本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中艾滋病生物細(xì)胞治療儀的制備及應(yīng)用，主要用于艾滋病患者血細(xì)胞內(nèi)、外艾滋病毒的清除，從而達(dá)到治療艾滋病的目的。

背景技術(shù)：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報告，自1981年美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來，至今全球有208個國家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴(yán)重威脅，約有4000萬人感染了艾滋病，死亡人數(shù)已超過2000萬，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長期，目前已遠(yuǎn)超過100萬。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關(guān)注的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會問題。

人類免疫缺陷病毒是一種感染人類免疫細(xì)胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜(來自宿主細(xì)胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼在電鏡下呈高電子密度，內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細(xì)胞的成分。

HIV進(jìn)入人體后，首先被巨噬細(xì)胞吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因為CD4是HIV的受體，所以經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合)進(jìn)入CD4+細(xì)胞(細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)，在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，每天產(chǎn)生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進(jìn)入其他正常的和再生的CD4+細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，制造更多的病毒感染細(xì)胞，使外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)破壞、減少。HIV的gp120與CD4受體結(jié)合可直接激活受感染的細(xì)胞凋亡，甚至感染HIV的T細(xì)胞表達(dá)的囊膜抗原也可啟動正常T細(xì)胞，通過細(xì)胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起CD4+細(xì)胞的大量破壞，結(jié)果造成以CD4+T細(xì)胞缺損為中心的嚴(yán)重免疫缺陷，患者主要表現(xiàn)：外周淋巴細(xì)胞減少，T4/T8比例配置，對植物血凝素和某些抗原的反應(yīng)消失，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)下降，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細(xì)胞因子合成減少。CD4+T細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細(xì)胞，整個免疫系統(tǒng)就會遭到致命的打擊，對各種疾病的感染都失去抵抗力。HIV進(jìn)入宿主CD4+細(xì)胞后也可以表現(xiàn)為長期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi)，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數(shù)月甚至多年不復(fù)制，造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)繁殖，這些細(xì)胞是體內(nèi)的HIV貯存庫，可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細(xì)胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。經(jīng)大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細(xì)胞釋放并游離于血液，然后再進(jìn)入其他細(xì)胞繼續(xù)感染過程。

HIV感染后可刺激機(jī)體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內(nèi)有保護(hù)作用。但抗體不能與單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細(xì)胞基因組中，因此HIV不會被免疫系統(tǒng)所識別，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個很重要的原因應(yīng)該是，根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機(jī)理推測，免疫性抗體與抗原結(jié)合后，如果要產(chǎn)生免疫效應(yīng)，要么通過激活補(bǔ)體，介導(dǎo)ADCC效應(yīng)溶解細(xì)胞性抗原，但HIV不是細(xì)胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬細(xì)胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬細(xì)胞內(nèi)被保護(hù)、增殖；要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原結(jié)構(gòu)多變，往往使抗體難以識別。

從目前已用于臨床的艾滋病治療方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：僅能防止尚未感染HIV的易感細(xì)胞感染，對已感染的細(xì)胞沒有治療作用，且毒副作用較多，包括腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細(xì)胞性貧血、粒細(xì)胞和血小板減少、胰腺炎，加之交叉耐藥性的產(chǎn)生，這類藥已不單獨使用，主要做聯(lián)合用藥，且易產(chǎn)生耐藥變株，導(dǎo)致臨床療效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制劑：易產(chǎn)生藥物性肝損傷、脂質(zhì)代謝紊亂等毒副作用及耐藥性。(3)HIV整合酶抑制劑：通過抑制HIV病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA整合而發(fā)揮作用，與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合同時使用對抗病毒有協(xié)同作用。(4)抑制HIV病毒進(jìn)入抑制劑：包括阻斷gp120與CD4結(jié)合、阻斷HIV與輔助受體結(jié)合、作用于gp41膜亞單位及作用于T淋巴細(xì)胞表面CC趨化因子受體5(CCR5)來阻斷HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞，但對肝和心臟有副作用。(5)細(xì)胞因子治療：主要用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞動態(tài)平衡。(6)HIV疫苗治療：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破壞免疫系統(tǒng)，病毒突變迅速，導(dǎo)致至今尚未開發(fā)出真正安全有效的疫苗。(7)基因治療：HIV基因治療的研究從未間斷，包括反義技術(shù)、RNA誘餌、RNA干擾、細(xì)胞內(nèi)抗體、顯性陰性突變體、自殺基因等，但進(jìn)入II期臨床試驗階段的基因療法幾乎沒有。(8)單克隆抗體被動免疫療法：通過下調(diào)CD4+T細(xì)胞表面CCR5來降低HIV的易感性、延緩艾滋病的進(jìn)展和減少HIV的擴(kuò)散，中和單克隆抗體2G12、2F5和4E10應(yīng)用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延緩但不能阻止病毒的反彈(9)過繼性免疫細(xì)胞治療：體外大量培養(yǎng)HIV自體的CD4+T細(xì)胞時會導(dǎo)致病毒大量擴(kuò)增，增加病毒感染的CD4+T細(xì)胞數(shù)量，而回輸CD4+T細(xì)胞可能會增加體內(nèi)病毒復(fù)制的場所，導(dǎo)致病毒載量反彈，總體上看，過繼性免疫細(xì)胞治療無明顯的毒副作用，也未取得滿意的治療效果。

