本發(fā)明涉及一種天然產(chǎn)物的新用途，特別涉及一種天然p53調(diào)節(jié)劑Jatamanvaltrate P的用途。

背景技術(shù)：

乳腺癌(mammary carcinoma)是由乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞在各種內(nèi)外致癌因素的作用下，細(xì)胞失去正常特性而異常增生，以致超過自我修復(fù)的限度而發(fā)生癌變的疾病，作為一種異質(zhì)性疾病，表現(xiàn)出多種的病理學(xué)特點(diǎn)和臨床以乳腺腫塊為主要表現(xiàn)。其發(fā)病的病因是一個(gè)多因素、多突變積累的過程，目前尚未清楚其發(fā)生。乳腺癌是世界女性癌癥的第一大殺手，世界范圍內(nèi)每年有大約120萬的女性患乳腺癌，其中超過50萬人死亡。尤其是在歐美等發(fā)達(dá)國家，乳腺癌的發(fā)病率占女性惡性腫瘤的首位。美國國家腫瘤研究所預(yù)測，每個(gè)女性至少有13.2％的風(fēng)險(xiǎn)將在一生中患乳腺癌。2008年，大約138萬名患者被新診斷出為乳腺癌，占女性癌癥總數(shù)的比例達(dá)到了23％，其中45萬人死亡，這個(gè)比例占到了總的女性癌癥死亡數(shù)的14％。當(dāng)今乳腺癌的經(jīng)典藥物治療手段有內(nèi)分泌治療、化學(xué)治療等，后者多采用細(xì)胞毒性藥物，在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)也作用于正常細(xì)胞，繼發(fā)一系列毒副反應(yīng)，且預(yù)后不佳。其中，內(nèi)分泌治療的治療機(jī)制尚不十分清晰，但目前仍有大量學(xué)者在分子水平攻克該作用機(jī)制?，F(xiàn)今給出的闡釋主要是關(guān)于雌激素與癌細(xì)胞生長的相關(guān)性，因而，通過藥源性阻斷雌激素受體分泌雌激素是內(nèi)分泌治療的主要作用原理。其中，經(jīng)典藥物以抗雌激素類藥物(他莫昔芬等)和芳香化酶抑制劑(來曲唑等)為主。內(nèi)分泌治療在給廣大患者帶來福音的同時(shí)也存在一些局限性，即某些患者(ER陰性)對激素類藥物并不敏感，存在耐藥現(xiàn)象，因此對于這種現(xiàn)象，我們更多是考慮其他方式來抑制癌細(xì)胞生長，這也是內(nèi)分泌治療法的不足之處?；熕幬镒陨鲜幸詠硎歉黝惏┌Y治療的金標(biāo)準(zhǔn)，常是癌癥患者治療過程的“必經(jīng)之路”，但這也表明了化療藥物作為細(xì)胞毒類藥物抗癌的低選擇性?？v使如此，化療仍是乳腺癌患者抗癌必不可少的一個(gè)基礎(chǔ)治療方案。臨床上常用的化療藥物大致可包括生物烷化劑、抗代謝藥物、抗生素以及紫杉醇類等，多是細(xì)胞毒類藥物，其抗腫瘤細(xì)胞的原理一般都是通過干擾或抑制細(xì)胞的生化代謝過程，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖來達(dá)到抗癌效果。臨床上對于乳腺癌患者化療藥物的選擇多以聯(lián)合用藥為主，應(yīng)根據(jù)患者的乳腺癌分期特點(diǎn)以及相關(guān)指南推薦為患者選擇個(gè)體化化療方案。其中，關(guān)于植物類抗癌藥——紫杉醇類和蒽醌類抗生素作為乳腺癌常用化療藥物的中堅(jiān)力量。目前化療藥物多是以細(xì)胞毒藥物為主，從抑制細(xì)胞生長方面發(fā)揮抗癌作用，抗腫瘤細(xì)胞譜較為廣泛，在產(chǎn)生藥理作用的同時(shí)容易損傷人體的正常細(xì)胞，且易產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞耐藥現(xiàn)象，患者生存質(zhì)量普遍低下。基于傳統(tǒng)化療藥物及內(nèi)分泌治療的局限性以及科學(xué)家們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入了解，人們對腫瘤的治療不再局限于細(xì)胞增殖等單環(huán)節(jié)，開始進(jìn)入了腫瘤發(fā)生機(jī)制多渠道、多靶向研究的新紀(jì)元。隨著時(shí)代的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的生長、分化和轉(zhuǎn)移是由相關(guān)信號傳導(dǎo)通路和生長因子的介導(dǎo)而發(fā)生的，故以此為新的藥用靶點(diǎn)加以調(diào)節(jié)控制，則可有效控制癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，既提高抗癌療效，又能增強(qiáng)傳統(tǒng)抗癌藥物不具備的特異選擇性。分子靶向藥物作為新領(lǐng)域的成果，正處于發(fā)展前沿階段，目前還未有統(tǒng)一分類標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)臨床上多根據(jù)靶向作用點(diǎn)將藥物大致分為兩類——一類是腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)抑制劑，包括蛋白酪氨酸激酶抑制劑(Protein tyrosine kinase,PTK)、蛋白激酶C(Protein kinases C inhibitor)抑制劑以及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)靶分子抑制劑等；另一類是腫瘤血管生成抑制劑，包括作用于表皮生長因子受體HER-2(ErbB-2)的單克隆抗體(曲妥珠單抗)和作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞生長因子(VEGF)的單克隆抗體(貝伐單抗)等。

