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艾滋病生物治療反應(yīng)器的制作方法

文檔序號:12325373閱讀:442來源:國知局
艾滋病生物治療反應(yīng)器的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中艾滋病生物治療反應(yīng)器,主要用于體外清除游離于艾滋病患者血細胞外的艾滋病毒,與此同時補充艾滋病患者體內(nèi)所缺乏的CD4+T細胞因子,達到治療艾滋病的目的。



背景技術(shù):

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的傳染病,在全球廣泛流行,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報告,自1981年美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來,至今全球有208個國家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴重威脅,約有4000萬人感染了艾滋病,死亡人數(shù)已超過2000萬,每天約有6000人成為艾滋病感染者,同時每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長期,目前已遠超過100萬。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個人類面臨的重大感染性疾病,已成為全球關(guān)注的嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題。

HIV是感染人類免疫細胞的反轉(zhuǎn)錄病毒,直徑約120納米,大致呈球形,外膜是類脂包膜(來自宿主細胞),并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41,gp41是跨膜蛋白,gp120位于表面,并與gp41通過非共價作用結(jié)合,向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix),以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid),衣殼內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細胞的成分。HIV進入人體后,首先被巨噬細胞吞噬,但HIV很快改變了巨噬細胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境,創(chuàng)造了適合其生存的條件,不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因為CD4是HIV的受體,所以經(jīng)巨噬細胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用,利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細胞膜融合)進入CD4+細胞(細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等),在細胞內(nèi)迅速增殖,每天產(chǎn)生109~1010病毒顆粒,并不斷進入其他正常的和再生的CD4+細胞內(nèi)復(fù)制,制造更多的病毒感染細胞,使外周血CD4+T細胞持續(xù)破壞、減少。CD4+T細胞是最重要的免疫細胞,感染者一旦失去了大量CD4+T細胞,整個免疫系統(tǒng)就會遭到致命的打擊,對各種疾病的感染都失去抵抗力;HIV進入宿主CD4+細胞后也可以表現(xiàn)為長期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀,其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA,與病毒整合酶進入宿主細胞核內(nèi),在整合酶的作用下,雙鏈DNA整合到宿主細胞基因組內(nèi),被整合的病毒DNA稱為前病毒,可潛伏數(shù)月甚至多年不復(fù)制,造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期,HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細胞和樹突狀細胞內(nèi)繁殖,這些細胞是體內(nèi)的HIV 貯存庫,可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細胞,有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。經(jīng)大量增殖后,HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細胞釋放并游離于血液,然后再進入其他細胞繼續(xù)感染過程;HIV感染后可刺激機體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120,Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體,其中艾滋病病人水平最低,HIV攜帶者最高,說明該抗體在體內(nèi)有保護作用。但抗體不能與單核巨噬細胞內(nèi)存留的病毒接觸,且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異,原有抗體失去作用,使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段,HIV前病毒整合入宿主細胞基因組中,因此HIV不會被免疫系統(tǒng)所識別,所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個很重要的原因應(yīng)該是,根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機理推測,免疫性抗體與抗原結(jié)合后,要產(chǎn)生免疫效應(yīng),要么通過激活補體,介導(dǎo)ADCC效應(yīng)溶解細胞性抗原,但HIV不是細胞性抗原;要么通過趨化作用吸引吞噬細胞吞噬清除抗原,但HIV反而在吞噬細胞內(nèi)被保護、增殖;要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用,使失去感染力,但HIV無法被免疫系統(tǒng)殺滅、清除,終究要在抗體失去中和活性后又恢復(fù)感染力。

目前艾滋病治療常用的抗病毒一線藥物是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,該藥不能殺滅HIV,存在個體差異、耐藥性、腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細胞性貧血、粒細胞和血小板減少、胰腺炎、肝損傷等多種毒副作用,其他如HIV蛋白酶抑制劑、HIV整合酶抑制劑、細胞因子、疫苗治療、基因治療和單克隆抗體被動免疫療法等,均因為各種原因而難以普遍應(yīng)用。有文獻報道利用T細胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細胞生長的刺激劑,大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細胞后,作為自身治療性細胞回輸,但HIV也隨著HIV感染細胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內(nèi)增殖,增量T細胞的回輸也導(dǎo)致了增量HIV的回輸。

