本發(fā)明涉及藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療白癜風(fēng)的高良姜素外用制劑。
背景技術(shù)：
高良姜素是姜科植物高良姜中的有效成分之一，在樺木科植物中的垂榿木、雄花，車前草科植物中的大車前葉，唇形科植物中的并頭草等中也含量大量的高良姜素。課題組前期首次發(fā)現(xiàn)高良姜具有抗白癜風(fēng)的功效(高良姜有效部位在制備治療白癜風(fēng)的藥物的用途,閆明,霍仕霞,高莉,康雨彤,唐曉琴.專利號(hào)：ZL201010122088.6)，并進(jìn)一步分離制備，確認(rèn)高良姜素是高良姜治療白癜風(fēng)的主要作用物質(zhì)之一；同時(shí)對(duì)高良姜素進(jìn)行了體內(nèi)體外藥效考察，結(jié)果表明高良姜素具有治療白癜風(fēng)的作用，并且通過(guò)皮膚給藥的藥效優(yōu)于口服給藥。此外，經(jīng)皮給藥制劑具有超于一般給藥方法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，可以避免口服給藥生物利用度。本發(fā)明將高良姜素制備成外用制劑，使其通過(guò)經(jīng)皮給藥更有效地用于治療白癜風(fēng)，增強(qiáng)藥效，提高患者的適應(yīng)性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種高良姜素的外用制劑及用途，該制劑由高良姜素與透皮吸收促進(jìn)劑、透皮吸收載體或藥用輔料制成外用劑型：軟膏劑、貼劑、酊劑、油劑、凝膠劑、氣霧劑、巴布劑、洗劑、搽劑、膜劑或涂膜劑。研究表明，高良姜素可用于白癜風(fēng)的治療。本發(fā)明所述的高良姜素外用制劑可直接作用于患處皮膚表面，并能透過(guò)表皮角質(zhì)層進(jìn)入真皮層，直接作用于病灶部位，與高良姜素其他給藥途徑相比，可大大增加高良姜素在患處皮膚中的藥量，提高療效，減少給藥劑量。本發(fā)明提供了一種高良姜素外用制劑，具有給藥方便，靶向性強(qiáng)，無(wú)皮膚刺激性且制備簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于白癜風(fēng)的治療。
本發(fā)明所述的一種高良姜素外用制劑，所述制劑由高良姜素與透皮吸收促進(jìn)劑、透皮吸收載體或藥用輔料制成外用劑型：軟膏劑、貼劑、酊劑、油劑、凝膠劑、氣霧劑、巴布劑、洗劑、搽劑、膜劑或涂膜劑，其中高良姜素的重量百分比為0.1-30％。
所述的高良姜素外用制劑在制備治療白癜風(fēng)的外用藥物中的用途。
本發(fā)明所述的一種高良姜素的外用制劑及用途，該制劑中的高良姜素是采用中國(guó)專利2010101220886中獲得的，具體操作按下列步驟進(jìn)行：
a、以植物高良姜根莖為原料，用50－95％濃度的乙醇提取3次，料液比為10倍，8倍，8倍，提取溫度60－80℃，每次時(shí)間為2，2，1小時(shí)，得到總粗提物；
b、再將總粗提物用體積百分比30-60％乙醇溶解，用大孔樹脂、聚酰胺或者葡聚糖凝膠吸附，用體積百分比40％-70％乙醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，干燥，即得含高良姜素有效部位，以干品重量計(jì)算含總黃酮大于50％，用制備液相色譜儀制備得到高良姜素的含量為20-99.8％；
或?qū)⒉襟Ea總粗提物用石油醚、乙酸乙酯或氯仿溶劑進(jìn)行萃取，所得萃取物干燥后得到脂溶性產(chǎn)物，再用體積百分比30-60％乙醇溶解，用大孔樹脂、聚酰胺或者葡聚糖凝膠吸附，用體積百分比40％-70％乙醇洗脫，收集洗脫液；將洗脫液減壓濃縮，干燥，即得含高良姜素有效部位，以干品重量計(jì)算含總黃酮大于50％，用制備液相色譜儀制備得到高良姜素的含量為20-99.8％。
具體實(shí)施方式
為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1(軟膏劑)
處方：
