本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中艾滋病治療細(xì)胞器，主要通過(guò)人工產(chǎn)業(yè)制備HIV敏感細(xì)胞，用于體外吞噬血漿中的游離的HIV，達(dá)到治療艾滋病的目的。

背景技術(shù)：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報(bào)告，自1981年美國(guó)發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來(lái)，至今全球有208個(gè)國(guó)家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴(yán)重威脅，約有4000萬(wàn)人感染了艾滋病，死亡人數(shù)已超過(guò)2000萬(wàn)，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時(shí)每天約有300多人死于艾滋病。在中國(guó)HIV感染者正處于高速增長(zhǎng)期，目前已遠(yuǎn)超過(guò)100萬(wàn)。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個(gè)人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關(guān)注的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題。

HIV是感染人類免疫細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄病毒，直徑約120納米，大致呈球形，外膜是類脂包膜(來(lái)自宿主細(xì)胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41，gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過(guò)非共價(jià)作用結(jié)合，向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來(lái)自宿主細(xì)胞的成分。

HIV進(jìn)入人體后，首先遭到巨噬細(xì)胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集。因?yàn)镃D4是HIV的受體，所以經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的HIV通過(guò)其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合)進(jìn)入CD4+細(xì)胞(細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等)，在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，每天產(chǎn)生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進(jìn)入其他正常的和再生的CD4+細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，制造更多的病毒感染細(xì)胞，使外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)破壞、減少。CD4+T細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細(xì)胞，整個(gè)免疫系統(tǒng)就會(huì)遭到致命的打擊，對(duì)各種疾病的感染都失去抵抗力；HIV進(jìn)入宿主CD4+細(xì)胞后也可以表現(xiàn)為長(zhǎng)期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi)，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數(shù)月甚至多年不復(fù)制，造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)繁殖，這些細(xì)胞是體內(nèi)的HIV貯存庫(kù)，可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細(xì)胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。經(jīng)大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細(xì)胞釋放并游離于血液，然后再進(jìn)入其他細(xì)胞繼續(xù)感染過(guò)程。

HIV感染后可刺激機(jī)體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測(cè)出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說(shuō)明該抗體在體內(nèi)有保護(hù)作用。但抗體不能與單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細(xì)胞基因組中，因此HIV不會(huì)被免疫系統(tǒng)所識(shí)別，所以僅依靠自身免疫功能無(wú)法將其清除。另一個(gè)很重要的原因是，根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機(jī)理，免疫性抗體與抗原結(jié)合后，要產(chǎn)生免疫效應(yīng)，要么通過(guò)激活補(bǔ)體，介導(dǎo)ADCC效應(yīng)溶解細(xì)胞性抗原，但HIV不是細(xì)胞性抗原；要么通過(guò)趨化作用吸引吞噬細(xì)胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬細(xì)胞內(nèi)被保護(hù)、增殖；要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用，使失去感染力，但HIV無(wú)法被免疫系統(tǒng)殺滅、清除。

20世紀(jì)開(kāi)始研究的血液凈化技術(shù)，是指把患者的血液引出體外并通過(guò)一種凈化裝置，除去其中某些致病物質(zhì)，凈化血液，再回輸入體內(nèi)，達(dá)到治療疾病的目的。早期的血液凈化常指血液透析技術(shù)，用于尿毒癥患者腎替代治療，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和血液凈化裝置的發(fā)展，在血液透析的基礎(chǔ)上派生出不同的血液凈化方式，如血漿置換、血液灌流、免疫吸附、血液濾過(guò)等。不同血液凈化技術(shù)的應(yīng)用，大大改善了某些疑難復(fù)雜疾病的治療，主要應(yīng)用血漿置換技術(shù)分離并清除大分子免疫復(fù)合物類致病因子以減輕、調(diào)節(jié)和治療某些免疫性疾病。20世紀(jì)80年代以來(lái)，浙大一院李蘭娟團(tuán)隊(duì)開(kāi)始運(yùn)用血漿置換治療肝衰竭，取得了較好療效，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)立了非生物型、生物型、混合型人工肝支持系統(tǒng)，以及所涉及的人工肝透析器、血液濾過(guò)器、活性炭(樹(shù)脂)吸附器、生物反應(yīng)器等人工肝支持系統(tǒng)部件的改良和創(chuàng)新。但未見(jiàn)以血液凈化技術(shù)清除HIV感染細(xì)胞及游離的HIV的報(bào)道。