CD4+T細胞是T淋巴細胞的一種,平均壽命一般為7天左右,但某些T細胞特別是經(jīng)永生化成細胞系(株)后可長期存活、無限擴增。國外文獻報道,猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明,SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細胞的生長速率,永生化細胞在體外多次傳代后,仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài),同時也能保留其原始細胞的許多分化表型。Reilly用猿猴病毒大T抗原基因轉(zhuǎn)化來建立血管平滑肌細胞株,構(gòu)建細胞模型以研究肝素對血管平滑肌的抑制作用機制。Su等利用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細胞株,構(gòu)建細胞模型來分析上皮細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用。Miquel等用SV40轉(zhuǎn)化的角化上皮細胞株,作為細胞模型研究層粘連蛋白5介導(dǎo)的細胞粘附作用。Webber等用經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細胞株作為細胞模型來研究前列腺上皮細胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用經(jīng)Ad12-SV40轉(zhuǎn)化腎小管上皮細胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。Hougton等用SV40轉(zhuǎn)化建立骨髓基質(zhì)細胞株作為細胞模型以研究在一定培養(yǎng)條件 下,細胞具有向脂肪細胞和成骨細胞的雙向分化的潛能,進一步研究骨質(zhì)疏松的機制。國外研究還表明,導(dǎo)入外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系,基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對正常的生長特征。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系,細胞群體倍增數(shù)達150次以上,細胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性,誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達來源細胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細胞系,細胞倍增達200次以上,細胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩(wěn)定。但未見制備CD4+T細胞用于體外治療艾滋病的報道。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題,本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供艾滋病生物治療反應(yīng)器;另一目的是要提供反應(yīng)器的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:基于HIV通過其受體CD4分子選擇性地感染CD4+T細胞且造成CD4+T細胞大量破壞和免疫功能喪失而致病的機理,通過外源基因整合而改變CD4+T細胞的基因結(jié)構(gòu),從而使之轉(zhuǎn)化為既保持原細胞生物學(xué)特性又能在體外無限制生長的永生化細胞系,并利用CD4+T細胞表面特有分子抗體作為細胞生長的刺激劑,建立適應(yīng)體外人工產(chǎn)業(yè)制備既能結(jié)合HIV又能產(chǎn)生細胞因子的CD4+T細胞的方法,將由此制備的CD4+T細胞以高生物相容性材料包裹而進一步制備能防止細胞及其碎片甚至HIV濾出的、能為CD4+T細胞產(chǎn)生細胞因子及結(jié)合HIV提供場所的反應(yīng)器,體外循環(huán)中分離的血漿流經(jīng)反應(yīng)器時,其中的HIV與CD4+T細胞發(fā)生結(jié)合反應(yīng)隨后進入胞內(nèi)而從血漿中清除,同時CD4+T細胞產(chǎn)生的細胞因子隨血漿經(jīng)細胞間隙流出反應(yīng)器而回輸體內(nèi),從而實現(xiàn)既清除HIV又補充所需細胞因子的艾滋病人工CD4+T細胞替代療法。

本發(fā)明根據(jù)HIV選擇性地感染CD4+T細胞、生物人工肝治療細胞永生化的制備方法以及血液置換治療等機制,實施以人工制備CD4+T細胞并進一步制成生物反應(yīng)器用以清除血漿HIV及補充相應(yīng)細胞因子的艾滋病治療新方法,因CD4+T細胞表面的CD4分子是HIV的受體而成為HIV的易感細胞,與HIV相遇時能吸附HIV,被吸附的HIV隨CD4+T細胞被固定于反應(yīng)器,制備的生物反應(yīng)器能防止細胞及其碎片甚至HIV濾出,能為CD4+T細胞產(chǎn)生細胞因子及結(jié)合HIV提供場所,本發(fā)明的技術(shù)方案能有效阻斷新生的CD4+T細胞再被HIV感染,能使體內(nèi)HIV不斷被清除而減少直至消失,從而達到免疫重建的治療目的,與目前無法殺滅HIV和有效阻斷從血漿到CD4+T細胞的循環(huán)感染途徑、且費用昂貴、藥副作用大的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 方法相比,本發(fā)明更經(jīng)濟,實現(xiàn)了人工將HIV從體內(nèi)轉(zhuǎn)移到體外加以清除的治療新方法。

具體實施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病生物治療反應(yīng)器的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病生物治療反應(yīng)器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1中,動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通,另一端經(jīng)肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連,血漿分離器(4)經(jīng)血漿泵(6)和循環(huán)管路(7)與兩個并聯(lián)的反應(yīng)器(8)、反應(yīng)器(9)相連,然后依次與循環(huán)管路(10)、靜脈管路(5)相連,靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。

圖2中,1是血漿分離器,2是血漿分離器內(nèi)腔,3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔,4是不能通過微孔(3)的血細胞,5是能通過微孔(3)的小分子血漿成份,6是血漿分離器外腔,7是血漿流出口,8是可開關(guān)的閥門。

圖3中,1是反應(yīng)器,2是CD4+T細胞,3是進入反應(yīng)器的游離的HIV,4是HIV與CD4+T細胞結(jié)合物,5是CD4+T細胞產(chǎn)生的細胞因子。

下面結(jié)合圖1、圖2和圖3,對本發(fā)明提出的艾滋病生物治療反應(yīng)器的實施方案作詳細的描述。

一、生物治療反應(yīng)器的制備

1、制備依據(jù)

(1)根據(jù)CD4+T細胞是HIV的易感細胞制備:HIV進入人體后,被巨噬細胞(含CD4分子)吞噬,但HIV很快改變了巨噬細胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境,創(chuàng)造了適合其生存的條件,不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因為CD4是HIV的受體,所以經(jīng)巨噬細胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用,利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細胞膜融合)進入其他CD4+細胞,如單核巨噬細胞、樹突狀細胞等,特別是CD4+T細胞,在細胞內(nèi)迅速增殖,每天產(chǎn)生109~1010病毒顆粒,并不斷進入其他正常的CD4+T細胞內(nèi)或再生的CD4+T細胞內(nèi)復(fù)制,制造更多的病毒感染細胞,使外周血CD4+T細胞持續(xù)破壞、減少。在HIV感染CD4+T細胞的過程中存在游離于血漿的時機,設(shè)計以CD4+T細胞為吸附細胞的生物治療反應(yīng)器,用以吸附清除體外分離血漿中的HIV,從而使體內(nèi)HIV不斷被清除而減少直至消失,有效阻斷新生的CD4+T細胞再感染HIV途徑,達到免疫重建的治療目的。

