本發(fā)明屬于醫(yī)用敷料領(lǐng)域，具體涉及一種新型殼聚糖膠原海綿敷料及其制備方法。

背景技術(shù)：

皮膚是人體重要的屏障組織，具有免疫保護(hù)和修復(fù)能力。創(chuàng)傷后發(fā)生的皮膚屏障缺損可導(dǎo)致許多局部和全身問題。臨床上常用生物敷料覆蓋創(chuàng)面以暫時(shí)替代皮膚的屏障功能。理想的生物敷料應(yīng)具有以下性能：1.物理性能：透氣性、保濕性、機(jī)械穩(wěn)定性、創(chuàng)面貼附性和吸收創(chuàng)面滲液的能力；2.生物性能：生物安全性、生物相容性、防腐抗菌性、可降解性、止血性和促進(jìn)創(chuàng)面愈合、抑制瘢痕形成的能力。

以纖維素及其衍生物為代表的傳統(tǒng)敷料具有吸收滲液能力強(qiáng)，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，但不具有保濕性、抗菌性等特點(diǎn)，且易粘連傷口，造成換藥時(shí)再次損傷；自體或異體組織覆蓋物具有最佳的皮膚屏障、止血和促進(jìn)上皮化的功能，但其來源有限、費(fèi)用較高、難以滅菌儲(chǔ)存；以高分子材料為原料，經(jīng)加工制成薄膜、泡沫、水凝膠等不同性狀的敷料，組成穩(wěn)定，可大量獲得，但存在生物降解性有限，易在創(chuàng)口表面殘留等問題。

膠原由成纖維細(xì)胞合成，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)成蛋白和重要信號(hào)分子。其中，I型膠原占皮膚膠原總含量的80-85％，是由2種不同的α鏈組成的異源三聚體(Gould LJ.Topical Collagen-Based Biomaterials for Chronic Wounds:Rationale and Clinical Application.Advances in wound care.2016,5(1):19-31)。I型膠原中富含甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸，能較好地吸收滲液，形成凝膠，維持濕潤的創(chuàng)面環(huán)境。通過整合素識(shí)別序列RGD和GFOGER，I型膠原能調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)其粘附、分化和移行(Gautam S,Chou CF,Dinda AK,Potdar,PD,Mishra,NC.Surface modification of nanofibrous polycaprolactone/gelatin composite scaffold by collagen type I grafting for skin tissue engineering.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.2014,34:402-409)。通過與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，可激活MAP kinase通路，促進(jìn)新生血管形成(Whelan MC,Senger DR.Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A.The Journal of biological chemistry.2003,278(1):327-334；Neve A,Cantatore FP,Maruotti N,Corrado A,Ribatti D.Extracellular matrix modulates angiogenesis in physiological and pathological conditions.BioMed research international.2014,2014:756078)，還可與創(chuàng)面微環(huán)境中過多的蛋白酶和炎癥因子相結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)控傷口愈合的炎癥反應(yīng)和血管生成(馮志凱,劉華.傷口愈合機(jī)制的研究進(jìn)展.中華外科雜志.2012.50:368-372)。體外實(shí)驗(yàn)中，I型膠原能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)(Parenteau-Bareil R,Gauvin R,Cliche S,Gariepy C,Germain L,Berthod F.Comparative study of bovine,porcine and avian collagens for the production of a tissue engineered dermis.Acta Biomater.2011,7(10):3757-3765)。