盡管分子靶向藥物抗癌領(lǐng)域已取得較好成效，但在較長一段時(shí)間內(nèi)還不能替代傳統(tǒng)化療藥物的主導(dǎo)位置，其具體作用機(jī)制和不良反應(yīng)還有待深究。野生型p53通常被認(rèn)為是抑癌蛋白，其可通過激活下游基因如p21、PCNA、GADD45、BAX、NOXA和MDM2的表達(dá)從而介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)、衰老和凋亡。由于p53的突變改變了野生型p53的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄活性以及與p53家族成員的結(jié)合水平，因此p53的突變將使細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)無法正常啟動(dòng)凋亡或衰老相關(guān)的信號通路，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的形成。臨床研究也表明，突變型p53使腫瘤惡性程度增加且預(yù)后更差。因此，針對突變型p53的分子靶向藥物一直是抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)，目前已有多個(gè)品種進(jìn)入臨床研究。迄今為止，所有在臨床實(shí)驗(yàn)中靶向p53的抗腫瘤藥物作用機(jī)制均為抑制野生型p53與E3連接酶MDM2的結(jié)合，從而抑制p53通過泛素蛋白酶體途徑降解；或通過重新激活突變型p53，使之具備野生型p53的結(jié)構(gòu)或功能，但目前針對可降解突變型p53并維持野生型p53穩(wěn)定性的小分子化合物的研發(fā)尚處于起步階段。與此同時(shí)，尋找低毒，高效抗乳腺癌藥物，尤其是p53靶向藥物，仍舊是當(dāng)務(wù)之急。中草藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)藥瑰寶，幾千年來拯救了數(shù)以萬計(jì)的患者。其取材于大自然，以多效、毒副作用小而深得患者青睞。然而，盡管中草藥及天然產(chǎn)物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗乳腺癌的治療中，但目前在臨床上多是采用輔助化學(xué)藥物的復(fù)方治療，而且其作用的分子機(jī)制尚未徹底闡明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種天然p53調(diào)節(jié)劑Jatamanvaltrate P的用途，本發(fā)明首次公開了天然產(chǎn)物Jatamanvaltrate P在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用，為尋找乳腺癌的新的治療方案，及Jatamanvaltrate P進(jìn)入臨床提供了理論依據(jù)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種天然p53調(diào)節(jié)劑Jatamanvaltrate P的用途，Jatamanvaltrate P在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述Jatamanvaltrate P的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

作為優(yōu)選，Jatamanvaltrate P在體外顯著抑制乳腺癌細(xì)胞株的增殖，并且誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，抑制突變型p53的表達(dá)和誘導(dǎo)野生型p53的表達(dá)。

作為優(yōu)選，所述乳腺癌細(xì)胞株為MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次公開了Jatamanvaltrate P在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用，為尋找乳腺癌的新的治療方案，及Jatamanvaltrate P進(jìn)入臨床提供了理論依據(jù)。

附圖說明

圖1：為MTT法檢測Jatamanvaltrate P對MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7細(xì)胞株的生長抑制作用。

圖2：為DAPI染色法檢測Jatamanvaltrate P誘導(dǎo)MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7細(xì)胞株凋亡。

圖3：采用Annexin V/PI法用流式細(xì)胞儀檢測Jatamanvaltrate P誘導(dǎo)MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7細(xì)胞株凋亡。

圖4：流式細(xì)胞術(shù)檢測Jatamanvaltrate P對MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7細(xì)胞周期的影響。

圖5：Western Bolt法檢測Jatamanvaltrate P對MDA-MB-231、MCF-7中p53蛋白表達(dá)情況的影響。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例：

天然產(chǎn)物Jatamanvaltrate P(縮寫JP)制備方法：蜘蛛香根及根莖7kg，打成粗粉后，用95％乙醇冷浸48h，滲漉提取，提取物用水混懸，等體積二氯甲烷萃取3次，至萃取液顏色較淡。取二氯甲烷提取物約190g，進(jìn)行硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯(40:1-0:1)梯度洗脫，得到Fr1-11共計(jì)11個(gè)流分。取Fr7約5g，進(jìn)行反相中壓柱層析分離，以40-60微米的十八烷基鍵合相硅膠為填料，分別以60、70、75、80、90％的甲醇等度洗脫，2000mL/梯度，100mL/瓶，收集90％甲醇洗脫的部分流分，減壓回收溶劑，得到約106.1mg淡黃色油狀物質(zhì)。取約10mg樣品，掃描其¹H NMR、¹³CNMR、HRMS，經(jīng)鑒定該化合物為Jatamanvaltrate P(參見文獻(xiàn)：Su-Juan Wang,Xiao-Qian Qiu,Jian-Yong Zhu,Xue-Qing Ma,Bing Lin,Cheng-Jian Zheng,*and Lu-Ping Qin.Two New Iridoids from the Root and Rhizome of Valeriana jatamansi Jones.Helvetica Chimica Acta,97,722,2014.；Bo Yang,Jian-Fen Zhang,Hui-Zhu Song,Man-Cang Gu,Hua-Jun Zhao and Yao-Kang Xiong.Two new Iridoid esters from the Root and Rhizome of Valeriana jatamansi Jones.Helvetica Chimica Acta,98:pp 1225,2015.)。