目前艾滋病治療常用的抗病毒一線藥物是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，該藥不能殺滅HIV，存在個(gè)體差異、耐藥性、腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細(xì)胞性貧血、粒細(xì)胞和血小板減少、胰腺炎、肝損傷等多種毒副作用，其他如HIV蛋白酶抑制劑、HIV整合酶抑制劑、細(xì)胞因子、疫苗治療、基因治療和單克隆抗體被動(dòng)免疫療法等，均因?yàn)楦鞣N原因而難以普遍應(yīng)用。有文獻(xiàn)報(bào)道利用T細(xì)胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激劑，大量培養(yǎng)艾滋病患者分離的T細(xì)胞后，作為自身治療性細(xì)胞回輸，但HIV也隨著HIV感染細(xì)胞的培養(yǎng)繁殖而在胞內(nèi)增殖，增量T細(xì)胞的回輸也導(dǎo)致了增量HIV的回輸。

人類的吞噬細(xì)胞有大、小兩種，小吞噬細(xì)胞是外周血中的中性粒細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞是血中的單核細(xì)胞和多種器官、組織中的巨噬細(xì)胞，兩者構(gòu)成單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。單核細(xì)胞由骨髓中的單核細(xì)胞前體發(fā)育分化而成，約占血液中白細(xì)胞總數(shù)的3％一8％，其體積較淋巴細(xì)胞略大，單核細(xì)胞在血液中僅停留12-24小時(shí)，然后進(jìn)入結(jié)締組織或器官，發(fā)育成熟為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細(xì)胞類型，具有較強(qiáng)的吞噬功能，游走巨噬細(xì)胞大于單核細(xì)胞數(shù)倍，壽命較長(zhǎng)，可在組織中存活幾個(gè)月，定居的巨噬細(xì)胞有不同的名稱，在肝中為枯否細(xì)胞、在腦中為小膠質(zhì)細(xì)胞、在骨中為破骨細(xì)胞等，其表達(dá)Fc受體、C3b受體和CDl4，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應(yīng)性免疫的專職抗原提呈細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進(jìn)入人體后，首先遭到巨噬細(xì)胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細(xì)胞。

綜上所述，巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進(jìn)入人體后，首先遭到巨噬細(xì)胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細(xì)胞，最后死于CD4+T細(xì)胞大量破壞、功能喪失而致的各種疾病。

人體缺乏殺滅HIV的免疫力，體內(nèi)使用的藥物療效不佳且毒副作用大，艾滋病是久攻不克的世界性難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供艾滋病治療細(xì)胞器；另一目的是要提供細(xì)胞器的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：以免疫磁珠法分離出CDl4細(xì)胞，進(jìn)而制備既保留原巨噬細(xì)胞特性又能無(wú)限生長(zhǎng)的雜交瘤巨噬細(xì)胞株，選擇對(duì)HIV強(qiáng)吞噬性的克隆作擴(kuò)增培養(yǎng)和保存，將由此制備的雜交瘤巨噬細(xì)胞株以高生物相容性材料包裹而制備能防止細(xì)胞及其碎片甚至HIV濾出的、能為細(xì)胞株吞噬HIV提供場(chǎng)所的細(xì)胞器，與血漿分離器構(gòu)成體外循環(huán)，分離的血漿經(jīng)細(xì)胞器濾出后，其中的HIV被巨噬細(xì)胞株吞噬清除，同時(shí)產(chǎn)生的抗感染巨噬細(xì)胞因子隨血漿回輸體內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)既清除HIV又補(bǔ)充所需巨噬細(xì)胞因子的艾滋病雜交瘤技術(shù)體外新療法，比局限于在體內(nèi)殺滅HIV但又難以實(shí)現(xiàn)的傳統(tǒng)療法更可行而無(wú)毒副作用。