人類的吞噬細(xì)胞有大、小兩種，小吞噬細(xì)胞是外周血中的中性粒細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞是血中的單核細(xì)胞和多種器官、組織中的巨噬細(xì)胞，兩者構(gòu)成單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。單核細(xì)胞由骨髓中的單核細(xì)胞前體發(fā)育分化而成，約占血液中白細(xì)胞總數(shù)的3％-8％，其體積較淋巴細(xì)胞略大，單核細(xì)胞在血液中僅停留12-24小時，然后進(jìn)入結(jié)締組織或器官，發(fā)育成熟為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細(xì)胞類型，具有較強(qiáng)的吞噬功能，游走巨噬細(xì)胞大于單核細(xì)胞數(shù)倍，壽命較長，可在組織中存活幾個月，定居的巨噬細(xì)胞有不同的名稱，在肝中為枯否細(xì)胞、在腦中為小膠質(zhì)細(xì)胞、在骨中為破骨細(xì)胞等，其表達(dá)Fc受體、C3b受體和CD14，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應(yīng)性免疫的專職抗原提呈細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進(jìn)入人體后，首先遭到巨噬細(xì)胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細(xì)胞。所以，可以常規(guī)雜交瘤細(xì)胞制備技術(shù)，制備巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)大量擴(kuò)增后用于制備治療艾滋病的凈化器，以巨噬細(xì)胞的吞噬功能來清除血漿中的HIV。

凝膠中抗原-抗體沉淀反應(yīng)于1905年首先應(yīng)用于研究利澤甘氏現(xiàn)象，1932年應(yīng)用于鑒定細(xì)菌菌株，1946年Oudin在試管中進(jìn)行免疫擴(kuò)散試驗，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分別建立了瓊脂雙向雙擴(kuò)散法，用于同時鑒定、比較兩種以上抗原或抗體。凝膠中抗原-抗體沉淀反應(yīng)的介質(zhì)凝膠瓊脂或瓊脂糖是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時能溶于水，冷后凝成凝膠，內(nèi)部形成一種多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而且孔徑很大，可允許大分子物質(zhì)(分子量可達(dá)百萬以上)自由通過?？讖降拇笮∵€決定于瓊脂濃度，瓊脂濃度大，孔徑相對較小，瓊脂濃度小，孔徑相對較大。1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，由于瓊脂或瓊脂糖具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，凝膠后含水量大，透明度好，來源方便，易處理，因此是一種很好的擴(kuò)散介質(zhì)?？乖涂贵w的分子量一般都在20萬以下，在凝膠中從高濃度區(qū)域向低濃度區(qū)域擴(kuò)散時所受的阻力很小，基本上呈自由擴(kuò)散形式。當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體經(jīng)擴(kuò)散后在凝膠中相遇，形成抗原抗體復(fù)合物，若兩者在相遇處比例適當(dāng)，則形成最大的復(fù)合物。由于復(fù)合物的分子量增大，顆粒增大，因而不再繼續(xù)擴(kuò)散而產(chǎn)生沉淀，呈現(xiàn)出線狀或帶狀，這種沉淀就形成了一個“特異性屏障”，凡在免疫學(xué)上與其相同的抗原或抗體分子不能通過，而性質(zhì)不同的那些分子可以通過這個屏障而繼續(xù)擴(kuò)散，直到形成它們自己的復(fù)合物為止。此種反應(yīng)稱為瓊脂凝膠或免疫擴(kuò)散，是目前用已知抗體檢測未知量相應(yīng)抗原的常規(guī)實驗診斷項目，也是《中國藥典》2010版中規(guī)定用于流感病毒疫苗血凝素含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。通常將一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于瓊脂凝膠中，制成含有特異性羊抗人Ig抗血清的瓊脂板，待凝固后打孔，并在相應(yīng)孔中加入待檢人血清(IgG，IgA，IgM等)，使待檢血清在瓊脂板中向四周擴(kuò)散，在抗原和抗體濃度比例合適處發(fā)生結(jié)合，形成肉眼可見的白色沉淀環(huán)而不再擴(kuò)散。由此可見，當(dāng)一種溶液通過半固體凝膠時，其中的大分子溶質(zhì)就被分子篩作用的凝膠孔阻留在凝膠中，特別是其中的抗原能被預(yù)先固定在凝膠中的抗體結(jié)合而被吸附在凝膠中。