(2)CD4+T細胞能產(chǎn)生細胞因子:如IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-10,其中IL-2被認為是最重要的T細胞生長因子和動態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)因子,引起CD4+T細胞 增殖并增加CD8+T細胞的細胞毒性潛能,能使CD4+T細胞計數(shù)長時間增加;分泌的IFN具有促進感染致炎癥性反應(yīng)的作用;分泌的IL-4和IL-10具有抑制炎癥反應(yīng)的作用;分泌的IL-6具有參與炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病反應(yīng)的作用。HIV感染的主要特征是進行性免疫缺陷,包括以CD4+T細胞為主的免疫細胞數(shù)量減少和功能異常,各種細胞因子分泌減少或消失,導(dǎo)致免疫功能喪失。

2、反應(yīng)劑的制備

制備CD4+T細胞(包括其他CD4+細胞),作為反應(yīng)器內(nèi)部吸附HIV的反應(yīng)劑(基質(zhì))。

(1)原代淋巴細胞的來源:有以下種途經(jīng):①用于科研保存的傳染病實驗室樣本庫中凍存的淋巴細胞株(經(jīng)滅活HIV全病毒免疫但未感染HIV的淋巴細胞);②購買血站新鮮濃縮白細胞,然后進行過滅活HIV感染株免疫的淋巴細胞;③從商家直接購買的T淋巴細胞系(株);④用于科研保存的臍帶血淋巴細胞(經(jīng)滅活HIV免疫);⑤直接取自因做其他實驗而順便采集的HIV-1感染者的存余的外周血淋巴細胞(用于自身),采用Histopaque淋巴細胞分離液分離單個核細胞(PBMC)。

(2)CD4+T細胞的制備:①主要試劑與儀器:CD4、CD8免疫磁珠(德國美天旎生物技術(shù)有限公司);異硫氰酸熒光素CD4-FITC、CD8-FITC、IgG1-FITC(Immunotech公司);淋巴細胞分離液(上海恒信生化試劑有限公司);乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2%臺盼藍染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司);新生牛血清(Hyclone公司);MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù)有限公司);EpicsXL型流式細胞儀(美國BeckmanCoulter公司)。②單個核細胞(PBMC)的分離(密度梯度離心法):無菌取20mL血樣(500IU/mL2mL肝素鈉抗凝);PBS液將血液稀釋2~3倍,充分混勻后將6mL抗凝靜脈血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細胞分離液的10mL離心管中水平離心機中水平離心(400r/min,20℃)35min;離心后管內(nèi)分為3層,上層為血漿和PBS液,下層主要為紅細胞和粒細胞,中層為淋巴細胞分離液,在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC,用毛細吸管插到云霧層,吸取PBMC置入另-50mL離心管中,加入5倍以上體積PBS離心(300r/min,20℃)10min,棄上清50mLPBS重懸細胞,離心(350r/min,20℃)15min,棄上清,加入Buffer(PBS+0.5%新生牛血清+2mmol/LEDTA,pH7.2)2mL重懸細胞,取15uL細胞懸液加入血球計數(shù)板上顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)的細胞(PBMC)總數(shù)。③CD4+T細胞和CD8+T細胞的分離純化:PBMC細胞懸液均分至兩個1.5mLEppendorf管,離心(300r/min,20℃)10min,棄去上清,重懸細胞每80uLBuffer含細胞數(shù)107個,每107個細胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads,充分混勻,在4~8℃孵化15min,用1mLBuffer洗滌細胞,離心(300r/min,20℃)10min,棄去上清500uLBuffer重懸細胞,將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中, 以500uLBuffer漂洗,將500uL細胞懸液通過分離柱,用500uLBuffer沖洗分離柱重復(fù)操作3次,收集流出液,流出液中含非CD4+T淋巴細胞或非CD8+T淋巴細胞,自分離器中取出分離柱,用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱,收集流出液,此為CD4+T淋巴細胞或CD8+T淋巴細胞(細胞活力檢測:細胞純化前后分別取15uL細胞懸液與等體積臺盼藍溶液混合,顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細胞,著色脹大者為死細胞,計算200個細胞中活細胞的百分比)。

(3)體外產(chǎn)業(yè)制備CD4+T細胞

有文獻報道利用T細胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細胞生長的刺激劑,大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細胞后,作為自身治療性細胞回輸。但HIV也隨著HIV感染細胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內(nèi)增殖,增量T細胞的回輸也導(dǎo)致了增量HIV的回輸。本發(fā)明以SV40或hTERT永生化CD4+T細胞,并以CD3單克隆抗體為細胞生長刺激劑,大量擴增CD4+T細胞,用于制備反應(yīng)器,結(jié)合血液凈化技術(shù),在體外清除HIV。

以CD3單克隆抗體為細胞生長刺激劑的方法是:將抗CD3單抗(CD4+T細胞同時含有CD3分子)包被到培養(yǎng)板上刺激單個核細胞(淋巴細胞)生長,稱為抗CD3抗體包被法,可獲得很好的擴增效果,應(yīng)用這種方法擴增的淋巴細胞已用于腫瘤的二期臨床治療并取得了一定的療效。國外文獻報道[Shimizu等]亦用此方法培養(yǎng)了5例晚期艾滋病患者的淋巴細胞,培養(yǎng)4周就可獲得1000倍的擴增,且擴增的細胞群中CD4+/CD8+T均可大量擴增(CD4+T細胞更明顯)。另一種是抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)法,即將抗CD3/CD28雙抗交聯(lián)于滋珠上作為刺激劑培養(yǎng)HIV感染者外周血單個核細胞(淋巴細胞),可以擴增大量的CD4+T細胞,并且擴增的CD4+T細胞具有對抗HIV感染的能力,其培養(yǎng)過程中病毒也低于檢測水平,之后發(fā)現(xiàn)這可能與CD28提供了第二信號,選擇性誘導(dǎo)分泌大量的Th1細胞因子和趨化因子有關(guān),用此方法擴增的CD4+T細胞已用于HIV感染者的臨床治療回輸,無風(fēng)險但效果一般。

