技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種自愈合多孔組織工程支架材料，特別提供了一種通過(guò)高速剪切混合法制備基于醛基-氨基交聯(lián)的多孔支架材料。

背景技術(shù)：

1993年美國(guó)科學(xué)家Joseph P. Vacanti和Robert Langer教授首次提出了組織工程概念，即“應(yīng)用組織工程學(xué)和生命科學(xué)原理生長(zhǎng)出活的替代物，用以修復(fù)、維持和改善人體組織和器官的功能”。支架材料作為組織工程構(gòu)成的三要素之一，其研究對(duì)組織工程領(lǐng)域的研究有著巨大的意義。

生物支架材料作為為細(xì)胞提供生存的三維空間，必須要滿足以下幾個(gè)條件：1.有利于細(xì)胞粘附、增殖、分化及生長(zhǎng)，并能為細(xì)胞提供結(jié)合位點(diǎn)，誘發(fā)生物反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)；2.作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和生物活性物質(zhì)的載體，能儲(chǔ)藏、運(yùn)輸這些物質(zhì)，排泄代謝廢物，并在組織生長(zhǎng)形成過(guò)程中不斷降解、被機(jī)體吸收利用或通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)排出體外；3.具有一定的力學(xué)性能，一定的形貌、結(jié)構(gòu)和尺寸，引導(dǎo)組織按預(yù)定形態(tài)生長(zhǎng)。以上條件就對(duì)支架材料有了多孔的形貌界定，制備多孔支架的方法多種多樣。目前為止，制備方法主要有纖維粘結(jié)法、粒子致孔法、相分離/冷凍干燥法、發(fā)泡法（物理發(fā)泡/化學(xué)發(fā)泡）、燒結(jié)微球法、熔融成型法、快速成型法等。但是以上方法制備工藝相對(duì)比較復(fù)雜，并且加入致孔劑或者使用有機(jī)溶劑等有毒害的物質(zhì)，對(duì)生物相容性造成了一定的影響。

海藻酸鈉是由α-L-甘露糖醛酸(M單元）與β-D-古洛糖醛酸(G單元）依靠β-1,4-糖苷鍵連接而成的天然線性多糖，其每個(gè)糖醛酸單元上含有一個(gè)羧基，因此在中性或堿性條件下呈現(xiàn)聚陰離子電解質(zhì)的性質(zhì)，并且海藻酸鈉是無(wú)毒食品，早在1938年就被收入美國(guó)藥典。海藻酸鈉可形成凝膠微球，將藥物或者活性物質(zhì)包裹其中，實(shí)現(xiàn)藥物緩控釋；具有血液相容性及可體內(nèi)降解清除的特點(diǎn)，是靶向給藥的良好載體；具有一定的力學(xué)性能，能夠保持一定的形貌、尺寸及結(jié)構(gòu)，作為組織工程支架材料的研究也頗為熱門；在醫(yī)學(xué)成像及檢測(cè)上也逐漸出現(xiàn)海藻酸鈉的應(yīng)用。明膠是膠原部分水解而得到的衍生物，其化學(xué)組成與膠原相似，與膠原具有同源性，保持了膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)，含有類似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，具有優(yōu)良的親水性和生物相容性。明膠基復(fù)合材料用作組織工程支架材料和信號(hào)分子載體是目前生物材料的研究熱點(diǎn)之一。明膠經(jīng)交聯(lián)后形成多孔網(wǎng)絡(luò)支架結(jié)構(gòu)，但是單組份明膠結(jié)構(gòu)脆弱、力學(xué)性能較差，無(wú)法滿足生物組織工程的應(yīng)用，需與其他生物高分子聯(lián)合使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種自愈合多孔組織工程支架材料的制備方法，該方法無(wú)需模板，通過(guò)高速剪切混合技術(shù)，獲得多孔支架，用于組織工程再生修復(fù)。本發(fā)明制備的多孔支架材料具有良好生物相容性及優(yōu)良機(jī)械性能，制備工藝簡(jiǎn)單，制備過(guò)程綠色無(wú)污染，成本低。本發(fā)明制備的多孔支架材料具有自愈合性能，可實(shí)現(xiàn)對(duì)組織的修復(fù)治療。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：