本發(fā)明以經(jīng)典的免疫磁珠分離法分離巨噬細(xì)胞，以經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)制備巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，使之既保留吞噬HIV的活性，又具有無(wú)限生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞特性，經(jīng)擴(kuò)增后以高生物相容性材料包裹制成艾滋病治療細(xì)胞器，其中的巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD4分子是艾滋病毒的受體，具有天然吞噬HIV的特性，本發(fā)明模擬巨噬細(xì)胞體內(nèi)非特異性吞噬模式，當(dāng)含有HIV的血漿流經(jīng)細(xì)胞器時(shí)，HIV與巨噬細(xì)胞發(fā)生接觸而被吞噬，清除HIV后的血漿與血細(xì)胞匯合后回輸，能在治療中使體內(nèi)HIV不斷被清除而減少直至消失，能有效阻斷新生的CD4+T細(xì)胞再被HIV感染，從而達(dá)到免疫重建的治療目的，與目前難以在體內(nèi)殺滅HIV和難以有效阻斷從血漿到巨噬細(xì)胞再到CD4+T細(xì)胞的循環(huán)感染途徑，且費(fèi)用昂貴，藥副作用大的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄治療相比，本發(fā)明更經(jīng)濟(jì)、幾乎無(wú)藥副作用，實(shí)現(xiàn)了人工將HIV從體內(nèi)轉(zhuǎn)移到體外而清除的治療新方法。

具體實(shí)施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病治療細(xì)胞器的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病治療細(xì)胞器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。

圖1中，動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連，血漿分離器(4)經(jīng)血漿泵(6)和循環(huán)管路(7)與兩個(gè)并聯(lián)的細(xì)胞器(8)、細(xì)胞器(9)相連，然后依次與循環(huán)管路(10)、靜脈管路(5)相連，靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。

圖2中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過(guò)微孔(3)的血細(xì)胞，5是能通過(guò)微孔(3)的小分子血漿成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是可開(kāi)關(guān)的閥門。

圖3中，1是細(xì)胞器，2是雜交瘤巨噬細(xì)胞株，3是進(jìn)入細(xì)胞器的游離的HIV，4是HIV與雜交瘤巨噬細(xì)胞株的結(jié)合物，5是雜交瘤巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生的細(xì)胞因子。

下面結(jié)合圖1、圖2和圖3，對(duì)本發(fā)明提出的艾滋病治療細(xì)胞器的實(shí)施方案作詳細(xì)的描述。

1、原代細(xì)胞來(lái)源

(1)單個(gè)核血液細(xì)胞：指以密度梯度離心法從血液中分離的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。具體方法是：購(gòu)買血液中心的濃縮白細(xì)胞或?yàn)榭蒲卸４娴哪殠а?，?mL標(biāo)本，PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管中水平離心機(jī)中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細(xì)吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細(xì)胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細(xì)胞，取15uL細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞(PBMC)總數(shù)。

(2)單個(gè)核組織細(xì)胞：由浙江大學(xué)組織工程研究平臺(tái)提供。實(shí)質(zhì)上屬于來(lái)自脾臟的巨噬細(xì)胞，其制備方法是：①脾臟組織的獲取和轉(zhuǎn)運(yùn)：在論理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意下，取手術(shù)切除的脾臟標(biāo)本組織，立即剪碎成體積約1mm³的小組織塊，移入裝有預(yù)冷4℃的無(wú)菌密封瓶?jī)?nèi)，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞培養(yǎng)室。②脾臟組織細(xì)胞混懸液的制備：將脾臟組織塊移至無(wú)菌操作臺(tái)，PBS洗滌3次，RPMI-1640洗滌2次，以清除組織內(nèi)的血液并保證組織的無(wú)菌。機(jī)械研磨脾臟組織，這時(shí)便有大量的組織細(xì)胞懸混于RPMI-1640液中。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾懸混有組織細(xì)胞的RPMI-1640液，濾液為脾臟組織細(xì)胞混懸液(主要含紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)。③脾臟組織細(xì)胞混懸液中紅細(xì)胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細(xì)胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細(xì)胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內(nèi)的裂解紅細(xì)胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細(xì)胞的存活，此時(shí)，混懸液中主要含脾臟組織巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。④脾臟組織巨噬細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)：將前述混懸液作為培養(yǎng)細(xì)胞原液，臺(tái)盼藍(lán)染色判定活力并計(jì)數(shù)，用RPMI-1640液調(diào)整細(xì)胞濃度為(3～5)×10⁶/L，將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種于玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，50mL/LCO₂，100％濕度，分別培養(yǎng)2～3h，相差顯微鏡下觀察形態(tài)。貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：吸去培養(yǎng)上清液，巨噬細(xì)胞貼壁，PBS反復(fù)吹打、消化，所得細(xì)胞懸液洗滌離心(1000r/min，3min)，得到分離純化的巨噬細(xì)胞。此外，還可以取治療或手術(shù)后廢棄的標(biāo)本提取制備，如腹膜腔液、肺泡、肝臟、脾臟、腹膜組織、小腸黏膜等。