總之，各種藥物及生物制品無法有效殺滅體內(nèi)的艾滋病毒，且價格貴，副作用大，至今尚無治療艾滋病的有效方法，已成為久攻不克的世界性難題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供艾滋病生物細(xì)胞治療儀；另一目的是要提供艾滋病生物細(xì)胞治療儀的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：制備能濾除多細(xì)胞結(jié)合而成的含有HIV的大體積細(xì)胞的血液分離器及能分離單個血細(xì)胞和血漿的血漿分離器，以雜交瘤技術(shù)制備既保留原巨噬細(xì)胞特性又能無限生長的雜交瘤巨噬細(xì)胞株并行擴(kuò)增，取巨噬細(xì)胞株以高生物相容性材料包裹而制備能防止細(xì)胞及其碎片濾出并能為細(xì)胞株吞噬HIV提供場所的血液凈化器，取起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃的0.7～1.1％梯度濃度的瓊脂糖，按濃度從高至低依次加入血液凈化器，待冷卻至37℃成為半固體凝膠后再接著加下一次，使凈化器中的凝膠從上到下形成從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，有利于血漿灌流及分子篩和免疫清除的作用，其中巨噬細(xì)胞株被固定在瓊脂糖凝膠中，起吸附HIV之用，所制的艾滋病血液凈化器進(jìn)而與血液、血漿分離器組合并附加計算機(jī)調(diào)控程序而制備艾滋病生物細(xì)胞治療儀，體外循環(huán)中的血液被治療儀中的血液分離器濾除大體積的多核血細(xì)胞，進(jìn)而被血漿分離器分成血漿和單個血細(xì)胞，血漿經(jīng)凈化器清除HIV后與單個血細(xì)胞匯合回輸。

本發(fā)明的技術(shù)核心由血液、血漿分離器和血漿凈化器構(gòu)成，其中血液分離器的孔徑為150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm，能濾除血液中HIV感染細(xì)胞形成的多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體，血漿分離器能分離中等體積的單個血細(xì)胞和血漿，血漿凈化器中的凈化劑由瓊脂凝膠介質(zhì)和巨噬細(xì)胞株制成，巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD4分子是艾滋病毒的受體，具有天然吞噬HIV的特性，本發(fā)明模擬巨噬細(xì)胞體內(nèi)非特異性吞噬模式，當(dāng)含有HIV的血漿流經(jīng)細(xì)胞器時，HIV與巨噬細(xì)胞發(fā)生接觸而被吞噬，隨之被固定于瓊脂凝膠，而且瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，凈化器進(jìn)口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及細(xì)胞與HIV的結(jié)合反應(yīng)；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結(jié)合物，凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療。所以在艾滋病血液凈化治療的體外循環(huán)中，含有大量HIV的大體積細(xì)胞首先被血液分離器濾除，而血漿中游離的HIV被血漿凈化器清除，凈化后的血漿與中等體積的單個血細(xì)胞匯合后回輸，從而清除結(jié)合在細(xì)胞表面和/或細(xì)胞內(nèi)的HIV以及游離于血漿的HIV。本發(fā)明以體外機(jī)械濾除HIV的方法替代長期以來無法有效殺滅HIV的常規(guī)體內(nèi)抗逆轉(zhuǎn)錄藥物治療方法，實現(xiàn)了人工將HIV從體內(nèi)機(jī)械清除的治療新方法。

具體實施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病生物細(xì)胞治療儀的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血液分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4是根據(jù)本發(fā)明提出的凈化器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1中，動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素和血液泵(2)與含有廢液出口(5)的血液分離器(3)相連，血液分離器(3)經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)、循環(huán)管路(7)與血漿分離器(8)相連，血漿分離器(8)的血漿出口經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)與兩個并聯(lián)的凈化器(11)和凈化器(12)相連，兩個凈化器的出口管路(13)與血漿分離器(8)的血細(xì)胞出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流體循環(huán)。

圖2表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖2中，分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細(xì)胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個血細(xì)胞(5)進(jìn)入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進(jìn)而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細(xì)胞和血漿。

圖3表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖3中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的單個血細(xì)胞，5是能通過微孔(3)的血漿化學(xué)成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是具有可開關(guān)閥門的血細(xì)胞出口。

圖4中，1為凈化器，2為固定于瓊脂凝膠中的巨噬細(xì)胞株；3為與血漿一起進(jìn)入瓊脂凝膠的HIV，4為HIV被固定于瓊脂凝膠中的吞噬細(xì)胞吞噬后不再下移的吞噬體，5為巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞因子。

下面結(jié)合圖1、圖2、圖3和圖4，對本發(fā)明提出的艾滋病生物細(xì)胞治療儀的實施方案作詳細(xì)的描述。

一、雜交瘤巨噬細(xì)胞株的制備

1、原代細(xì)胞的來源

(1)單個核血液細(xì)胞：指以密度梯度離心法從血液中分離的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。具體方法是：購買血液中心的濃縮白細(xì)胞或為科研而保存的臍帶血，取2mL標(biāo)本，PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管中水平離心機(jī)中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細(xì)吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細(xì)胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細(xì)胞，取15uL細(xì)胞懸液加入血球計數(shù)板上顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)的細(xì)胞(PBMC)總數(shù)。