以hTERT永生化CD4+T細胞的方法是:以內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligation Mix連接經(jīng)PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo酶切產(chǎn)物,構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素菌落抽提質(zhì)粒,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入離體傳代呈對數(shù)生長的T淋巴細胞,使重組子與細胞的DNA整合,并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選的陽性重組子的克隆,篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT永生化的CD4+T細胞。

以SV40永生化CD4+T細胞的方法是:以T4 DNA連接酶連接同時經(jīng)BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA,構(gòu)建 SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素的菌落抽提質(zhì)粒,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入體外培養(yǎng)的T淋巴細胞,使重組子與細胞的DNA整合,以G418篩選的含陽性重組子的細胞,作傳代、擴大培養(yǎng),篩選細胞形態(tài)、細胞生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產(chǎn)物測定及DNA序列測定結(jié)果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40永生化的CD4+T細胞。

①以hTERT永生化CD4+T細胞的具體方法

(I)hTERT的提?。?i)酶切pClneo-hTERT:hTERT位于質(zhì)粒pClneo-hTERT的EcoRI與SalI位點之間,pLXSNneo載體多克隆位點(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點。市售購買pCIneo-hTERT質(zhì)粒,溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中,加2uL10×酶切緩沖液和18uL H2O,加限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul,37℃溫育1h,75℃加熱15min,滅活酶,加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng),按常規(guī)PCR法擴增hTERT后,收取擴增物以備電泳。(ii)hTERT電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠,倒入已封好的凝膠灌制平臺上,插上樣品梳,待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶,拔出梳子,放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中,緩沖液高出凝膠表面大約1mm,用適量的10×加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品,然后用移液器將樣品加入樣品孔中,并同時做合適的標(biāo)準(zhǔn)對照物,接通電極,使hTERT向陽極移動,然后在1-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(30min),關(guān)閉電源。(iii)hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中,向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液,使之浸沒凝膠,并排空汽泡,將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行),加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm),接通電源,150伏電洗,在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠,改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘,從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中,加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺式離心機上最高速2分鐘,吸去上層正丁醇溶液,如此重復(fù)二次,自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次,上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無水乙醇,于20℃過夜,12000g,4℃下離心10分鐘,得hTERT沉淀,棄上清,加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇,加入50μl TE溶解hTERT。此外,還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。

(II)hTERT與pLXSNneo載體的連接:取9μl上述純化的hTERT成份(0.1-5μg)、1μ 110mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合,15℃溫育24h,構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子。

(III)pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴增、鑒定:(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌,使之進入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化,用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞,常用于成批制備感受態(tài)細菌,本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株,操作過程簡述如下:從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52),或1ml新鮮的16~20h過夜培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中,于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2~3h(旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min),每隔20~30min測量OD600值≈0.4,在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個,用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中,在冰上放置10~20min,于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,以回收細胞,倒數(shù)培養(yǎng)液,將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀,放于冰上,于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,以回收細胞,倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定,此時,可以迅速將細胞分裝成小份,液氮中冰凍,-70℃貯存?zhèn)溆谩?ii)以感受態(tài)大腸桿菌純化、擴增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl,DNA≤50ng),輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30min,將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上,放置90s~2min,不要搖動試管,快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細胞冷卻1~2min,每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基,用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃,然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上,溫育45min使細菌復(fù)蘇,并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因,將適當(dāng)體積(每90mm平板可達200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上,將平板置于室溫至液體被吸收,倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12~16h后可出現(xiàn)菌落。(iii)篩選、擴增重組子:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中,培養(yǎng)過夜后,再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中,再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD600≈4,為提高產(chǎn)量,應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度,振搖速度應(yīng)大于400r/min),于4℃,6000g離心10min,用4mL GTL溶液重懸沉淀,并轉(zhuǎn)移到一個容積≥20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存),加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液,重懸沉淀,于室溫放置10min,加入10mL新配NaOH/SDS溶液,并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠,于冰上放置10min,加入7.5mL乙酸溶液,用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放置10min,于4℃,20 000g離心10min,將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中,如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾,加入0.6倍體積的異丙醇, 顛倒混勻,室溫放置5~10min,于室溫,1500g離心10min,加入2mL 70%乙醇輕輕洗滌沉淀,然后短暫快速離心,吸去乙醇,真空干燥(沉淀可在4℃長期保存)。(iv)重組質(zhì)粒的鑒定與擴增:挑取平皿上的單菌落,接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中,37℃,250r/min搖床中培養(yǎng),14h后收集培養(yǎng)物,4℃、10000r/min離心5min,按試劑盒說明書小量提取并純化重組質(zhì)粒;以EcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系:限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10×buffer 2ul、重組質(zhì)粒10ul、加水補足至20ul,37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進行0.8%瓊脂糖電泳,時間30min,凝膠成像系統(tǒng)拍照;按常規(guī)測定重組質(zhì)粒的序列;重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序鑒定準(zhǔn)確后,將含有該質(zhì)粒的細菌接種至LB培養(yǎng)液中,擴增培養(yǎng),按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進行大劑量質(zhì)粒抽提純化,紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度及純度后備用。