(3)羊水、絨毛細(xì)胞：浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳實(shí)驗(yàn)室備用。在論理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意下，取實(shí)驗(yàn)診斷報(bào)告后的剩余羊水、絨毛細(xì)胞，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞留用。

2、細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞貼壁初步分選

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，但根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)的不同，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)條件等，一般貼壁法將單個(gè)核血液細(xì)胞(PBMC)或單個(gè)核組織細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國(guó))中孵育2h，待單個(gè)核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞(巨噬細(xì)胞以外的細(xì)胞不易貼壁而隨上層液除去)，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞(主要為巨噬細(xì)胞，但還有少量其他貼壁細(xì)胞)。1000r/min離心5min，棄上清。羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)1～7天，出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)克隆、細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)到60～80％的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以胰酶消化，PBS清洗，獲取細(xì)胞懸液，配成合適細(xì)胞濃度。

3、CD4細(xì)胞分選

采用免疫磁珠法分選CD4細(xì)胞：①主要試劑和儀器：CD4免疫磁珠(德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)；0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)。②CD4細(xì)胞免疫磁珠分選方法：細(xì)胞懸液均分至兩個(gè)1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細(xì)胞每80uLBuffer含細(xì)胞數(shù)10⁷個(gè)，每10⁷個(gè)細(xì)胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細(xì)胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細(xì)胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場(chǎng)中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細(xì)胞懸液通過(guò)分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復(fù)操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4細(xì)胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4細(xì)胞(細(xì)胞活力檢測(cè)：細(xì)胞純化前后分別取15uL細(xì)胞懸液與等體積臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細(xì)胞，著色脹大者為死細(xì)胞，計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中活細(xì)胞的百分比)。此時(shí)分選的細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞。

4、CDl4細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分選

CDl4為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特有的表面標(biāo)志，理論上如果從單個(gè)核組織細(xì)胞、羊水細(xì)胞及絨毛細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞為巨噬細(xì)胞；如果從單個(gè)核血液細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；但因單核細(xì)胞壽命短、僅在外周血中存活1天且遠(yuǎn)不如巨噬細(xì)胞易于貼壁生長(zhǎng)，所以在本發(fā)明的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)中已基本除去，分選出來(lái)的細(xì)胞基本為巨噬細(xì)胞。

基本方法類同于CD4細(xì)胞，采用免疫磁珠法。①試劑：人CDl4免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，德國(guó))，RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；②免疫磁珠法：(A)磁珠與特異性靶細(xì)胞一單核細(xì)胞結(jié)合：每1×10⁸個(gè)PBMC加入200uL偶聯(lián)CDl4抗體的磁珠和800uL緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱預(yù)冷)，在15mL離心管中充分混勻，4℃孵育15min，中間可輕微振搖1次。15min后取出離心管，每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加入1～2mL預(yù)冷緩沖液，1000r/min，離心8min，棄上清，加入0.5mL緩沖液并吹打成單細(xì)胞懸液。(B)收集磁珠標(biāo)記的單核細(xì)胞：將細(xì)胞分離柱置于MACS磁力架上，加入1mL緩沖液平衡細(xì)胞分離柱，待無(wú)液體滴下，立即將上述細(xì)胞懸液加人細(xì)胞分離柱中，用0.5mL緩沖液沖洗細(xì)胞分離柱3次。待沖洗完畢后，加入1mL緩沖液，從磁力架中移出細(xì)胞分離柱，用針柱快速推動(dòng)，沖出在分離柱中與CDl4抗體一磁珠相結(jié)合的細(xì)胞，即為CDl4+的巨噬細(xì)胞。

此外，還可采用以下2種方法分選，包括①貼壁法：將PBMC置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，含5％CO：的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國(guó))中孵育2h。待單核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞。1000r/min離心5min，棄上清。②流式細(xì)胞術(shù)法：CDl4標(biāo)記：取PBMC，用緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁸/mL，在每毫升細(xì)胞懸液中加入CDl4+-FITC抗體100uL，4℃避光標(biāo)記18min，再向離心管中加入1mL流式緩沖液以終止染色，PBs洗滌3次，用含2％青鏈霉素的PBS調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL。流式細(xì)胞儀分選：將制備的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀(BD FAcsAria II，美國(guó))上分選，根據(jù)CDl4抗體的熒光強(qiáng)度、細(xì)胞的相對(duì)大小以及細(xì)胞的相對(duì)顆粒性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，收集CDl4+的細(xì)胞。