(2)單個核組織細(xì)胞：由浙江大學(xué)組織工程研究平臺提供。實質(zhì)上屬于來自脾臟的巨噬細(xì)胞，其制備方法是：①脾臟組織的獲取和轉(zhuǎn)運：在論理委員會批準(zhǔn)和患者知情同意下，取手術(shù)切除的脾臟標(biāo)本組織，立即剪碎成體積約1mm³的小組織塊，移入裝有預(yù)冷4℃的無菌密封瓶內(nèi)，迅速轉(zhuǎn)運至細(xì)胞培養(yǎng)室。②脾臟組織細(xì)胞混懸液的制備：將脾臟組織塊移至無菌操作臺，PBS洗滌3次，RPMI-1640洗滌2次，以清除組織內(nèi)的血液并保證組織的無菌。機(jī)械研磨脾臟組織，這時便有大量的組織細(xì)胞懸混于RPMI-1640液中。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾懸混有組織細(xì)胞的RPMI-1640液，濾液為脾臟組織細(xì)胞混懸液(主要含紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)。③脾臟組織細(xì)胞混懸液中紅細(xì)胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細(xì)胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細(xì)胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內(nèi)的裂解紅細(xì)胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細(xì)胞的存活，此時，混懸液中主要含脾臟組織巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。④脾臟組織巨噬細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)：將前述混懸液作為培養(yǎng)細(xì)胞原液，臺盼藍(lán)染色判定活力并計數(shù)，用RPMI-1640液調(diào)整細(xì)胞濃度為(3～5)×10⁶/L，將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種于玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，50mL/LCO₂，100％濕度，分別培養(yǎng)2～3h，相差顯微鏡下觀察形態(tài)。貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：吸去培養(yǎng)上清液，巨噬細(xì)胞貼壁，PBS反復(fù)吹打、消化，所得細(xì)胞懸液洗滌離心(1000r/min，3min)，得到分離純化的巨噬細(xì)胞。此外，還可以取治療或手術(shù)后廢棄的標(biāo)本提取制備，如腹膜腔液、肺泡、肝臟、脾臟、腹膜組織、小腸黏膜等。

(3)羊水、絨毛細(xì)胞：浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳實驗室備用。在論理委員會批準(zhǔn)和患者知情同意下，取實驗診斷報告后的剩余羊水、絨毛細(xì)胞，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞留用。

2、細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞貼壁初步分選

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，但根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)的不同，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)時間，培養(yǎng)條件等，一般貼壁法將單個核血液細(xì)胞(PBMC)或單個核組織細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h，待單個核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞(巨噬細(xì)胞以外的細(xì)胞不易貼壁而隨上層液除去)，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI-1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞(主要為巨噬細(xì)胞，但還有少量其他貼壁細(xì)胞)。1000r/min離心5min，棄上清。羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)1～7天，出現(xiàn)細(xì)胞生長克隆、細(xì)胞生長匯合率達(dá)到60～80％的對數(shù)生長期細(xì)胞，以胰酶消化，PBS清洗，獲取細(xì)胞懸液，配成合適細(xì)胞濃度。

3、CD4細(xì)胞分選

采用免疫磁珠法分選CD4細(xì)胞：①主要試劑和儀器：CD4免疫磁珠(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)；0.2％臺盼藍(lán)染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國美天旎生物技術(shù)有限公司)。②CD4細(xì)胞免疫磁珠分選方法：細(xì)胞懸液均分至兩個1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細(xì)胞每80uLBuffer含細(xì)胞數(shù)10⁷個，每10⁷個細(xì)胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細(xì)胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細(xì)胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細(xì)胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復(fù)操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4細(xì)胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4細(xì)胞(細(xì)胞活力檢測：細(xì)胞純化前后分別取15uL細(xì)胞懸液與等體積臺盼藍(lán)溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細(xì)胞，著色脹大者為死細(xì)胞，計算200個細(xì)胞中活細(xì)胞的百分比)。此時分選的細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞。

4、CD14細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分選

CD14為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特有的表面標(biāo)志，理論上如果從單個核組織細(xì)胞、羊水細(xì)胞及絨毛細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞為巨噬細(xì)胞；如果從單個核血液細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；但因單核細(xì)胞壽命短、僅在外周血中存活1天且遠(yuǎn)不如巨噬細(xì)胞易于貼壁生長，所以在本發(fā)明的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)中已基本除去，分選出來的細(xì)胞基本為巨噬細(xì)胞。

基本方法類同于CD4細(xì)胞，采用免疫磁珠法。①試劑：人CD14免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，德國)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；②免疫磁珠法：(A)磁珠與特異性靶細(xì)胞一單核細(xì)胞結(jié)合：每1×10⁸個PBMC加入200uL偶聯(lián)CD14抗體的磁珠和800uL緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱預(yù)冷)，在15mL離心管中充分混勻，4℃孵育15min，中間可輕微振搖1次。15min后取出離心管，每1×10⁷個細(xì)胞加入1～2mL預(yù)冷緩沖液，1000r/min，離心8min，棄上清，加入0.5mL緩沖液并吹打成單細(xì)胞懸液。(B)收集磁珠標(biāo)記的單核細(xì)胞：將細(xì)胞分離柱置于MACS磁力架上，加入1mL緩沖液平衡細(xì)胞分離柱，待無液體滴下，立即將上述細(xì)胞懸液加人細(xì)胞分離柱中，用0.5mL緩沖液沖洗細(xì)胞分離柱3次。待沖洗完畢后，加入1mL緩沖液，從磁力架中移出細(xì)胞分離柱，用針柱快速推動，沖出在分離柱中與CD14抗體一磁珠相結(jié)合的細(xì)胞，即為CD14+的巨噬細(xì)胞。