制法：將硬脂酸甘油酯80g、硬脂酸80g、白凡士林100g、羊毛脂80g、二甲基硅油100g加熱熔化為油相，另將甘油100g和蒸餾水450mL加熱至溫度90℃，再加入十二烷基硫酸鈉20g及羥苯乙酯1g溶解為水相；將水相緩緩倒入油相中，邊攪拌，冷凝備用；將高良姜素30g細(xì)粉(過(guò)120目藥篩)，加入冷凝基質(zhì)中，攪拌均勻，即得高良姜素軟膏劑。
實(shí)施例2(貼劑)
處方：
制法：將高良姜素18g溶解于體積比70:30的氯仿:丙酮中，分散于乙烯-醋酸乙烯共聚物中，形成膠狀液，再涂布于柔軟的聚酯-聚乙烯復(fù)合背襯材料層上，以丙烯酸10g為壓敏膠，外覆蓋防粘層，切割，包裝而成高良姜素貼劑。
實(shí)施例3(酊劑)
處方：
高良姜素1g，濃度為75％乙醇加至1000mL；
制法：將高良姜素1g溶解于濃度為75％乙醇1000mL中，調(diào)體積至1000mL，即得高良姜素酊劑。
實(shí)施例4(油劑)
處方：
制法：將高良姜素12g與液體石蠟100g研和均勻后，加入蓖麻油888g，混勻，即得高良姜素油劑。
實(shí)施例5(凝膠劑)
處方：
制法：先將羥丙甲基纖維素20g用乙醇100mL溶解后加蒸餾水至1000mL，加熱制成溶膠液，再將高良姜素8g溶于丁羥基甲苯10g和異丙醇30mL中，然后加入溶膠液中，攪勻，冷卻后，即得高良姜素凝膠劑。
實(shí)施例6(氣霧劑)
處方：
制法：將高良姜素25g加入三氯叔丁醇50mL中溶解備用，再將輔料三氯叔丁醇50mL、甘油1.5g、醋酸1g、醋酸鈉2g、檸檬酸5g、山梨醇50g用蒸餾水溶解后，攪拌均勻，并濾過(guò)澄明，再將高良姜素三氯叔丁醇溶液在攪拌下緩慢加入輔料溶液，最后加入羥丙基纖維素20g溶解，加蒸餾水至1000mL，攪勻，灌裝于具手動(dòng)泵的氣霧瓶中，即得高良姜素氣霧劑。
實(shí)施例7(巴布劑)
處方：
制法：用3倍量甘油將卡波姆充分浸潤(rùn)過(guò)夜，加入蒸餾水制成濃度3％的卡波姆凝膠，以三乙醇胺調(diào)節(jié)凝膠至pH為7.0±0.2，充分研勻(Ⅰ)；常規(guī)方法制備甘油明膠(Ⅱ)；以12mL蒸餾水溶解聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，制成濃度為50％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液(Ⅲ)，將已過(guò)100目篩的高良姜素粉末與Ⅰ混合，研和均勻，加入事先制備好的氮酮-丙二醇，充分研勻，然后加入到已在溫度60℃水浴上預(yù)熱混勻的Ⅱ和Ⅲ混合物中，用力研和，使成均一膏體，另取容器將薄荷腦、樟腦研磨形成低共熔物與均一膏體迅速混合，快速研勻，鋪涂于無(wú)紡布背襯上，適當(dāng)加壓，使成0.25g/cm2，置溫度45-50℃下干燥至膏體，重量為0.10g/cm2，取出，覆蓋聚乙烯膜，裁成塊，包裝，即得高良姜素巴布劑。
實(shí)施例8(洗劑)
處方：
制法：將三乙醇胺5g與油酸20g混合后，加高良姜素30g混勻，移入約500mL瓶中，加約250mL蒸餾水振搖乳化，最后再加蒸餾水至全量，搖勻即得高良姜素洗劑。
實(shí)施例8(搽劑)
處方：
制法：取高良姜素20g、樟腦10g溶于乙醇200mL中，濾過(guò)，加二甲基亞砜100mL、丙二醇至1000mL，攪勻即得高良姜素搽劑。
實(shí)施例9(膜劑)
處方：
制法：將聚乙烯醇17-88加入甘油5g、吐溫80 1g和水中充分膨脹后，加熱使完全溶解；另取高良姜素10g與薄荷腦用乙醇溶解，并在攪拌下緩緩加至25g聚乙烯醇17-88溶液中，再加入蒸餾水至1000mL，攪勻后，迅速分裝，密閉，即得高良姜素膜劑。
實(shí)施例10(涂膜劑)
處方：
制法：將聚乙烯醇124、明膠分別4倍量蒸餾水浸泡，于水浴上加熱溶解，再加入羧甲基纖維素鈉溶解后；甘油和丙酮混合后溶解高良姜素，再將藥液與各基質(zhì)混勻后，加水至1000mL，密閉，即得高良姜素涂膜劑。
實(shí)施例11
高良姜素口服給藥與經(jīng)皮給藥后藥效比較：