膠原因其親水性、生物相容性、可降解性、止血性、促進(jìn)細(xì)胞生長和趨化等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物材料和臨床治療(陳雪,劉娟,楊高云.膠原貼敷料的臨床應(yīng)用.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志.2010,09:1823-1824,1827)。單純的膠原強(qiáng)度低、易降解，在潮濕環(huán)境易受細(xì)菌侵蝕而變質(zhì)(柯林楠,馮曉明,王春仁.醫(yī)用敷料的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展.中國組織工程研究與臨床.2010,14:521-524)，促進(jìn)受損組織再生能力有限(黃沙,金巖,鄧天政,吳紅,劉濤,劉建明.復(fù)合緩釋微球的膠原膜促創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究.中國修復(fù)重建外科雜志.2006,20:161-164)。通過對(duì)膠原蛋白進(jìn)行改性可改善膠原材料的降解率和機(jī)械性能。殼聚糖具有良好的生物相容性、可降解性，無明顯細(xì)胞毒性(Dreifke MB,Jayasuriya AA,Jayasuriya AC.Current wound healing procedures and potential care.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.2015,48:651-662)，還具有廣譜內(nèi)源性抗菌、減少創(chuàng)面滲出和促進(jìn)創(chuàng)傷組織再生、修復(fù)、愈合的作用(柯林楠,馮曉明,王春仁.醫(yī)用敷料的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展.中國組織工程研究與臨床.2010,14:521-524)，是一種較理想的生物醫(yī)學(xué)材料。通過離子鍵和氫鍵作用將帶正電荷的殼聚糖與帶負(fù)電荷的膠原分子連接，可提高膠原材料的穩(wěn)定性、抑菌性和促愈能力(黃沙,金巖,鄧天政,吳紅,劉濤,劉建明.復(fù)合緩釋微球的膠原膜促創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究.中國修復(fù)重建外科雜志.2006,20:161-164)。

殼聚糖是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，可制備成粉末、溶液、水凝膠、涂層、膜狀、孔材料、敷料、培養(yǎng)支架、納米微球等多種應(yīng)用形式(朱香利.殼聚糖生物醫(yī)用材料的應(yīng)用.中外醫(yī)療.2013,32:12-14；Lee E,Lee J,Lee IH,Yu M,Kim H,Chae SY,Jon S.Conjugated chitosan as a novel platform for oral delivery of paclitaxel.J Med Chem.2008,51(20):6442-6449)。不同分子量的殼聚糖具有不同的藥理作用(張利云,丁仕力,陳璋,楊虎,張夢(mèng)媛,談偉強(qiáng),宣貴達(dá).殼聚糖護(hù)膚液保濕和抗菌作用的研究.材料導(dǎo)報(bào).2013，27(1)：52-6；楊虎,鄭麗君,黃新建,張夢(mèng)媛,談偉強(qiáng).殼聚糖護(hù)膚液促進(jìn)大鼠傷口愈合的研究.中華皮膚科雜志.2011，44(12)：891-3)。通常以分子量大于10萬道爾頓的為高分子量殼聚糖，分子量小于10萬道爾頓的為低分子量殼聚糖。高分子量殼聚糖分子通過形成致密外層膜阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入革蘭氏陽性菌細(xì)胞，具有較好的抗革蘭氏陽性菌作用。低分子量殼聚糖則可進(jìn)入細(xì)胞壁空隙結(jié)構(gòu)，通過干擾細(xì)胞新陳代謝抑制革蘭氏陰性菌生長(鄭連英,朱江峰,孫昆山.殼聚糖的抗菌性能研究.材料科學(xué)與工程.2000,18(02):22-4)。此外，殼聚糖在降解過程中氫鍵作用減弱，晶體結(jié)構(gòu)受到破壞，因而低分子量殼聚糖更易與羥基和氨基等親水基團(tuán)形成氫鍵，具有相對(duì)更佳的保濕性能(俞露,文九巴,陶建中.低聚殼聚糖的性質(zhì)和應(yīng)用研究.河南科技學(xué)院學(xué)報(bào),2009,37(4):43-6)。單一分子量的殼聚糖藥理作用相對(duì)單一，將不同分子量的殼聚糖混合可充分發(fā)揮殼聚糖的諸多性能。

結(jié)合I型膠原和不同分子量殼聚糖的特點(diǎn)，通過冷凍干燥法制備機(jī)械性能穩(wěn)定、保濕透氣性好，抗感染能力強(qiáng)，能快速止血、吸收滲液、促進(jìn)傷口愈合的新型殼聚糖膠原海綿敷料，將取得更優(yōu)的促進(jìn)傷口愈合的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種殼聚糖膠原海綿敷料，通過以下方法制備：將不同分子量殼聚糖混合物溶于醋酸溶液中，制得殼聚糖混合液；將I型膠原溶于醋酸溶液中，制得膠原溶液；再將殼聚糖混合液與膠原溶液按一定重量比例混合；將殼聚糖膠原混合液在-60℃下預(yù)凍，然后轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥，即得到新型殼聚糖膠原海綿敷料。

