對(duì)的電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對(duì)作用。作為一種穩(wěn)定的自由基，其可以清除其他的自由基。目前廣泛用于定量測(cè)定生物試樣和食品的抗氧化能力。此法是根據(jù)DPPH自由基有單電子，在517nm處有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析。測(cè)試步驟用無水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存，配置0.01mg/mL的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)溶液。向?qū)嶒?yàn)組添加20uL濃度為0.01mg/mL本發(fā)明提供的黑米提取物溶液和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白組1中添加180uL無水乙醇與20uL本發(fā)明提供的黑米提取物溶液，向標(biāo)準(zhǔn)組中添加180uLDPPH溶液與20uL蒸餾水，每孔設(shè)置至少3個(gè)復(fù)孔，分別搖勻，室溫下暗處靜置30min，測(cè)定各組的吸光度。向?qū)φ赵囼?yàn)組添加20uL濃度為0.01mg/mL采用現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物溶液和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白組2中添加180uL無水乙醇與20uL采用現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物溶液，每孔設(shè)置至少3個(gè)復(fù)孔，分別搖勻，室溫下暗處靜置30min，測(cè)定各組的吸光度。DPPH自由基的清除能力按下式表示：其中，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的DPPH清除率時(shí)，測(cè)試樣吸光度為實(shí)驗(yàn)組的吸光度，空白組吸光度分別為空白組1的吸光度；計(jì)算對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的DPPH清除率時(shí)，測(cè)試樣吸光度為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的吸光度，空白組吸光度為空白組2的吸光度；清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)溶液中不存在DPPH自由基時(shí)，空白組的DPPH清除率為0，EGCG對(duì)DPPH自由基的去除率為47.23％，本發(fā)明提供的黑米提取物對(duì)DPPH自由基的去除率為98.35％，采用現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物對(duì)DPPH自由基的去除率為53.82％，說明本發(fā)明制備的黑米提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有更優(yōu)異的DPPH清除率。綜上，本發(fā)明提供的黑米提取物具有優(yōu)異的抗衰老和修復(fù)受損細(xì)胞的能力，可以作為抗衰老添加劑加入到化妝品中。黑米提取物的保濕性能皮膚內(nèi)水分的含量的多少，直接影響皮膚的彈性、光澤度等，皮膚的表皮、真皮、皮下組織均對(duì)皮膚維持水分起著不同的作用。在皮膚保濕過程中，主要有兩種機(jī)制影響皮膚對(duì)水的維持作用：1)皮膚作為天然屏障，避免水分流失；皮膚表皮是人的天然屏障，其中透明層、顆粒層和角質(zhì)層對(duì)皮膚鎖水能力起到重要作用。透明層含有磷脂類物質(zhì)和角質(zhì)蛋白，能夠防止水分及電解質(zhì)等透過皮膚。顆粒層的細(xì)胞排列致密，對(duì)貯存水分、防止水分滲透具有重要的作用。角質(zhì)層是由角質(zhì)形成細(xì)的堅(jiān)韌、有彈性的板層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白。2)皮膚中存在許多保濕因子，吸收和鎖住水分。黑米提取物對(duì)透明質(zhì)酸(HA)分泌的影響在皮膚真皮層中，透明質(zhì)酸(HA)是含量較多的氨基多糖，HA粘稠度極高且能高比例地結(jié)合水分子，HA的含量直接影響皮膚中水分的含量。作為皮膚內(nèi)重要的保濕成分，它對(duì)皮膚細(xì)胞的增殖、分化有顯著作用，對(duì)維持皮膚細(xì)胞的正常新陳代謝至關(guān)重要。本測(cè)試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的濃度為105個(gè)/mL的人HDF細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔細(xì)胞液1mL，于37℃、含有CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。向?qū)嶒?yàn)組1細(xì)胞液中加入本發(fā)明提供的黑米提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組細(xì)胞液中加入對(duì)比實(shí)施例提供的黑米提取物，置于37℃、含有5％CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h；小心收集上清培養(yǎng)基，離心后得到上清液，備用。向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50μL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒?yàn)組中加入10μL上清液和40μL本發(fā)明提供的黑米提取物的稀釋液，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入10μL上清液和40μL對(duì)比實(shí)施例提供的黑米提取物的稀釋液，空白組中不加樣品，分別于37℃孵育1h，并洗板5次。向四組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μL，于37℃避光孵育30min，向四組樣品中加入終止液50μL。以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各組的吸光光度值，并根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞液中HA的含量，結(jié)果如表4和圖6所示。表4，黑米提取物對(duì)HA分泌的影響組別HA含量(％)實(shí)驗(yàn)組86.55對(duì)照實(shí)驗(yàn)組78.32空白組100由表4和圖6可知，添加本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物后，人HDF細(xì)胞中HA含量均比未添加黑米提取物時(shí)的含量有所降低，且相對(duì)于本發(fā)明提供的黑米提取物，加入現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物后，HDF細(xì)胞中HA的含量降低的更多。