1試驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)常規(guī)材料；
2實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果：
2.1肉眼觀察結(jié)果：造模1-6天時(shí)，造模組小鼠皮膚由灰色逐漸變?yōu)榉奂t色；造模9-18天時(shí)，受試區(qū)皮膚毛囊緩慢進(jìn)入生長(zhǎng)期，受試區(qū)皮膚呈粉紅色或泛白，長(zhǎng)出大量白色毛發(fā)；造模21-25天時(shí)，受試區(qū)皮膚毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期，新毛發(fā)長(zhǎng)出速度較正常組慢，受試區(qū)皮膚泛灰。
2.2酪氨酸酶(TYR)含量：用酪氨酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制酪氨酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸曲線，獲得回歸方程，對(duì)各組給藥結(jié)束后，小鼠眼眶取血，取小鼠血清，測(cè)定酪氨酸酶含量，具體步驟：
(1)按酪氨酸酶試劑盒說(shuō)明書操作于酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定吸光度值，繪制酪氨酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸曲線，得回歸方程；
(2)按酪氨酸酶試劑盒說(shuō)明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)溶液改為血清，于酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定吸光度值，帶入回歸方程，獲得酪氨酸酶含量。
結(jié)果見(jiàn)表1：
由小鼠血清中TYR含量測(cè)定結(jié)果可知：與正常組相比，模型組TYR含量顯著性降低(P<0.01)，無(wú)性別差異；與模型組相比，各給藥組TYR含量顯著性升高(P<0.01或P<0.05)；與口服給藥組相比皮膚給藥組TYR含量升高較為顯著(P<0.01或P<0.05)。
表1 高良姜素口服給藥和皮膚給藥后對(duì)血清TYR含量的影響
[注]*表示P＜0.05，**表示P＜0.01(與模型組比較)；表示△P＜0.05，△△表示P＜0.01(與口服組比較)，下同。
2.3對(duì)小鼠皮膚含黑色素毛囊計(jì)數(shù)的影響：
HE染色后，進(jìn)行皮膚組織學(xué)觀察、毛囊計(jì)數(shù)，用光鏡觀察50個(gè)毛囊，計(jì)算其中有黑色素的毛囊數(shù)。結(jié)果各給藥組均能模型小鼠皮膚中黑色素毛囊數(shù)量的增多，皮膚高劑量給藥組促進(jìn)作用與口服給藥相比，有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表2；
表2 高良姜素口服給藥和皮膚給藥后對(duì)皮膚含黑色素毛囊計(jì)數(shù)的影響
[注]“+++”示90以上有黑色素；“++”示1/2以上有黑色素；“+”示1/3～1/2有黑色素；“±”示偶見(jiàn)黑色素。
2.4對(duì)基底層黑素細(xì)胞(MC)的影響：
用蘇木素-伊紅對(duì)比染色，脫水，透明，中性樹膠封固，Dopa-氧化酶染色后，黑素細(xì)胞陽(yáng)性顯示為棕黑色染色，分別于光鏡下測(cè)定每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)各組MC數(shù)量，每個(gè)標(biāo)本觀察10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算每100個(gè)表皮基底細(xì)胞中MC的平均數(shù)量，用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；結(jié)果各給藥低劑量組均能促進(jìn)小鼠基底層黑素細(xì)胞的的增殖，但高劑量組對(duì)雌性小鼠作用顯著，對(duì)雄性小鼠作用不顯著；口服給藥和皮膚給藥，藥效結(jié)果無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表3；