此外，還可采用以下2種方法分選，包括①貼壁法：將PBMC置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，含5％CO：的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h。待單核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞。1000r/min離心5min，棄上清。②流式細(xì)胞術(shù)法：CD14標(biāo)記：取PBMC，用緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁸/mL，在每毫升細(xì)胞懸液中加入CD14+-FITC抗體100uL，4℃避光標(biāo)記18min，再向離心管中加入1mL流式緩沖液以終止染色，PBs洗滌3次，用含2％青鏈霉素的PBS調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL。流式細(xì)胞儀分選：將制備的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀(BD FAcsAriaII，美國)上分選，根據(jù)CD14抗體的熒光強(qiáng)度、細(xì)胞的相對大小以及細(xì)胞的相對顆粒性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，收集CD14+的細(xì)胞。

5、CD14雜交瘤細(xì)胞株(雜交瘤巨噬細(xì)胞株)制備

(1)培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、HAT、HT選擇培養(yǎng)基購自Sigma公司，優(yōu)級胎牛血清(FBS)購白天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司；DMSO(--甲基亞砜)為國產(chǎn)分析純試劑。

(2)骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，立即放入熱水解凍(應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株，該細(xì)胞株生長及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，細(xì)胞的最高生長刻度為9×10⁵/ml，倍增時間通常為10～15h；與人體相關(guān)的實際應(yīng)用中考慮選擇同源細(xì)胞株，如上海復(fù)祥生物科技有限公司向ATCC細(xì)胞庫引進(jìn)的NCI-H929人骨髓瘤細(xì)胞株)。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/m離心3min；重復(fù)1次。將沉淀物移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進(jìn)行一次傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前24小時內(nèi)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，保證融合前細(xì)胞形態(tài)良好、生長旺盛。加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/m離心5-10min，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。

(3)待雜交CD14細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)準(zhǔn)備：本發(fā)明分選的單核巨噬細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細(xì)胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細(xì)胞融合。以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。

(4)細(xì)胞融合：將CD14細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/m離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細(xì)胞無顆粒狀沉淀，重復(fù)2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預(yù)熱離心管，取出后無菌條件下將預(yù)熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預(yù)熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3-5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養(yǎng)基。適當(dāng)混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)具有吞噬功能的單核巨噬細(xì)胞株篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞生長情況，7-10天后僅有雜交瘤細(xì)胞能夠生長分裂，此時棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞克隆生長面積達(dá)到1/10個細(xì)胞孔時，去培養(yǎng)上清，選擇有生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標(biāo)記細(xì)胞株生長的位置、大小，使用無菌槍頭在標(biāo)注的位置吸取細(xì)胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞克隆長滿至孔底面積1/10以上時，取細(xì)胞或培養(yǎng)上清檢測雜交瘤巨噬細(xì)胞(Mφ)株功能。

①雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬細(xì)菌功能檢測：將巨噬細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲蘭液染色，在油鏡下觀察吞噬情況，計數(shù)吞噬細(xì)菌和未吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞數(shù)比例，以吞噬細(xì)菌功能強(qiáng)的巨噬細(xì)胞作為備選陽性克隆株。

②雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬HIV功能檢測：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血漿與雜交瘤巨噬細(xì)胞株混合培養(yǎng)后，分離細(xì)胞株，PBS清洗3次，測定經(jīng)裂解的吞噬細(xì)胞株吞噬HIV的功能，具體根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時被認(rèn)為是陽性。具體按試劑盒說明書操作。

③雜交瘤巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生巨噬細(xì)胞因子檢測：以人巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)按說明書操作，檢測范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性，具體按試劑盒說明書操作。MIF是集細(xì)胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。

根據(jù)檢測結(jié)果，挑選具有較強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能的培養(yǎng)孔中的細(xì)胞克隆重復(fù)進(jìn)行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復(fù)2-3輪，檢測功能穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤巨噬細(xì)胞株的保存與復(fù)蘇：保存前12小時調(diào)整細(xì)胞生長狀態(tài)，取一瓶生長旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，適當(dāng)消化后制成細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細(xì)胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細(xì)胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆?。?fù)蘇前準(zhǔn)備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動使細(xì)胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺內(nèi)無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴(kuò)大培養(yǎng)。

6、雜交瘤巨噬細(xì)胞株治療細(xì)胞制備

即雜交瘤巨噬細(xì)胞株的擴(kuò)增培養(yǎng)。將上述細(xì)胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反復(fù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，直至所需的雜交瘤細(xì)胞株數(shù)量，每傳代培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞株10代，檢測巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株的功能，觀察是否穩(wěn)定。繼續(xù)在數(shù)瓶內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備，保存?zhèn)溆谩?/p>

二、艾滋病血液凈化器的制備

1、凈化劑的充填

將本發(fā)明制備的雜交瘤巨噬細(xì)胞株，以無菌生理鹽水清洗，1000r/min離心，洗凈后以1000r/min離心5min，取細(xì)胞沉淀裝入丙烯酸酯之類高分子材料制成的200ml圓柱形容器內(nèi)，充填至4/5以上，即成圓柱形細(xì)胞柱，將細(xì)胞柱封口備用。另取起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃的0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％的瓊脂糖C1-4B生理鹽水，按高濃度至低濃度依次取40ml瓊脂糖加入細(xì)胞柱內(nèi)，要求先加入的瓊脂糖冷卻至37℃成為半固體后才接著加下一次，使細(xì)胞柱從上到下(從進(jìn)口到出口)形成從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布，其中的雜交瘤巨噬細(xì)胞株被固定在凝膠中起吸附HIV的作用。瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少。凈化器進(jìn)口處瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及細(xì)胞與HIV的結(jié)合反應(yīng)；而出口處濃度高，濾孔就小，易于阻留HIV或大分子結(jié)合物，凈化器組合了多種特異和非特異的HIV清除成份，以免特種毒株因免疫差異所致的無效治療。