(IV)CD4+T細胞:從本發(fā)明“(2)CD4+T細胞的制備”取樣制備。

(V)CD4+T細胞預(yù)培養(yǎng):將上述細胞接種于含5~10nmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中,或接種于含20%胎牛血清、5~10nmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基中,一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6%1M HEPES緩沖液;15%胎牛血清(FBS);1%青霉素和鏈霉素;PRMI 1640補足到100%),置于37℃,體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)1-2天,離心,去上清液,備用。

(VI)pLXSNneo-hTERT重組子導(dǎo)入T淋巴細胞及擴大培養(yǎng):在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A,將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100μl無血清培養(yǎng)液中;管B,將20μl Lipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中,將管A和管B混勻,室溫下靜置45min,用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液,輕輕混勻,滴加至上述T淋巴細胞中,加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L),在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h,吸出轉(zhuǎn)染液,加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20%),繼續(xù)培養(yǎng)20h,棄去培養(yǎng)液,更換濃度為400mg·L-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),8天后選擇活細胞作擴大培養(yǎng)后,再加大G418濃度到800mg·L-1,將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細胞繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察,可見淋巴細胞明顯增大,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細胞增長慢,或細胞密度低,或培養(yǎng)液pH值呈酸性,吸出半量培養(yǎng)液,進行等量換液。當(dāng)總量達到14ml時轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中,每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)至9-10周(約第75代),仍處于對數(shù)生長期,即細胞增加數(shù)量與培養(yǎng)時間呈倍增關(guān)系,死亡細胞少于10%(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細胞數(shù)量的增加情況;通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞。因為正常的活細胞,胞膜結(jié)構(gòu)完整,能夠排斥,使臺盼藍不能夠進入胞內(nèi);而喪失活性的細胞,胞膜的通透性增加,可被臺盼藍染成藍色,可判斷為細胞已經(jīng)死 亡。方法是每周吸取一定量的細胞培養(yǎng)懸液,與臺盼藍染色劑混合后置室溫5~10分鐘,然后制成細胞薄片,在顯微鏡下計數(shù)1000個細胞總數(shù),計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時間的延長,細胞數(shù)量的增加變慢、死亡細胞越來越多,直至細胞不再增加,甚至溶解、減少、全部死亡。當(dāng)總量達到45ml時,置50ml離心管中,離心1500轉(zhuǎn),10分鐘,棄上清后,加入3ml凍存培養(yǎng)基(5%二甲基亞楓(dimethyl sufoxide),95%FBS)混勻,成細胞懸浮液(細胞濃度約為105/ml)。凍存管分裝,1ml/管,置-20℃2h,再置-70℃2h,然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度,1-2小時后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T細胞生物學(xué)特性的鑒定:(i)觀察細胞形態(tài):可見淋巴細胞明顯增大,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,具有淋巴母細胞化特征。(ii)觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉(zhuǎn)染細胞,制成細胞懸液,經(jīng)計數(shù),分別取1.4×104細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細胞進行計數(shù),計算均值,連續(xù)觀察直至細胞數(shù)量明顯下降,培養(yǎng)3天后每隔2天給未計數(shù)的細胞換液,采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時間為橫軸,細胞數(shù)量為縱軸(對數(shù)),描繪在半對數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細胞的生長曲線,永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成;(iii)檢查染色體:通過分析染色體核型,如果染色體核型為二倍體“46,XX”或“46,XY”,則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體,如果沒有,也說明細胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素100ul,混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時,經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型;(iv)流式細胞術(shù)檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例,如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強,說明是hTERT整合、表達的結(jié)果。(vii)DNA序列測定:按常規(guī)測序儀檢測,顯示hTERT基因序列。(v)轉(zhuǎn)染細胞DNA中hTERT檢測:如以免疫組織化學(xué)檢測,hTERT轉(zhuǎn)染的細胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒,表明hTERT已整合入細胞內(nèi);(vi)mRNA表達產(chǎn)物測定:取100μl體系的PCR擴增產(chǎn)物,用凝膠回收試劑盒(Takara,日本)回收產(chǎn)物,取2μl DNA溶液稀釋100倍,測濃度,余下的DNA及上、下游引物各10μl進行測序。

(VIII)hTERT介導(dǎo)CD4+T細胞庫:篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞,取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的細胞,經(jīng)離心分離(1200r/min,6min),用含二甲亞砜的凍存液0.5~1ml重懸細胞,細胞密度為5×105個/ml,加入凍存管,經(jīng)4℃,0.5h;-20℃,2h;-70℃,過夜,入-196℃液氮凍存,以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化CD4+T細胞庫備用。

②以SV40永生化CD4+T細胞的具體方法

(I)SV40大T抗原DNA的提?。?i)SV40DNA酶切:從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒,溶解于適量的H2O或TE緩沖液中,加2uL10×酶切緩沖液和18uL H2O,加限制性內(nèi)切酶BamH I(1-5U/ugDNA),37℃溫育1h,75℃加熱15min,滅活酶,加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。(ii)SV40DNA電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠,倒入已封好的凝膠灌制平臺上,插上樣品梳,待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶,拔出梳子,放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中,緩沖液高出凝膠表面約1mm,用適量的10×加樣緩沖液制備DNA樣品,然后用移液器將樣品加入樣品孔中,并同時做合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照物,接通電極,使DNA向陽極移動,在1-10V/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時,關(guān)閉電源。(iii)從瓊脂糖中分離約2600bp SV40大T抗原DNA:在300-360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中,向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液,使之浸沒凝膠,并排空汽泡,將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行),加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm),接通電源,150伏電洗,在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠,改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘,從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中,加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺式離心機上最高速2分鐘,吸去上層正丁醇溶液,如此重復(fù)二次,自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次,上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無水乙醇,于20℃過夜,12000g,4℃下離心10分鐘,得DNA沉淀,棄上清,加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇,加入50μl TE溶解DNA。此外,還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。