5、CDl4雜交瘤細(xì)胞株(雜交瘤巨噬細(xì)胞株)制備

(1)培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、HAT、HT選擇培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司，優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)購(gòu)白天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司；DMSO(--甲基亞砜)為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

(2)骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，立即放入熱水解凍(應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株，該細(xì)胞株生長(zhǎng)及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，細(xì)胞的最高生長(zhǎng)刻度為9×10⁵/ml，倍增時(shí)間通常為10～15h；與人體相關(guān)的實(shí)際應(yīng)用中考慮選擇同源細(xì)胞株，如上海復(fù)祥生物科技有限公司向ATCC細(xì)胞庫(kù)引進(jìn)的NCI-H929人骨髓瘤細(xì)胞株)。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/m離心3min；重復(fù)1次。將沉淀物移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4天進(jìn)行一次傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前24小時(shí)內(nèi)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，保證融合前細(xì)胞形態(tài)良好、生長(zhǎng)旺盛。加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/m離心5-10min，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。

(3)待雜交CDl4細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)準(zhǔn)備：本發(fā)明分選的單核巨噬細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細(xì)胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細(xì)胞融合。以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。

(4)細(xì)胞融合：將CDl4細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/m離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細(xì)胞無(wú)顆粒狀沉淀，重復(fù)2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預(yù)熱離心管，取出后無(wú)菌條件下將預(yù)熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預(yù)熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3-5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過(guò)程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養(yǎng)基。適當(dāng)混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(5)具有吞噬功能的雜交瘤單核巨噬細(xì)胞株篩選：觀察96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞生長(zhǎng)情況，7-10天后僅有雜交瘤細(xì)胞能夠生長(zhǎng)分裂，此時(shí)棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞克隆生長(zhǎng)面積達(dá)到1/10個(gè)細(xì)胞孔時(shí)，去培養(yǎng)上清，選擇有生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標(biāo)記細(xì)胞株生長(zhǎng)的位置、大小，使用無(wú)菌槍頭在標(biāo)注的位置吸取細(xì)胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞克隆長(zhǎng)滿至孔底面積1/10以上時(shí)，取細(xì)胞或培養(yǎng)上清檢測(cè)雜交瘤巨噬細(xì)胞(Mφ)株功能。具體方法如下：

①雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬細(xì)菌功能檢測(cè)：將巨噬細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲蘭液染色，在油鏡下觀察吞噬情況，計(jì)數(shù)吞噬細(xì)菌和未吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞數(shù)比例，以吞噬細(xì)菌功能強(qiáng)的巨噬細(xì)胞作為備選陽(yáng)性克隆株。

②雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬HIV功能檢測(cè)：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血漿與雜交瘤巨噬細(xì)胞株混合培養(yǎng)后，分離細(xì)胞株，PBS清洗3次，測(cè)定經(jīng)裂解的吞噬細(xì)胞株吞噬HIV的功能，具體根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性。具體按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

③雜交瘤巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生巨噬細(xì)胞因子檢測(cè)：以人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)按說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性，具體按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。MIF是集細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，挑選具有較強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能的培養(yǎng)孔中的細(xì)胞克隆重復(fù)進(jìn)行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復(fù)2-3輪，檢測(cè)功能穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)。

(6)雜交瘤巨噬細(xì)胞株的保存與復(fù)蘇：保存前12小時(shí)調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，取一瓶生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，適當(dāng)消化后制成細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細(xì)胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細(xì)胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過(guò)夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆谩?fù)蘇前準(zhǔn)備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動(dòng)使細(xì)胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下打開(kāi)凍存管，將解凍后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴(kuò)大培養(yǎng)。

6、雜交瘤巨噬細(xì)胞株的擴(kuò)增

即雜交瘤巨噬細(xì)胞株的產(chǎn)業(yè)培養(yǎng)。將上述細(xì)胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反復(fù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，直至所需的雜交瘤細(xì)胞株數(shù)量，每傳代培養(yǎng)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株10代，檢測(cè)雜交瘤巨噬細(xì)胞株的功能，觀察是否穩(wěn)定。繼續(xù)在數(shù)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備。

7、雜交瘤巨噬細(xì)胞株細(xì)胞器的制備(艾滋病治療細(xì)胞器的制備)