2、凈化器的規(guī)格

上述制備的細(xì)胞柱即為凈化器，為底徑小、頂徑大的圓柱形，或方形、漏斗形，容積為200～300ml，進(jìn)出口均設(shè)有細(xì)胞篩網(wǎng)，進(jìn)口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目；出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當(dāng)于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細(xì)菌；液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當(dāng)于4微米)的細(xì)胞濾網(wǎng)，用以阻擋可能濾出的細(xì)胞；液體進(jìn)出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

3、凈化器的材料

血液凈化器選用丙烯酸酯之類的高分子材料，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變。可通過共價、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。在吸附器內(nèi)表面加親水凝膠，將2甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿-丁基異丁烯酸固化在醋酸纖維素膜上，通過控制濕紡過程，可生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，具有較高的血液和細(xì)胞相容性。將某些具有抗凝作用的物質(zhì)固化在載體或吸附器內(nèi)表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，還可降低肝素用量，并有可能實現(xiàn)無肝素化。如將肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亞胺膜上，效果會更好，并可減少吸附期間的過敏反應(yīng)，固化殼聚糖和肝素共價物的聚丙烯腈表面也顯示了良好的血液相容性，并可抑制銅綠假單孢菌的活性，降低細(xì)胞毒性反應(yīng)。將肝素共價結(jié)合到聚醚砜表面，既保持了聚醚砜的力學(xué)性能，又能提高吸附器內(nèi)表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價固化亞油酸膜，或?qū)⒐矁r結(jié)合到聚丙烯酸的亞油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的組織相容性和抗凝血效果。隨著高分子材料和納米技術(shù)的不斷發(fā)展，與人類血管內(nèi)皮接近的材料在不久的將來將會出現(xiàn)。

三、分離器的制備

(一)血液分離器的制備

1、制備原理：①血細(xì)胞、細(xì)菌、病毒的分子大?。喝梭w血液中有形成份(細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。細(xì)菌的大小為：球菌的直徑約在0.75-1.25μm之間，桿菌長度約在2-5μm，螺旋菌長約100-200μm。病毒的大小以納米(nm)為單位[1cm＝10mm，1mm＝1000μm，1μm＝1000nm]，不同病毒間大小差異很大，最小的如植物的聯(lián)體病毒(Geminiviruses)直徑僅18-20nm，最大的動物痘病毒(Poxviruses)大小達(dá)300-450nm×170-260nm，最長的如絲狀病毒科(Filoviridae)病毒粒子大小為80nm×790-14000nm，多數(shù)單個病毒粒子的直徑在100nm左右，艾滋病毒為100-120nm(0.1-0.12μm)。②艾滋病患者血液中存在的相關(guān)成份：多核巨細(xì)胞(HIV感染細(xì)胞表面的gp120與CD4+細(xì)胞結(jié)合而成的大體積的HIV感染細(xì)胞)、gp120細(xì)胞(表面有g(shù)p120但以單個細(xì)胞存在的HIV感染細(xì)胞)、基因整合細(xì)胞(艾滋病感染初期或潛伏期，整合有HIV雙鏈DNA，但細(xì)胞表面沒有g(shù)p120的HIV感染細(xì)胞)、正常白細(xì)胞(未感染HIV的單個細(xì)胞存在的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、血小板、化學(xué)成份(蛋白質(zhì)、糖類、脂類、電解質(zhì)等)、游離的HIV、細(xì)菌及其他微生物。③多核巨細(xì)胞為天然的大體積細(xì)胞；gp120細(xì)胞和基因整合細(xì)胞可通過抗原和抗體的免疫反應(yīng)使細(xì)胞凝集為大體積多細(xì)胞聚合體；游離的HIV可通過載體顆粒/免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇篌w積成份。④根據(jù)上述3點，可以制備能通過單個細(xì)胞但不能通過大體積細(xì)胞或顆粒的血液分離器。⑤選用具有選擇性吸附功能的材料，經(jīng)本發(fā)明的體外血液循環(huán)支路篩除血液中的HIV感染細(xì)胞。

2、血液分離器的材料與要求：同本發(fā)明的凈化器，選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)和白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、C3a、C5a的改變。

3、血液分離器的型號：血液分離器的外形制備成柱形結(jié)構(gòu)(以醋酸纖維或脫脂棉為材料制作濾芯)、扁平結(jié)構(gòu)(以聚醋無紡布為材料制作濾芯)；孔徑制備成150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm的型號。

4、血液分離器的應(yīng)用原則：根據(jù)艾滋病患者的病情選用不同型號的分離器，原則上先選用大孔徑型號做預(yù)篩濾，然后選用較小孔徑的型號。重度艾滋病患者常發(fā)生嚴(yán)重的機(jī)會性感染，血液中含有不同大小的成份。如含有特大體積的真菌、螺旋菌、腫瘤細(xì)胞及其他異物，則選用孔徑為150～250μm或50～150μm的分離器；如為篩濾HIV感染的單核巨噬細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、多細(xì)胞聚合體及吸附有HIV的顆粒性物質(zhì)，以及為了置換易受HIV感染的CD4+細(xì)胞，則選用15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm之類的型號。這幾種型號近似或小于血液中單個紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞的體積，但紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞具有變形運動的特性，能通過比自身體積更小的微孔。