具體制備步驟如下：

(1)制備殼聚糖混合液：取殼聚糖混合物，溶于1％醋酸溶液，混合均勻，制得質(zhì)量濃度為3％的殼聚糖混合液。所用的殼聚糖混合物一般同時(shí)包含高分子量和低分子量殼聚糖，均勻混合，重量比范圍為2：1～1：2；

殼聚糖混合物由含高分子量和低分子量殼聚糖組成，分子量大于10萬道爾頓的為高分子量殼聚糖，低于10萬道爾頓的為低分子量殼聚糖；

(2)制備膠原溶液：取I型膠原，溶于1％醋酸溶液，制得質(zhì)量濃度為1％的膠原溶液；I型膠原主要以牛的肌腱為原料。

(3)將殼聚糖混合液、膠原溶液按7：3的重量比例混合均勻得到殼聚糖膠原混合液；

(4)制備殼聚糖膠原海綿敷料：將殼聚糖膠原混合液在-60℃下預(yù)凍4-8小時(shí)，然后轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥24小時(shí)，得到殼聚糖膠原海綿敷料；

(5)采用環(huán)氧乙烷消毒處理。

本發(fā)明提供的一種殼聚糖膠原海綿敷料，是一種結(jié)合不同分子量殼聚糖和I型膠原的優(yōu)勢(shì)，制備出具有穩(wěn)定機(jī)械性能、抗菌、保濕、止血和促進(jìn)傷口愈合功能且價(jià)格低廉的新型醫(yī)用敷料。具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)該敷料所需原材料容易獲取，成本較低，易于推廣，制備的產(chǎn)品具有良好的天然生物活性、生物相容性和可降解性；2)該敷料制備方法簡便可行，條件溫和，通過離子鍵和氫鍵作用將殼聚糖與膠原分子連接，避免了引入化學(xué)交聯(lián)劑帶來的毒性殘留問題；3)該敷料保留了I型膠原的性能：親水性、止血性、促進(jìn)細(xì)胞生長和趨化的作用；4)該敷料具有混合殼聚糖的多重性能：廣譜抗菌性、保濕性、機(jī)械穩(wěn)定性和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的作用；5)該敷料含有酸溶液，為創(chuàng)面提供微酸環(huán)境，進(jìn)一步增強(qiáng)其抗感染能力。

附圖說明

圖1為制備的新型殼聚糖膠原海綿敷料成品(含3％的殼聚糖)。

圖2為對(duì)大腸桿菌(左)和對(duì)金黃色葡萄球菌(右)的抗菌作用(Col為膠原海綿敷料組，Exp為殼聚糖膠原海綿敷料組，Chi為殼聚糖海綿敷料組)。

圖3為外用各種敷料后大鼠皮膚濕度增加值。

圖4為促進(jìn)傷口愈合實(shí)驗(yàn)研究中的大鼠創(chuàng)面模型。

圖5為大鼠第3天(上)、7天(中)和14天(下)創(chuàng)面愈合情況(Col為膠原海綿敷料組，Exp為殼聚糖膠原海綿敷料組，Chi為殼聚糖海綿敷料組)。

圖6為第3天(上)、7天(中)和14天(下)時(shí)殼聚糖海綿敷料組(左)、膠原海綿敷料組(中)、殼聚糖膠原海綿敷料組(右)創(chuàng)面組織HE(×400倍)染色圖片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1 新型殼聚糖膠原海綿敷料的制作

將1.5g高分子量殼聚糖(分子量為80萬)、1.5g低分子量殼聚糖(分子量3千)加入97g1％醋酸溶液中，攪拌均勻后制得3％的殼聚糖混合液；將1gI型膠原加入99g1％醋酸溶液中制得1％膠原溶液；將殼聚糖混合液與膠原溶液按7：3的重量比混合；將殼聚糖膠原混合液在-60℃下預(yù)凍8小時(shí)，然后轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥24小時(shí)，得到殼聚糖膠原海綿敷料(圖1)，用環(huán)氧乙烷消毒。

實(shí)施例2 新型殼聚糖膠原海綿敷料的制作

將2g高分子量殼聚糖(分子量為20萬和50萬各半)、1g低分子量殼聚糖(分子量為5萬和10萬各半)加入97g1％醋酸溶液中，攪拌均勻后制得3％的殼聚糖混合液；將1gI型膠原加入99g1％醋酸溶液中制得1％膠原溶液；將殼聚糖混合液與膠原溶液按7：3的重量比混合；將殼聚糖膠原混合液在-60℃下預(yù)凍8小時(shí)，然后轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥24小時(shí)，得到殼聚糖膠原海綿敷料，用環(huán)氧乙烷消毒。