將本發(fā)明(上述)制備的雜交瘤巨噬細(xì)胞株，以生理鹽水清洗后，再以1000r/min離心5min(低速短時(shí)離心)，取細(xì)胞沉淀裝入丙烯酸酯之類高生物相容性材料制成的圓柱形容器內(nèi)，然后加滿無(wú)菌生理鹽水，使雜交瘤巨噬細(xì)胞株的濃度為80％～90％，封口，制成即時(shí)使用的艾滋病治療細(xì)胞器。細(xì)胞器內(nèi)的雜交瘤巨噬細(xì)胞株具有吞噬和吸附HIV以及分泌巨噬細(xì)胞因子的功能，細(xì)胞器的外形可制成漏斗形，底徑小，頂徑大，容積為200～300ml，進(jìn)出口均設(shè)有細(xì)胞篩網(wǎng)，進(jìn)口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目；出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當(dāng)于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細(xì)菌；液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當(dāng)于4微米)的細(xì)胞濾網(wǎng)，用以阻擋可能濾出的細(xì)胞；液體進(jìn)出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。當(dāng)經(jīng)體外循環(huán)裝置分離的血漿流經(jīng)細(xì)胞器時(shí)，游離的HIV被相應(yīng)的雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬吸附，凈化后的血漿從細(xì)胞器流出，與分離器分離的血細(xì)胞匯合后回輸體內(nèi)。本發(fā)明的艾滋病治療細(xì)胞器可以委托專業(yè)商家制備。

8、血漿分離器的制備

(1)制備原理：根據(jù)血細(xì)胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可選用聚醋無(wú)紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^(guò)共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(3)型號(hào)與規(guī)格：就分離器的外形來(lái)說(shuō)，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無(wú)紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細(xì)胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長(zhǎng)度為13.5～26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過(guò)，但能阻擋所有的細(xì)胞成分。

9、艾滋病治療細(xì)胞器的應(yīng)用

按本發(fā)明中圖1的應(yīng)用示意圖，連接血漿分離器和細(xì)胞器，構(gòu)成體外循環(huán)裝置，具體方法如下：

(1)安裝：以無(wú)菌操作連接各部件，包括血漿分離器、細(xì)胞器及各循環(huán)管路。

(2)排氣：以無(wú)菌生理鹽水充液分離器、細(xì)胞器及各循環(huán)管路，排除分離器、細(xì)胞器及其循環(huán)管道內(nèi)的氣體、氣泡，仔細(xì)檢查，確認(rèn)無(wú)氣體、氣泡后使用。

(3)通液：將動(dòng)脈血路管1接通艾滋病患者的動(dòng)脈血管，在操作中再次仔細(xì)檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

(4)抗凝：從肝素泵向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

(5)啟動(dòng)：將靜脈管路(5)接通艾滋病患者的靜脈血管，然后打開(kāi)血液泵，血流量為100～150ml/min，如圖1，當(dāng)動(dòng)脈血液經(jīng)動(dòng)脈血路管(1)進(jìn)入血漿分離器(4)時(shí)，分離出來(lái)的血漿在血漿泵6的作用下經(jīng)循環(huán)管路(7)到達(dá)細(xì)胞器(8)，待充滿血漿、約10分鐘，開(kāi)始放出血漿，經(jīng)循環(huán)管路(10)流出，同步向細(xì)胞器(9)灌注血漿，在細(xì)胞器(8)內(nèi)的血漿將近流完時(shí)，再次開(kāi)始灌注血漿，此時(shí)細(xì)胞器(9)開(kāi)始放出血漿，兩個(gè)并聯(lián)的細(xì)胞器(8)、細(xì)胞器(9)交替進(jìn)行。如圖2，當(dāng)待分離的血液進(jìn)入血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)時(shí)，經(jīng)閥門(8)的作用，能通過(guò)微孔(3)的小分子血漿成份(5)進(jìn)入分離器的外腔(6)，然后經(jīng)血漿出口(7)流出，而不能通過(guò)微孔(3)的血細(xì)胞(4)經(jīng)閥門(8)流出。如圖3，當(dāng)含有HIV(3)的血漿進(jìn)入細(xì)胞器(1)時(shí)，其中的HIV(3)被固定在細(xì)胞器中的雜交瘤巨噬細(xì)胞株(2)吞噬吸附，形成復(fù)合物(4)而不再往下移動(dòng)，而雜交瘤巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生的細(xì)胞因子(5)混合在清除了HIV后的血漿中流出細(xì)胞器后，經(jīng)圖1所示的靜脈管路(5)回輸。如此直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束。如果配套電腦程序控制，整個(gè)治療過(guò)程均由電腦控制，并可隨時(shí)檢測(cè)工作狀態(tài)，使用會(huì)更加方便、自動(dòng)化和安全。