(II)SV40大T抗原DNA與pcDNA3.1基因載體的連接:取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×連接緩沖液、1μl 10mmol/L ATP、T4 DNA連接酶(20~500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合,15℃溫育24h,構(gòu)建成SV40T/pcDNA3.1重組子。

(III)SV40T/pcDNA3.1重組子的擴增、分離與鑒定:(i)大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌,使之進入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化,用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞,常用于成批制備感受態(tài)細菌,本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株,操作過程簡述如下:從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52),或1ml新鮮的16~20h過夜培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中,于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2~3h(旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min),每隔20~30min 測量OD600值≈0.4,在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個,用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中,在冰上放置10~20min,于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,以回收細胞,倒數(shù)培養(yǎng)液,將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀,放于冰上,于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,以回收細胞,倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定,此時,可以迅速將細胞分裝成小份,液氮中冰凍,-70℃貯存?zhèn)溆茫美鋮s的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,應(yīng)在每管中加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl,DNA≤50ng),輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30min,將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上,放置90s~2min,不要搖動試管,快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細胞冷卻1~2min,每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基,用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃,然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上,溫育45min使細菌復(fù)蘇,并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因,將適當(dāng)體積(每個90mm平板可達200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上,將平板置于室溫至液體被吸收,倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12~16h后可出現(xiàn)菌落。(ii)重組子的篩選、擴增與提取:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養(yǎng)基)中,培養(yǎng)過夜后,再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中,再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD600≈4,為提高產(chǎn)量,應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度,振搖速度應(yīng)大于400r/min),于4℃,6000g離心10min,用4mL GTL溶液重懸沉淀,并轉(zhuǎn)移到一個容積≥20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存),加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液,重懸沉淀,于室溫放置10min,加入10mL新配NaOH/SDS溶液,并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠,于冰上放置10min,加入7.5mL乙酸溶液,用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放置10min,于4℃,20 000g離心10min,將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中,如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾,加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻,室溫放置5~10min,于室溫,1500g離心10min,加入2mL 70%乙醇輕輕洗滌沉淀,然后短暫快速離心,吸去乙醇,并真空干燥(沉淀可在4℃長期保存)。(iii)重組子的鑒定:上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含重組子SV40T/pcDNA3.1),同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進行酶切,10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶,前者符合GenBank中SV40T片段的大小。

(IV)CD4+T細胞:從本發(fā)明“(2)CD4+T細胞的制備”取樣制備。

(V)CD4+T細胞預(yù)培養(yǎng):將上述細胞接種于含5~10nmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI 1640液中,或接種于含20%胎牛血清、5~10nmol/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基中,一般接種于3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6%1M HEPES緩沖液;15%胎牛血清(FBS);1%青霉素和鏈霉素;PRMI 1640補足到100%),置于37℃,體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)1-2天,離心,去上清液,備用。

(VI)SV40T/pcDNA3.1的導(dǎo)入及擴大培養(yǎng):在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A,將SV40T/pcDNA3.1溶于100μl無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)中;管B,將20μl Lipofectamine溶于80μl無血清培養(yǎng)液中,將管A和管B混勻,室溫下置45min。用無血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細胞2次。在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml無血清培養(yǎng)液,輕輕混勻,再滴加至上述T淋巴細胞中,然后加入1ml無血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L),在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h,吸出轉(zhuǎn)染液,加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20%),繼續(xù)培養(yǎng)20h,棄去培養(yǎng)液,更換濃度為400mg·L-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),8天后選擇活細胞作擴大培養(yǎng)后,再加大G418濃度到800mg·L-1,將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的細胞繼續(xù)進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察,可見淋巴細胞明顯增大,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細胞增長慢,或細胞密度低,或培養(yǎng)液pH值呈酸性,吸出半量培養(yǎng)液,進行等量換液。當(dāng)總量達到14ml時轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中,每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)約6-8周(約第55代),仍處于對數(shù)生長,即培養(yǎng)時間與細胞增加數(shù)量呈倍增關(guān)系,死亡細胞少于10%(通過讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細胞數(shù)量的增加情況;通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞。因為正常的活細胞,胞膜結(jié)構(gòu)完整,能夠排斥,使臺盼藍不能夠進入胞內(nèi);而喪失活性的細胞,胞膜的通透性增加,可被臺盼藍染成藍色,可判斷為細胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細胞培養(yǎng)懸液,與臺盼藍染色劑混合后置室溫5~10分鐘,然后制成細胞薄片,在顯微鏡下計數(shù)1000個細胞總數(shù),計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時間的延長,細胞數(shù)量的增加變慢、死亡細胞越來越多,直至細胞不再增加,甚至溶解、減少、全部死亡。當(dāng)總量達到45ml時,置50ml離心管中,離心1500轉(zhuǎn),10分鐘,棄上清,加入3ml凍存培養(yǎng)基(5%二甲基亞楓(dimethyl sufoxide),95%FBS)混勻,成細胞懸浮液(細胞濃度約為105/ml)。凍存管分裝,1ml/管,置-20℃2h,再置-70℃2h,然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度,1-2小時后移入液氮罐中)。