(二)血漿分離器的制備

(1)制備原理：根據(jù)血細(xì)胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(3)型號與規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細(xì)胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過，但能阻擋所有的細(xì)胞成分。

四、艾滋病生物細(xì)胞治療儀的構(gòu)件

1、關(guān)鍵構(gòu)件：(1)血液分離器：用于按體積大小篩除以多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體狀態(tài)存在的HIV感染細(xì)胞，即用于清除血細(xì)胞內(nèi)的HIV；(2)血漿分離器：用于分離單個血細(xì)胞和血漿；(3)血漿凈化器：用于吸附血漿中的HIV。

2、附加構(gòu)件：包括血泵、肝素泵、動靜脈壓和空氣監(jiān)測、溫度控制系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測系統(tǒng)、超濾監(jiān)測和漏血監(jiān)測等部分組成。(1)血泵(Blood Pump)：用來推動血液循環(huán)以維持血液凈化治療的順利進(jìn)行，通常血泵部分往往具有轉(zhuǎn)速檢測功能，以監(jiān)測病人的血流情況，因此血泵轉(zhuǎn)輪與凹槽間距設(shè)定要精確，并需要經(jīng)常調(diào)整，根據(jù)血路泵管的情況，一般將間距設(shè)定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會造成血流檢測不準(zhǔn)；也不可太緊，否則會造成管路破裂。(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當(dāng)于臨床上應(yīng)用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現(xiàn)象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。(3)動靜脈壓監(jiān)測：動脈壓監(jiān)測主要用以動態(tài)監(jiān)測血液分離器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時，動脈壓就會降低；當(dāng)有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時，動脈壓就會升高；靜脈壓監(jiān)測用來監(jiān)測管路血液回流的壓力，當(dāng)分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時，靜脈壓就會下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時，靜脈壓就會升高。(4)空氣監(jiān)測(Air Detector)：用來監(jiān)測血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測到有空氣氣泡時，檢測系統(tǒng)會驅(qū)動動、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明關(guān)鍵構(gòu)件和附加構(gòu)件的基礎(chǔ)上，引入計算機(jī)調(diào)控而制成操作的人性化、治療的個性化、設(shè)計的安全性，以及模塊化、自動監(jiān)測及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報原因及解除信號等微電腦處理的血液凈化治療儀。

五、艾滋病生物細(xì)胞治療儀的連接通路與使用方法

1、安裝：如圖1，以無菌操作連接各部件，包括血液分離器、血漿分離器、血漿凈化器及各循環(huán)管路。

2、排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、凈化器及各循環(huán)管路，排除分離器、凈化器及其循環(huán)管路內(nèi)的氣體、氣泡，仔細(xì)檢查，確認(rèn)無氣體、氣泡后使用。

3、通液：將動脈血路管(1)接通艾滋病患者的動脈血管，在操作中再次仔細(xì)檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

4、抗凝：從肝素泵(2)向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

5、啟動：將動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，將靜脈管路(15)接通靜脈血管，然后打開血液泵(2)，血流量為100～150ml/min，如圖1，當(dāng)動脈血液經(jīng)動脈血路管(1)、肝素和血液泵(2)進(jìn)入血液分離器(3)時，因HIV感染而形成的大體積多核巨細(xì)胞被阻留在血液分離器(3)內(nèi)，單個血細(xì)胞和血漿依次經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)和循環(huán)管路(7)流入血漿分離器(8)，分離的血漿依次經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)流入此時開放的凈化器(11)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經(jīng)出口管路(13)流出，同步向凈化器(12)灌注血漿，在凈化器(11)內(nèi)的血漿將近流完時，再次開始灌注血漿，此時凈化器(12)開始放出血漿，兩個并聯(lián)的凈化器(11)和(12)交替進(jìn)行。如表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖2，血液分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細(xì)胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個血細(xì)胞(5)及血漿進(jìn)入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進(jìn)而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細(xì)胞和血漿。如表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖3，血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，不能通過微孔(3)的單個血細(xì)胞(4)經(jīng)具有可開關(guān)閥門的血細(xì)胞出口(8)流出，進(jìn)入圖1所示的血細(xì)胞出口管路(14)；能通過微孔(3)的血漿及其化學(xué)成分(5)進(jìn)入血漿分離器外腔(6)，然后經(jīng)血漿流出口(7)、圖1所示的血漿泵(9)和血路管(10)進(jìn)入凈化器。如表示圖1中凈化器(11)和(12)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖4，當(dāng)含有HIV(3)的血漿進(jìn)入凈化器(1)時，其中的HIV(3)被固定在瓊脂凝膠中的巨噬細(xì)胞(2)吞噬后形成不再下移的巨噬細(xì)胞吞噬體(4)，另外未被吞噬的100～120nm的HIV又被因濃度更高而孔徑更小的約為85nm的1％濃度的下層瓊脂凝膠分子篩阻留，被清除HIV后的凈化血漿經(jīng)圖1所示的出口管路(13)與血漿分離器(8)分離的單個細(xì)胞在出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流。如此清除HIV，凈化血液，直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束，整個治療過程均由電腦控制，并可隨時檢測工作狀態(tài)，使用方便、自動化和安全。