黑米提取物對(duì)HaCat細(xì)胞兜甲蛋白(LOR)表達(dá)的影響角質(zhì)層是由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成的堅(jiān)韌有彈性的板層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白。角蛋白是非水溶性的硬蛋白，有阻止化學(xué)物質(zhì)內(nèi)滲和體液外滲的作用，其中含量最高的角蛋白叫做兜甲蛋白，約占角蛋白的80％，兜甲蛋白的含量會(huì)直接影響皮膚水分的流失狀況。本試驗(yàn)通過考察HaCat細(xì)胞兜甲蛋白(LOR)的表達(dá)來考察本發(fā)明提供的黑米提取物的保濕性能。本測(cè)試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照試驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的濃度為105個(gè)/mL的HaCat細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔細(xì)胞液1mL，于37℃、含有CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。向?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞液中加入一定量本發(fā)明提供的黑米提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組細(xì)胞液中加入一定量對(duì)比實(shí)施例提供的黑米提取物，空白組不加樣品，置于37℃、含有5％CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h。棄除上清液，用預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞兩次，在培養(yǎng)孔中加入100μL裂解液，冰上裂解細(xì)胞10min，收集細(xì)胞裂解液，以13000rpm離心10min，取上清液備用。按照ELISA試劑盒說明書，取細(xì)胞裂解液進(jìn)行試驗(yàn)；利用BCA試劑盒檢測(cè)不同組別蛋白質(zhì)含量，各組LOR表達(dá)量采用蛋白量矯正，結(jié)果如表5和圖7所示。表5，黑米提取物對(duì)LOR表達(dá)的影響組別LOR含量(％)實(shí)驗(yàn)組149.71對(duì)照實(shí)驗(yàn)組118.69空白組100由表5和圖7可知，添加本發(fā)明提供的黑米提取物后，人HaCat細(xì)胞中LOR含量比不添加黑米提取物時(shí)高出近50％，添加現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物后，人HaCat細(xì)胞中LOR含量為不添加黑米提取物時(shí)的18％，說明本發(fā)明提供的黑米提取物保濕性比現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物的保濕性好。黑米提取物對(duì)HaCat細(xì)胞水通道蛋白3(AQP3)表達(dá)的影響在皮膚細(xì)胞中，內(nèi)源性甘油的吸收、分布以及隨后的水分的分布主要由AQP3介導(dǎo)，通過改變細(xì)胞膜兩端的滲透壓，AQP3增加了細(xì)胞膜雙向的滲透性，有助于一系列小分子的轉(zhuǎn)移。隨著內(nèi)源甘油被AQP3吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，甘油也成為皮膚中水的容器，起到保濕效果。因此，AQP3的含量可以間接反映皮膚中水分的含量。為了考察本發(fā)明提供的黑米提取物對(duì)HaCat細(xì)胞AQP3表達(dá)的影響，本發(fā)明分為空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。試驗(yàn)方法與兜甲蛋白表達(dá)的試驗(yàn)方法相同。表6，黑米提取物對(duì)AQP3表達(dá)的影響組別AQP3含量(％)實(shí)驗(yàn)組122.78對(duì)照實(shí)驗(yàn)組106.59空白組100由表6和圖8可知，本發(fā)明提供的黑米提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物，能夠明顯提高HaCat細(xì)胞AQP3的表達(dá)，說明本發(fā)明提供的黑米提取物保濕性比現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物的保濕性好。黑米提取物的美白作用酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通過抑制酪氨酸酶的活性，可以減少黑素的生成，酪氨酸酶活性檢測(cè)方法有：放射性同位素法、免疫學(xué)法和生化酶學(xué)法，以生化酶學(xué)法較為簡(jiǎn)單成熟。生化酶學(xué)法測(cè)定酪氨酸酶活性抑制的原理是：酪氨酸或多巴酸在酪氨酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為多巴醌，通過比色法測(cè)定判斷酪氨酸酶活性的抑制率，該方法通過體外測(cè)定酪氨酸酶的活性，簡(jiǎn)單快捷。材料與試劑蘑菇酪氨酸酶PH值＝6.8的磷酸鹽緩沖液左旋多巴(L-DOPA)200μL吸頭96孔板8通道加樣槍酶標(biāo)儀操作步驟測(cè)定本發(fā)明提供的黑米提取物的酪氨酸酶抑制作用本測(cè)試分為空白組、空白參照組、實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)參照組。配制質(zhì)量濃度為0.1％的L-DOPA水溶液，配制pH值＝6.8的磷酸鹽緩沖溶液。向?qū)嶒?yàn)組中加入5μL濃度為0.1mg/mL的本發(fā)明提供的黑米提取物，向?qū)嶒?yàn)參照組中加入5μL濃度為0.1mg/mL的本發(fā)明提供的黑米提取物和45μLpH值＝6.8的磷酸鹽緩沖溶液，向空白參照組加入5μL蘑菇酪氨酸酶的磷酸鹽溶液，和45μLpH值＝6.8的磷酸鹽緩沖溶液，向空白組加入50μLpH值＝6.8的磷酸鹽緩沖溶液。置于37℃空氣浴中20min，向每孔加入50μL、質(zhì)量濃度為0.1％的L-DOPA水溶液，于37℃空氣浴中靜置20min，于475nm下測(cè)定每組的吸光度值，并計(jì)算本發(fā)明提供的黑米提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的活性抑制率。采用相同的測(cè)試方法計(jì)算采用對(duì)比實(shí)施例(現(xiàn)有技術(shù))制備的黑米提取物以及陽性對(duì)照組曲酸對(duì)酪氨酸酶的抑制率。結(jié)果如圖9所示，本發(fā)明提供的黑米提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制率為49.40％，采用現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制率為58.23％，說明本發(fā)明提供的黑米提取物具有優(yōu)異的美白作用，可以作為添加劑添加到化妝品中。綜上所述，本發(fā)明提供的黑米提取物，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備的黑米提取物，具有更優(yōu)越的抗衰老、去除自由基的能力，而且具有良好的美白效果和保濕性能，可以作為化妝品添加劑加入到化妝品中。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3