Jatamanvaltrate P抑制乳腺癌細(xì)胞株增殖：

選用乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7(來自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)為研究對象。取對數(shù)生長期細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7，加含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基，接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔加入3×10³個(gè)細(xì)胞，總體積為100μl，分別以0、1、10、20、50μM Jatamanvaltrate P加以處理。24小時(shí)或者48小時(shí)或者72小時(shí)后，每孔加入20μL 5mg/ml的MTT工作液，混勻后置37℃、5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。加入100μL三聯(lián)液(10％十二烷基硫酸鈉-5％異丁醇-0.012M鹽酸)，使紫藍(lán)色甲臜沉淀完全溶解。置于酶標(biāo)儀中，用酶標(biāo)儀(570nm)檢測吸光度值，所有試驗(yàn)重復(fù)三次。用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算半數(shù)抑制率(IC₅₀)分別為：MDA-MB-231(4.32±1.34μM),MDA-MB-468(7.05±2.51μM),MDA-MB-453(4.05±0.18μM)，MCF-7(5.59±1.21μM)。結(jié)果見圖1，顯示Jatamanvaltrate P對乳腺癌細(xì)胞株存在明顯的生長抑制作用，均具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

Jatamanvaltrate P誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡：

采用DAPI核染色方法通過熒光顯微鏡觀察凋亡小體是否形成，明確Jatamanvaltrate P誘導(dǎo)乳腺癌的凋亡：首先把乳腺癌細(xì)胞接種在24孔板中(24孔板中鋪上玻片)，細(xì)胞量為8×10⁴/孔，在37℃，5％的CO₂培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后，分別以0、2.5、5μM Jatamanvaltrate P加以處理，等待24小時(shí)后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，加入4％的多聚甲醛將細(xì)胞固定10分鐘，使得細(xì)胞膜的通透性大大增加，用PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入DAPI染液(0.5μg/ml)染色10分鐘，用PBS洗去染液后，取出玻片，放在載玻片上，熒光顯微鏡拍攝。結(jié)果見圖2，顯示Jatamanvaltrate P能促使乳腺癌細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)明顯的凋亡小體，表明Jatamanvaltrate P能顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

采用AnnexinV-FITC/PI雙染后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期的MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7細(xì)胞，加含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔加入4×10⁵個(gè)細(xì)胞，總體積為2mL，接種于6孔板，分別以0、2.5、5μM Jatamanvaltrate P加以處理。24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用冰PBS洗滌2次，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，收集1×10⁵個(gè)細(xì)胞，加入500μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μL的AnnexinV-FITC在避光處染色5分鐘，隨后用PI避光染色10分鐘，最后輕輕地混合細(xì)胞懸液，準(zhǔn)備上機(jī)檢測，采用Millipore Guava流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡，所有試驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果見圖3，顯示Jatamanvaltrate P能顯著增加乳腺癌細(xì)胞凋亡的比例，表明Jatamanvaltrate P能顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴性。

Jatamanvaltrate P阻滯乳腺癌細(xì)胞周期：

采用PI單染后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布：取對數(shù)生長期的MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453、MCF-7細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔加入4×10⁵個(gè)細(xì)胞，總體積為2mL，接種于6孔板，分別以0、2.5、5μM Jatamanvaltrate P加以處理。24小時(shí)后，收集細(xì)胞，用冰PBS洗滌2次，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，收集1×10⁵個(gè)細(xì)胞，加入500μL的PBS重懸細(xì)胞，加入10μL的PI避光染色10分鐘，用Millipore Guava流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布情況，所有試驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果見圖4，顯示Jatamanvaltrate P能顯著阻滯乳腺癌細(xì)胞周期，阻滯MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453三株乳腺癌細(xì)胞于G₂/M期，阻滯MCF-7細(xì)胞于G₀/G₁期，并且具有濃度依賴性。表明Jatamanvaltrate P能顯著阻滯乳腺癌細(xì)胞周期，呈劑量依賴性。

Jatamanvaltrate P調(diào)節(jié)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)：

采用Western Blot法檢測Jatamanvaltrate P處理MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞后p53蛋白的表達(dá)情況：取對數(shù)生長期的MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞，加含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于6cm培養(yǎng)皿，加入8×10⁵個(gè)細(xì)胞/皿，總體積為3mL，分別以0、2.5、5μM Jatamanvaltrate P加以處理24后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，從細(xì)胞中提取總蛋白，Western Blot法檢測p53蛋白的表達(dá)情況，所以實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果見圖5所示，Jatamanvaltrate P能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞中突變型p53的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中野生型的p53的表達(dá)，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。