實(shí)施例3 新型殼聚糖膠原海綿敷料的制作

將1g高分子量殼聚糖(分子量為20萬和80萬各半)、2g低分子量殼聚糖(分子量為5千和1萬各半)加入97g1％醋酸溶液中，攪拌均勻后制得3％的殼聚糖混合液；將1gI型膠原加入99g1％醋酸溶液中制得1％膠原溶液；將殼聚糖混合液與膠原溶液按7：3的重量比混合；將殼聚糖膠原混合液在-60℃下預(yù)凍8小時(shí)，然后轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥24小時(shí)，得到殼聚糖膠原海綿敷料，用環(huán)氧乙烷消毒。

實(shí)施例4 新型殼聚糖膠原海綿敷料的制作

將1.5g高分子量殼聚糖(分子量為50萬和80萬各半)、1.5g低分子量殼聚糖(分子量為3千和1萬各半)加入97g1％醋酸溶液中，攪拌均勻后制得3％的殼聚糖混合液；將1gI型膠原加入99g1％醋酸溶液中制得1％膠原溶液；將殼聚糖混合液與膠原溶液按7：3的重量比混合；將殼聚糖膠原混合液在-60℃下預(yù)凍4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥24小時(shí)，得到殼聚糖膠原海綿敷料，用環(huán)氧乙烷消毒。

實(shí)施例5 新型殼聚糖膠原海綿敷料的制作

將2g高分子量殼聚糖(分子量為50萬和80萬各半)、1g低分子量殼聚糖(分子量為3千和1萬各半)加入97g1％醋酸溶液中，攪拌均勻后制得3％的殼聚糖混合液；將1gI型膠原加入99g1％醋酸溶液中制得1％膠原溶液；將殼聚糖混合液與膠原溶液按7：3的重量比混合；將殼聚糖膠原混合液在-60℃下預(yù)凍6小時(shí)，然后轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥24小時(shí)，得到殼聚糖膠原海綿敷料，用環(huán)氧乙烷消毒。

實(shí)施例6 抗菌作用研究

實(shí)驗(yàn)方法：

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(殼聚糖膠原海綿敷料)、殼聚糖對(duì)照組(殼聚糖海綿敷料)、膠原對(duì)照組(膠原海綿敷料)，無菌操作取各組敷料各0.5g，加蒸餾水1ml，配置成0.5g/ml的敷料浸出液。分別用100uL各組敷料浸出液或生理鹽水均勻浸潤6mm濾紙片。分別培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌至對(duì)數(shù)期，各自接種100uL含菌數(shù)濁度為0.5mcf的菌懸液到相應(yīng)的瓊脂平板，涂布均勻，每種菌重復(fù)3塊平皿。用無菌鑷子將制得的含藥濾紙片貼在含菌平皿上，濾紙片之間間隔一定的距離。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，重復(fù)3次取平均值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2左，平板上涂布有大腸桿菌菌落，標(biāo)記Chi為殼聚糖對(duì)照組，Col為膠原對(duì)照組，Exp為實(shí)驗(yàn)組，NaCl為含生理鹽水的濾紙片組):殼聚糖對(duì)照組的抑菌圈直徑最大，平均為0.800±0.233mm；實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈直徑平均為0.425±0.089mm，抑菌作用較強(qiáng)；膠原對(duì)照組和生理鹽水濾紙片組無明顯抑菌圈出現(xiàn)，無抑菌作用。

金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2右，平板上涂布有金黃色葡萄球菌菌落，標(biāo)記Chi為殼聚糖對(duì)照組組，Col為膠原對(duì)照組，Exp為實(shí)驗(yàn)組，NaCl為含生理鹽水的濾紙片組:殼聚糖對(duì)照組的抑菌圈直徑最大，平均為0.912±0.181mm；實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈直徑平均為0.525±0.128mm，抑菌作用較強(qiáng)；膠原對(duì)照組和生理鹽水濾紙片組無明顯抑菌圈出現(xiàn)，無抑菌作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：殼聚糖膠原海綿敷料和殼聚糖海綿敷料對(duì)創(chuàng)面的常見的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有良好的抗菌作用。