表3 高良姜素口服給藥和皮膚給藥后對(duì)基底層黑素細(xì)胞的影響
2.5對(duì)含黑素顆粒的表皮細(xì)胞的影響：
LiLLie染色后，黑色素呈暗綠色為陽(yáng)性，分別于光鏡下測(cè)定各組含黑素顆粒的表皮細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)標(biāo)本觀察10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算每100個(gè)表皮基底細(xì)胞中含黑素顆粒的基底細(xì)胞的平均數(shù)量，用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；結(jié)果表明口服給予高良姜素高劑量組與皮膚低高劑量組均對(duì)含黑素顆粒的表皮細(xì)胞有顯著的促進(jìn)作用，且皮膚給藥后，結(jié)果較口服給藥顯著，結(jié)果見(jiàn)表4；
表4 高良姜素口服給藥和皮膚給藥后對(duì)含黑素顆粒的表皮細(xì)胞的影響
2.6對(duì)TYR、TRP-1表達(dá)及含量的影響：
采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接(SP)常規(guī)染色法，第一抗體為TYR和TRP-1單克隆抗體，工作濃度為1:100，第二抗體為生物素標(biāo)記，DAB顯色后，封片；各抗體在顯鏡下細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒、或團(tuán)塊狀為陽(yáng)性表達(dá)；采用二級(jí)計(jì)分法判定結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)<5％為0分；5％-25％為1分；25％-50％為2分；50％-75％為3分；>75％為4分；按染色強(qiáng)度分類：淡黃色1分；黃或深黃2分；褐或棕黃色3分；兩者相加小于2分為陰性(-)；2-3分為陽(yáng)性(+)；4-5分為中等陽(yáng)性(2+)；6-7分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。
各組動(dòng)物皮膚之間的陽(yáng)性率比較均采用PMSF3.1軟件進(jìn)行分析，t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性差異。結(jié)果口服給予高良姜素后，除高劑量組對(duì)雌性小鼠有顯著促進(jìn)作用，其他組小鼠TYR、TRP-1蛋白表達(dá)顯著提高；而皮膚給藥后，這兩種蛋白水平的表達(dá)均顯著提高，結(jié)果見(jiàn)表5-6；
表5 高良姜素口服給藥和皮膚給藥后對(duì)TYR蛋白表達(dá)的影響
表6 高良姜素口服給藥和皮膚給藥后對(duì)TRP-1表達(dá)的影響
3小結(jié)：
從以上藥效指標(biāo)結(jié)果可以得出：高良姜素口服及皮膚給藥后，均對(duì)實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)小鼠模型有一定的治療做，但整體評(píng)價(jià)皮膚給藥后，藥效結(jié)果較口服給藥顯著，原因可能是口服給藥，高良姜素經(jīng)胃腸道代謝，吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝的途徑均與皮膚給藥后有很大差異，到達(dá)病灶的藥量相應(yīng)減少，藥效稍差。而皮膚給藥后，高良姜素能夠直接作用于病灶部位，可發(fā)揮最大藥效?？梢?jiàn)，將高良姜素開發(fā)成皮膚給藥制劑，大大提高了治療的靶向性。