六、艾滋病生物細(xì)胞治療儀功效的驗證

1、血液分離器濾除HIV感染細(xì)胞功效的驗證

本發(fā)明人按照本發(fā)明的基本方法，做了如下的簡易驗證實驗：取疾控中心和傳染病實驗室生物樣本庫保存的已確診的艾滋病(AIDS)患者的抗凝全血若干份，分別取數(shù)份相同ABO血型的抗凝全血混合成為5例，使血液量足夠大，然后委托浙江省醫(yī)院中心血站按成份輸血的血液成份分離方法，經(jīng)血液成份分離系統(tǒng)分離出白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血漿，取白細(xì)胞成份按常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以適量的生理鹽水懸浮白細(xì)胞沉淀，然后加入合適比例的gp120抗體(上海廣銳生物科技有限公司)，混勻后置37℃反應(yīng)5分鐘，然后以孔徑為20～30um的血液成份分離系統(tǒng)分離出大體積的白細(xì)胞(稱為大白細(xì)胞)，對濾過的白細(xì)胞濾液再進(jìn)一步以孔徑為15～25um的血液成份分離系統(tǒng)分離出中等體積的白細(xì)胞(稱為中白細(xì)胞)，濾液中的白細(xì)胞為小體積的白細(xì)胞(稱為小白細(xì)胞)，分別收集大、中、小白細(xì)胞分離懸液，常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以定量移液器分別吸取等量的大、中、小白細(xì)胞沉淀，常規(guī)方法(機(jī)械或細(xì)胞裂解液)裂解細(xì)胞(如用同種裂解液，需加量相等)，離心沉淀后取上清液，然后根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時被認(rèn)為是陽性，檢測結(jié)果(表1)說明，AIDS患者不同體積大小的白細(xì)胞中的HIV-p24含量不同，在大、中、小白細(xì)胞中HIV-p24的平均含量分別為275.0pg/ml、196.0pg/ml、126.4pg/ml，其中大、小白細(xì)胞中HIV-p24平均含量相差148.6pg/ml，減少了54.4％；在大、中、小白細(xì)胞中HIV-P24的總含量分別為1375.0pg/ml、979.9pg/ml、632.1pg/ml，其中大、小白細(xì)胞中HIV-p24總含量相差742.9pg/ml，減少了54.3％，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，t＝2.43，p＜0.05。說明AIDS患者體內(nèi)的大體積白細(xì)胞或經(jīng)gp120抗體作用后而形成的大體積白細(xì)胞中含有較高含量的HIV，能通過實施本發(fā)明的技術(shù)方案被分離清除。

表1 AIDS患者外周血大、中、小白細(xì)胞中HIV-p24檢測結(jié)果(p24：pg/ml)

2、凈化器清除HIV功效的驗證

為了驗證雜交瘤巨噬細(xì)胞株清除HIV的功效，本發(fā)明設(shè)計了簡易的測試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達(dá)到約10mm長刻度，置血沉管冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細(xì)胞流出但不會阻止小分子的水和化學(xué)成份之類的物質(zhì)通過。另取疾控中心及傳染病實驗室樣本庫保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管(簡易凈化裝置)上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的雜交瘤巨噬細(xì)胞株層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，以人巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)配對檢測，按說明書操作，檢測范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。結(jié)果如表1，濾前血漿中MIF檢測結(jié)果均為陰性(或因含量低于檢測靈敏度、血漿長期保存致降解等)，而濾后血漿中檢測結(jié)果均為陽性。說明巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株在此過程產(chǎn)生了MIF細(xì)胞因子。MIF是集細(xì)胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。在作AIDS血漿濾過簡易凈化器前后MIF配對檢測的同時，本發(fā)明還做了HIV-1p24的配對檢測，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時被認(rèn)為是陽性，結(jié)果(表2)說明AIDS血漿濾過簡易凈化裝置后，部分HIV已被巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株吞噬吸附，濾過后的血漿HIV明顯減少，經(jīng)第1次濾過后，HIV清除率為20.55％，經(jīng)第2次濾過后，HIV清除率為42.83％，p＜0.01，具有明顯的效果，說明隨著濾過次數(shù)的增加HIV會被不斷地清除，從而達(dá)到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過含雜交瘤巨噬細(xì)胞的簡易凈化裝置前后MIF檢測結(jié)果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血漿濾過含雜交瘤巨噬細(xì)胞的簡易凈化裝置前后p24檢測結(jié)果(p24：pg/ml)

總之，上述簡易驗證實驗表明，已被HIV感染的外周血白細(xì)胞易融合成大體積的多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體，能被本發(fā)明的血液分離器分離清除；而血漿中游離的HIV，能被本發(fā)明的血漿凈化劑(雜交瘤巨噬細(xì)胞株、瓊脂凝膠篩)清除，表明以分離器和凈化器(劑)為關(guān)鍵部件構(gòu)成的艾滋病生物細(xì)胞治療儀具有顯著的清除血細(xì)胞內(nèi)、外HIV病毒的治療功效。