10、艾滋病治療細(xì)胞器的附加部件

圖1給出的艾滋病治療細(xì)胞器是本發(fā)明的基本構(gòu)成部份，在此基礎(chǔ)上還可以改裝以下部件，包括動(dòng)靜脈壓和空氣監(jiān)測(cè)、溫度控制系統(tǒng)、配液系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、超濾監(jiān)測(cè)和漏血監(jiān)測(cè)等部分。

(1)動(dòng)靜脈壓監(jiān)測(cè)：動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)主要用以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測(cè)體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)降低；當(dāng)有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)升高；靜脈壓監(jiān)測(cè)用來(lái)監(jiān)測(cè)管路血液回流的壓力，當(dāng)分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時(shí)，靜脈壓就會(huì)下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時(shí)，靜脈壓就會(huì)升高。

(2)空氣監(jiān)測(cè)(Air Detector)：用來(lái)監(jiān)測(cè)血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測(cè)的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測(cè)到有空氣氣泡時(shí)，檢測(cè)系統(tǒng)會(huì)驅(qū)動(dòng)動(dòng)、靜脈血路夾來(lái)阻斷血流，防止危險(xiǎn)的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明基本構(gòu)成體系的基礎(chǔ)上，有望進(jìn)一步研發(fā)自動(dòng)化治療儀器，發(fā)展為操作的人性化、治療的個(gè)性化、設(shè)計(jì)的安全性以及模塊化、自動(dòng)監(jiān)測(cè)及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報(bào)原因及解除信號(hào)等微電腦處理系統(tǒng)。

11、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為了解本發(fā)明的功效，設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)易細(xì)胞器的功效測(cè)試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的雜交瘤巨噬細(xì)胞株至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在56℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達(dá)到約10mm長(zhǎng)刻度，置血沉架冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細(xì)胞流出但不會(huì)阻止小分子的水和化學(xué)成份之類的物質(zhì)通過(guò)。另取浙江省疾控中心等樣本庫(kù)保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管(簡(jiǎn)易細(xì)胞器)上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的雜交瘤巨噬細(xì)胞株層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，以人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)配對(duì)檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。結(jié)果如表1，濾前血漿中MIF檢測(cè)結(jié)果均為陰性(或因含量低于檢測(cè)靈敏度、血漿長(zhǎng)期保存致降解等)，而濾后血漿中檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明巨噬細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株在此過(guò)程產(chǎn)生了MIF細(xì)胞因子。MIF是集細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。在作AIDS血漿濾過(guò)簡(jiǎn)易細(xì)胞器前后MIF配對(duì)檢測(cè)的同時(shí)，本發(fā)明還做了HIV-1p24的配對(duì)檢測(cè)，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果(表2)說(shuō)明AIDS血漿濾過(guò)簡(jiǎn)易細(xì)胞器后，部分HIV已被雜交瘤巨噬細(xì)胞株吞噬吸附，濾過(guò)后的血漿HIV明顯減少，經(jīng)第1次濾過(guò)后，HIV清除率為20.55％，經(jīng)第2次濾過(guò)后，HIV清除率為42.83％，p＜0.01，具有顯著的效果，說(shuō)明隨著濾過(guò)次數(shù)的增加，HIV會(huì)被不斷地清除，從而達(dá)到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過(guò)簡(jiǎn)易細(xì)胞器前后MIF配對(duì)檢測(cè)結(jié)果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血漿濾過(guò)簡(jiǎn)易細(xì)胞器前后p24檢測(cè)結(jié)果(p24：pg/ml)

總之，從表1和表2的結(jié)果表明，含有HIV的血漿經(jīng)本發(fā)明的艾滋病治療細(xì)胞器濾過(guò)后，其中的HIV能被細(xì)胞器中的雜交瘤巨噬細(xì)胞株吸附清除，效果顯著；與此同時(shí)，雜交瘤巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生了具有抗感染和免疫作用的細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明的艾滋病治療細(xì)胞器具有顯著的功效。