(VII)永生化CD4+T細胞生物學(xué)特性的鑒定:(i)觀察細胞形態(tài):可見淋巴細胞明顯增大,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,具有淋巴母細胞化特征。(ii)觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉(zhuǎn)染細胞,制成細胞懸液,經(jīng)計數(shù),分別取1.4×104細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細胞進行計數(shù),計算均值,連續(xù)觀察直至細胞數(shù)量明顯下降,培養(yǎng)3天 后每隔2天給未計數(shù)的細胞換液,采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細胞在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時間為橫軸,細胞數(shù)量為縱軸(對數(shù)),描繪在半對數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細胞的生長曲線,永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成;(iii)檢查染色體:通過分析染色體核型,如果染色體核型為二倍體“46,XX”或“46,XY”,則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體,如沒有,說明細胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素100ul,混勻后置37℃培養(yǎng)箱4小時,經(jīng)離心、去上清液、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型;(iv)流式細胞術(shù)檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例,如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強,說明是SV40大T抗原整合、表達的結(jié)果。(viii)DNA序列測定:按常規(guī)測序儀檢測,顯示SV40大T抗原DNA序列。(v)轉(zhuǎn)染細胞DNA中SV40大T基因檢測:如以免疫組織化學(xué)檢測,SV40轉(zhuǎn)染的細胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒,表明SV40T抗原已整合入細胞內(nèi);也可用RT-PCR法檢測T抗原在細胞中的表達,其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’,下游引物(S4496)5’-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3’;擴增產(chǎn)物長度為268bp,擴增條件為94℃,5min,即:(94℃,1min;55℃,1min,-0.5℃/循環(huán);72℃,1min)×30、(94℃,30S;40℃,30S,72℃,30S)×15,擴增體系為50μl:[Mg2+]2mmol/L、dNTPs 200μmol/L、引物濃度0.4μmol/L、Taq1U、模板5μl;實驗組以第19代細胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成,產(chǎn)物-20℃保存);陰性對照設(shè)兩個,分別以無菌水、原代細胞的cDNA做模板,陽性對照以SV40 DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40 DNA,因為SV40病毒無包膜,不使用SDS破膜,取5μl進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其余-20℃保存?zhèn)溆?;(vi)mRNA表達產(chǎn)物測定:T抗原mRNA RT-PCR產(chǎn)物測序:取100μl體系的擴增產(chǎn)物,用凝膠回收試劑盒(Takara,日本)回收產(chǎn)物,取2μl DNA溶液稀釋100倍,測濃度,余下的DNA及上、下游引物各10μl進行測序。

(VIII)SV40LT基因介導(dǎo)CD4+T細胞庫:篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞,取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的細胞,經(jīng)離心分離(1200r/min,6min),用含二甲亞砜的凍存液0.5~1ml重懸細胞,細胞密度為5×105個/ml,加入凍存管,經(jīng)4℃,0.5h;-20℃,2h;-70℃,過夜,入-196℃液氮凍存,以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的CD4+T細胞庫備用。

(4)與CD4+T細胞相似功能顆粒的制備:可將CD4分子、基因重組的CD4分子及類似功能的分子通過常規(guī)化學(xué)偶聯(lián)、交聯(lián)、親和吸附等固定于載體上制成包被有CD4分子的顆粒,或直接取用功能相似的顆粒替代CD4+細胞應(yīng)用。本發(fā)明的CD4+T細胞代表其他CD4+細胞,包 括用其他方法制備永生化CD4+T細胞。

3、反應(yīng)器的規(guī)格

將本發(fā)明制備的CD4+T細胞,以無菌生理鹽水清洗后,再以1000r/min離心5min(低速短時離心),取細胞沉淀裝配丙烯酸酯之類高生物相容性材料(與血漿分離器材料相同)制成的圓柱形容器,然后加滿無菌生理鹽水,使CD4+T細胞的濃度為80%~90%,封口,制成即時使用的反應(yīng)器。反應(yīng)器可為漏斗形,底徑小,頂徑大,容積為200~300ml,進出口均設(shè)有細胞篩網(wǎng),進口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目;出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0~5.0目(2.5~5.0目相當(dāng)于0.1~0.2微米或100~200納米),具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格,用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細菌;液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當(dāng)于4微米)的細胞濾網(wǎng),用以阻擋可能濾出的細胞;液體進出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū),有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。當(dāng)被分離的血漿流經(jīng)反應(yīng)器時,游離的HIV被相應(yīng)的CD4+T細胞吸附,凈化后的血漿從反應(yīng)器流出與血細胞匯合后回輸。

二、血漿分離器的制備

1、原理:根據(jù)血細胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細胞)的大小為:正常紅細胞大約為7微米(μm),是雙凹圓盤狀的細胞;白細胞分為5種,中性粒細胞約12μm,嗜酸性粒細胞略大些,嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近,小淋巴細胞6-8μm,與紅細胞近似,單核細胞最大,約15-20μm。血小板為圓盤形,直徑1~4微米到7~8微米不等,人的血小板平均直徑為2-4微米,厚0.5~1.5微米。

2、材料:用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物,要求幾乎不激活補體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變??赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生,如選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等。

3、型號與規(guī)格:就分離器的外形來說,可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀,按待分離的血細胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明的血漿分離器制成空心纖維型濾器,空心纖維膜直徑為270~370μm,膜厚度為50μm,孔徑為0.2~0.6μm,纖維長度為13.5~26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過,但能阻擋所有的細胞成分。