實(shí)施例7 大鼠背部皮膚保濕性能檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)方法

將脫毛后大鼠(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，體重200～250g，均為雄性)背部統(tǒng)一用溫和清潔劑洗凈，在恒定環(huán)境中靜置30min，在大鼠左右背部各畫2個(gè)2cm x2cm方格，共4個(gè)。用數(shù)字皮膚水分檢測(cè)儀檢測(cè)受試部位，重復(fù)3次，得出其平均值作為大鼠背部皮膚初始濕度值。將殼聚糖膠原海綿敷料，殼聚糖海綿敷料，膠原海綿敷料依次貼在受試部位，在25min，50min，75min，100min，125min后分別檢測(cè)受試部位的濕度值，均重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。將每次每處檢測(cè)的平均值減去平均初始濕度值即為該時(shí)刻該受試部位的濕度增加值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果參見表1，濕度增加隨時(shí)間變化的曲線參見圖3。

表1

表1和圖3是各種敷料在25min，50min，75min，100min，125min的大鼠背部皮膚濕度增加的比例及皮膚濕度隨時(shí)間變化的曲線。從表1和圖3中可以看出，殼聚糖膠原海綿敷料組和殼聚糖海綿敷料組的皮膚濕度增加值高于膠原海綿敷料組和空白對(duì)照組。

以上實(shí)驗(yàn)表明殼聚糖膠原海綿敷料和殼聚糖海綿敷料具有良好的保濕效果。

實(shí)施例8 CCK-8法檢測(cè)新型殼聚糖膠原海綿敷料對(duì)細(xì)胞的增殖毒性

原理：

Cell counting kit-8簡稱CCK-8試劑，利用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活性的方法通常稱為cck-8法，它是為克服MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性穩(wěn)定性不佳、對(duì)于重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易出現(xiàn)較大差異等不足而近年來新出現(xiàn)的細(xì)胞活性檢測(cè)方法?；赪ST-8，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)。WST-8與MTT類似，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)方法：

1)材料浸提液制備將殼聚糖膠原海綿敷料、殼聚糖海綿敷料和膠原海綿敷料，加入10ml培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱中浸提24h即成材料浸提液。

2)細(xì)胞懸液制備取對(duì)數(shù)生長期的NIH3T3細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液離心稀釋吹打成濃度為10x10⁴/ml的均勻單細(xì)胞懸液。

3)CCK-8步驟將配置好的單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞懸液量為100ul，復(fù)種5孔，孔板周圍加PBS100ul，保持濕度。放入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后，細(xì)胞已完全貼壁，實(shí)驗(yàn)組分別用10％、50％、100％濃度的材料浸提液替換等量(100ul/孔)原培養(yǎng)液，然后置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照孔(不加藥物，100％新鮮培養(yǎng)基交換)。24h后將96孔板取出，每孔加入CCK-8試劑，10ul/孔，于CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各組的吸光光度值，取5個(gè)孔OD值平均值，檢測(cè)波長為450nm。按照下列公式計(jì)算相對(duì)增殖率(Relative growth rate，RGR)：RGR＝實(shí)驗(yàn)組A均值÷陰性對(duì)照組A均值×100％。然后根據(jù)RGR值按《GB/T 16175-1996。醫(yī)用有機(jī)硅材料生物評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法》中細(xì)胞相對(duì)增殖率與細(xì)胞毒性的分級(jí)的關(guān)系評(píng)定材料的細(xì)胞毒性等級(jí)。

評(píng)分相對(duì)增殖率/％

0級(jí)≥100

1級(jí)75～99

2級(jí)50～74

3級(jí)25～49

4級(jí)l～24

5級(jí)0

4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件處理，p<0.05有意義。組間比較采用LSD法的單因素方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表2

每組進(jìn)行單因素方差分析比較，結(jié)果提示陰性對(duì)照、殼聚糖膠原海綿敷料、殼聚糖海綿敷料及膠原海綿敷料對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖的影響無顯著性差異，p>0.05。所以殼聚糖膠原海綿敷料幾乎無細(xì)胞毒性。

實(shí)施例9 新型殼聚糖膠原海綿敷料對(duì)大鼠傷口愈合的促進(jìn)作用

實(shí)驗(yàn)方法：

1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：

清潔級(jí)大鼠32只(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重200～250g，雄性，隨機(jī)分為4組，每組8只，A組大鼠左側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖膠原海綿敷料，右側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖海綿敷料；B組大鼠左側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖海綿敷料，右側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖膠原海綿敷料；C組大鼠左側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖膠原海綿敷料，右側(cè)創(chuàng)面覆膠原海綿敷料；D組大鼠左側(cè)創(chuàng)面覆膠原海綿敷料，右側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖膠原海綿敷料。

2)動(dòng)物創(chuàng)傷模型的建立(圖4)：

大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3-5天后，于腹腔內(nèi)注射2％戊巴比妥鈉30～50ml/1000g，麻醉成功后用剪刀剪去背部區(qū)域的毛，脫毛膏進(jìn)一步除去大鼠背部的毛。用外科方法剪去2塊直徑1.5cm的圓形全層皮膚形成開放創(chuàng)面，深達(dá)筋膜。

3)給藥方法：

創(chuàng)傷模型建立后，即刻用碘伏棉球消毒止血，在A組大鼠背部，左側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖膠原海綿敷料，右側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖海綿敷料；B組大鼠左側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖海綿敷料，右側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖膠原海綿敷料；C組大鼠左側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖膠原海綿敷料，右側(cè)創(chuàng)面覆膠原海綿敷料；D組大鼠左側(cè)創(chuàng)面覆膠原海綿敷料，右側(cè)創(chuàng)面覆殼聚糖膠原海綿敷料。醫(yī)用敷貼包扎固定。大鼠單籠飼養(yǎng)，每3天換藥1次，直至愈合，傷口處痂皮待其自然脫落。

4)評(píng)估創(chuàng)面愈合情況：

(1)肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況。

(2)創(chuàng)面面積計(jì)算：采用透明硫酸膜描記法，每組內(nèi)隨機(jī)選取2只大鼠，共8只。分別于給藥后0,3,7,14d用半透明紙繪得創(chuàng)面圖形，再將圖形描至小方格紙上，測(cè)定小方格的格數(shù)表示創(chuàng)面面積，并記錄最終創(chuàng)面愈合時(shí)間。創(chuàng)面愈合率＝(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)÷原始創(chuàng)面面積x100％。愈合時(shí)間：創(chuàng)面制作后，以創(chuàng)面愈合率≥95％的天數(shù)為創(chuàng)面愈合時(shí)間。記錄造模后至創(chuàng)面愈合所需時(shí)間。創(chuàng)面面積結(jié)果參見表3。

(3)創(chuàng)面組織學(xué)染色：分別于給藥后3、7、14d，每次每組處死2只大鼠，共8只。取創(chuàng)面邊緣至創(chuàng)面中心寬約0.5cm的修復(fù)組織，4％多聚甲醛液固定，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片，片厚5μm，行HE染色后用普通光鏡觀察,行Masson染色并用Image pro plus6.0測(cè)量膠原面密度。

5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件處理，p<0.05有意義。組間比較采用LSD法的單因素方差分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1)肉眼觀察示：

3天時(shí)，殼聚糖膠原海綿敷料組傷口收縮，形成一類圓形凹陷，底部呈暗紅或粉紅色；殼聚糖海綿敷料組傷口收縮不明顯，傷口處形成一類圓形凹陷，底部呈暗紅色，質(zhì)地較硬；膠原海綿敷料組傷口收縮不明顯，傷口處為一圓形凹陷，底部呈暗紅色；殼聚糖膠原海綿敷料組傷口面積明顯小于殼聚糖海綿敷料組(p<0.01)和膠原海綿敷料組(p<0.05)(圖5上)。

7天時(shí)，殼聚糖膠原海綿敷料組傷口收縮，呈圓形或橢圓形，凹陷變淺；殼聚糖海綿敷料組傷口略有收縮，呈類圓形，傷口表面皺縮，部分區(qū)域有痂皮覆蓋；膠原海綿敷料組傷口稍收縮，呈圓形或橢圓形，凹陷變淺；殼聚糖膠原海綿敷料組傷口面積明顯小于殼聚糖海綿敷料組(p<0.01)和膠原海綿敷料組(p<0.05)(圖5中)。