三、生物治療反應(yīng)器的應(yīng)用

1、體外循環(huán)裝置的構(gòu)成及作用

(1)反應(yīng)器:內(nèi)含反應(yīng)劑(CD4+T細胞),用于吸附、清除HIV。

(2)血漿分離器:用于體外循環(huán)裝置中分離血漿和血細胞。

(3)動靜脈壓監(jiān)測:動脈壓監(jiān)測主要用以動態(tài)監(jiān)測血漿分離器微孔的堵塞情況,另外用以監(jiān)測體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時,動脈壓就會降低;當(dāng)有凝血、血栓形成,特別是分離器微孔堵塞時,動脈壓就會升高;靜脈壓監(jiān)測用來監(jiān)測管路血液回流的壓力,當(dāng)分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時,靜脈壓就會下降,如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時,靜脈壓就會升高。

(4)空氣監(jiān)測(Air Detector):用來監(jiān)測血液流路的空氣氣泡,一般用超聲波探測的原理,為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測到有空氣氣泡時,檢測系統(tǒng)會驅(qū)動動、靜脈血路夾來阻斷血流,防止危險的發(fā)生。

其他還包括溫度控制系統(tǒng)、配液系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測系統(tǒng)、超濾監(jiān)測和漏血監(jiān)測等部分。總之,在本發(fā)明構(gòu)成體系的基礎(chǔ)上,有望進一步研發(fā)自動化治療儀器,發(fā)展為操作的人性化、治療的個性化、設(shè)計的安全性以及模塊化、自動監(jiān)測及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報原因及解除信號等微電腦處理系統(tǒng)。

2、使用方法

(1)安裝:以無菌操作連接各部件,包括血漿分離器、反應(yīng)器及各循環(huán)管路。

(2)排氣:以無菌生理鹽水充液分離器、反應(yīng)器及各循環(huán)管路,排除分離器、反應(yīng)器及其循環(huán)管道內(nèi)的氣體、氣泡,仔細檢查,確認無氣體、氣泡后使用。

(3)通液:將動脈血路管(1)接通艾滋病患者的動脈血管,在操作中再次仔細檢查排氣是否完全,液流是否通暢,并避免管內(nèi)流液污染。

(4)抗凝:從肝素泵向液流中注射抗凝劑(肝素),初次為2500∪或20~30∪/kg。

(5)啟動:將靜脈管路(5)接通艾滋病患者的靜脈血管,然后打開血液泵,血流量為100~150ml/min,如圖1,當(dāng)動脈血液經(jīng)動脈血路管(1)進入血漿分離器(4),分離出來的血漿在血漿泵(6)的作用下經(jīng)循環(huán)管路(7)到達反應(yīng)器(8),待充滿血漿、約10分鐘,開始放出血漿,經(jīng)循環(huán)管路(10)流出,同步向反應(yīng)器(9)灌注血漿,在反應(yīng)器(8)內(nèi)的血漿將近流完時,再次開始灌注血漿,此時反應(yīng)器(9)開始放出血漿,兩個并聯(lián)的反應(yīng)器(8)、反應(yīng)器(9)交替進行。如此直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L),治療才宣告結(jié)束。如果配套電腦程序控制,整個治療過程均由電腦控制,并可隨時檢測工作狀態(tài),使用會更加方便、自動化和安全。如圖2,當(dāng)待分離的血液進入血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)時,經(jīng)閥門(8)的作用,能通過微孔(3)的小分子血漿成份(5)進入分離器的外腔(6),然后經(jīng)血漿出口(7)流出,而不能通過微孔(3)的血細胞(4)經(jīng)閥門(8)流出。如圖3,當(dāng)含有HIV(3)的血漿進入反應(yīng)器(1)時,其中的HIV(3)被固定在反應(yīng)器中的CD4+T細胞(2)結(jié) 合成復(fù)合物(4)而不再往下移動,而CD4+T細胞產(chǎn)生的細胞因子(5)混合在吸附了HIV后的血漿中從CD4+T細胞的間隙流出反應(yīng)器后回輸體內(nèi),同時,反應(yīng)器出口處2.5~5.0目的底徑篩網(wǎng)也能阻擋HIV病毒或更大的細菌。

四、反應(yīng)器治療功效的驗證

為了解CD4+T細胞的功效,本發(fā)明設(shè)計了簡易反應(yīng)器的測試方法:取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支,分別吸取經(jīng)離心(1000r/min,5min)沉淀的CD4+T細胞至200mm刻度,接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在56℃?zhèn)溆玫?.9%瓊脂糖C1-4B,達到約10mm長刻度,置血沉架冷卻后,瓊脂糖成為半固體,能阻止血沉管內(nèi)細胞流出但不會阻止小分子的水和化學(xué)成份之類的物質(zhì)通過。另取生物樣本庫保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿,各約10mL,各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管,待流經(jīng)血沉管下層的CD4+T細胞層并從血沉管內(nèi)流出后,收集流出液,稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿,根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法,上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作,以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照,最低檢測限低于5pg/ml,測定范圍0~400pg/ml,線性范圍0.5pg/ml~80pg/ml,15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD),空白對照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050,0pg吸光度值不高于0.100,1000pg/ml吸光度不低于1.000,當(dāng)吸光度>0.12時被認為是陽性,檢測結(jié)果(表1)說明,AIDS血漿濾過簡易反應(yīng)器后,部分HIV已被CD4+T細胞吸附,經(jīng)第1次濾過后,HIV總清除率為22.84%,經(jīng)第2次濾過后,總清除率為35.31%,經(jīng)第3次濾過后,總清除率為41.9%。說明隨著濾過次數(shù)的增加HIV會被不斷地清除,從而達到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過簡易反應(yīng)器前后p24檢測結(jié)果(pg/ml)

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