14天時(shí)，殼聚糖膠原海綿敷料組大部分傷口創(chuàng)面愈合率>95％，形成線性瘢痕，部分傷口為粉紅色肉芽組織覆蓋，底部與周圍組織齊平，表面光滑；殼聚糖海綿敷料組傷口收縮明顯，呈不規(guī)則形，凹陷變淺；膠原海綿敷料組傷口進(jìn)一步收縮，呈圓形或不規(guī)則形，凹陷變淺，底部呈粉紅色；殼聚糖膠原海綿敷料組傷口面積明顯小于殼聚糖海綿敷料組(p<0.01)和膠原海綿敷料組(p<0.05)(圖5下)。

2)創(chuàng)面愈合情況參見表3

表3

表3提示各階段殼聚糖膠原海綿敷料組創(chuàng)面面積均顯著小于殼聚糖海綿敷料組(p<0.01)和膠原海綿敷料組(p<0.05)，表明其能明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

3)組織學(xué)觀察結(jié)果：

3天時(shí)，殼聚糖膠原海綿敷料組、殼聚糖海綿敷料組和膠原海綿敷料組創(chuàng)面均以白細(xì)胞浸潤為主，并可見毛細(xì)血管芽及新生毛細(xì)血管形成，其中殼聚糖海綿敷料組炎癥反應(yīng)最為明顯，殼聚糖膠原海綿敷料組和膠原海綿敷料組均可見成纖維細(xì)胞增生(圖6上)。

7天時(shí)，三組炎癥反應(yīng)均有所消退。殼聚糖海綿敷料組仍可見較多炎癥細(xì)胞，成纖維細(xì)胞增生稍混亂；膠原海綿敷料組可見少量新生血管形成，成纖維細(xì)胞增生較前明顯；殼聚糖膠原海綿敷料組仍可見炎癥細(xì)胞，但較稀疏，新生毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多，成纖維細(xì)胞有序增生(圖6中)。

14天時(shí)，殼聚糖海綿敷料組炎癥消退，可見成纖維細(xì)胞增生，其間有較大空隙，部分排列不規(guī)則，未見上皮化過程；殼聚糖膠原海綿敷料組和膠原海綿敷料組可見毛細(xì)血管數(shù)量較前增多，部分區(qū)域可見成熟血管，成纖維細(xì)胞增生規(guī)則有序，呈水平方向排列，邊緣區(qū)域可見正常皮膚的表皮向創(chuàng)面爬行，創(chuàng)面開始上皮化過程(圖6下)。

Masson染色結(jié)果示術(shù)后第3天，殼聚糖海綿敷料組成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，膠原纖維面密度為31733.5±15108.14；膠原海綿敷料組可見成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維面密度為41833.5±14970.52；殼聚糖膠原海綿敷料組成纖維細(xì)胞增生較明顯，膠原纖維密度為64757.38±18133.84，顯著高于殼聚糖海綿敷料組(p<0.01)和膠原海綿敷料組(p<0.05)。

術(shù)后第7天，殼聚糖海綿敷料組成纖維細(xì)胞數(shù)量較前增多，膠原纖維多粗大，排列不規(guī)則，面密度為47230.75±13515.17；膠原海綿敷料組成纖維細(xì)胞數(shù)量較前增多，膠原纖維較正常組織細(xì)長淡染，面密度為48758.00±13658.82；殼聚糖膠原海綿敷料成纖維細(xì)胞增生明顯，膠原纖維形態(tài)著色稍接近正常組織，面密度為128114.62±25081.54，顯著高于殼聚糖海綿敷料組(p<0.01)和膠原海綿敷料組(p<0.01)。

術(shù)后第14天，殼聚糖海綿敷料組成纖維細(xì)胞增生明顯，膠原纖維排列疏松，但較前整齊，多細(xì)長淡染，面密度為86216.20±25798.86；膠原海綿敷料組成纖維細(xì)胞較前減少，膠原纖維排列整齊，面密度為130332.00±15419.70；殼聚糖膠原海綿敷料成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原纖維數(shù)量、著色、形態(tài)接近正常組織，面密度為177778.33±27328.06，顯著高于殼聚糖海綿敷料組(p<0.01)和膠原海綿敷料組(p<0.01)。

綜上，相比于單一殼聚糖海綿敷料和單一膠原海綿敷料，新型殼聚糖膠原海綿敷料具有更好的促進(jìn)血管形成和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。