一種自愈合多孔組織工程支架材料的制備工藝，所述組織工程支架材料以選取明膠和海藻酸鈉為原料，但不僅限于此，其他帶氨基和羧基或可被氨基化和羧基化和可醛基化的生物高分子材料均可，如蛋白質(zhì)、多肽、殼聚糖、透明質(zhì)酸等。所述制備工藝包括以下步驟：1）對(duì)海藻酸鈉進(jìn)行醛基化改性處理，所述醛基化改性試劑為高碘酸鈉；2）將一定濃度的明膠溶液與醛基化海藻酸鈉溶液以一定比例混合，加入一定量的己二酸二酰肼，進(jìn)行高速剪切混合；3）一定時(shí)間之后，置于一定溫度氛圍中固化交聯(lián)，得到自愈合組織工程多孔支架材料。

對(duì)制備得到的多孔支架材料生物性能表征，表明生物相容性好，具有細(xì)胞粘附性，細(xì)胞可在支架材料上粘附增殖。

本發(fā)明取得的有益效果是：本發(fā)明制備得到的多孔支架材料具有自愈合性能，生物相容性好，大孔性，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)治療。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單方便的多孔支架制備技術(shù)，制備過(guò)程無(wú)毒、無(wú)污染、綠色環(huán)保。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖及實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明：

圖1為海藻酸鈉醛基化改性反應(yīng)示意圖

圖2為明膠和醛基化海藻酸鈉熱交聯(lián)反應(yīng)示意圖

圖3為本發(fā)明專利中組織工程支架材料表面及斷面掃面電鏡圖

圖4為本發(fā)明專利中組織工程支架材料自愈合功能的示意圖

圖5為本發(fā)明專利中組織工程支架材料可注射的示意圖

圖6為細(xì)胞在該多孔支架材料中的生長(zhǎng)熒光顯微鏡圖片

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本大明不僅限于此。

實(shí)施例1：醛基化海藻酸鈉的制備

首先，取海藻酸鈉粉末5g溶于25mL乙醇溶液中，取高碘酸鈉4.32g溶于25mL去離子水中；其次，將溶解完全的高碘酸鈉溶液加入到海藻酸鈉溶液中，避光攪拌，室溫下反應(yīng)6h；第三，加入與高碘酸鈉等摩爾量的乙二醇1.137mL終止反應(yīng)，攪拌30min；第四，在劇烈攪拌的條件下，將該反應(yīng)溶液加入到200mL無(wú)水乙醇中，反應(yīng)物沉淀析出，抽濾；用一定量的去離子水溶解，再用無(wú)水乙醇沉淀；如此反復(fù)洗滌三次，得到白色醛基化高碘酸鈉產(chǎn)物；第五，將產(chǎn)物倒入培養(yǎng)皿中，于50℃真空干燥箱中干燥24h，得到干態(tài)醛基化海藻酸鈉，避光保存。

實(shí)施例2：醛基化海藻酸鈉的制備

首先，取海藻酸鈉粉末5g溶于25mL乙醇溶液中，取高碘酸鈉4.32g溶于25mL去離子水中；其次，將溶解完全的高碘酸鈉溶液加入到海藻酸鈉溶液中，避光攪拌，室溫下反應(yīng)6h；第三，加入與高碘酸鈉等摩爾量的乙二醇1.137mL終止反應(yīng)，攪拌30min；第四，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行透析，所用透析袋的截留分子量為3.5KDa，透析5-7天，透析溶劑為水，以除去多余未反應(yīng)的高碘酸鈉等小分子，凍干，避光保存。

實(shí)施例3：多孔支架的制備

取制備得到的醛基化海藻酸鈉溶于PBS中，配成10w/v%的溶液（Ⅰ），取明膠溶于PBS中，配成20w/v%的溶液（Ⅱ），取己二酸二酰肼溶于PBS中，配成50 w/v %的溶液（Ⅲ）；取100uLⅠ溶液、200uLⅡ溶液、26uLⅢ溶液置于EP管中，置于高速剪切混合探頭下，以30000rpm的速率高速剪切混合30s，再置于37℃水浴鍋中固化交聯(lián)3min，取出，得到多孔支架材料。

實(shí)施例4：多孔支架的制備

取實(shí)施例3中配置的Ⅰ溶液50uL，Ⅱ溶液200uL，Ⅲ溶液21.74uL置于EP管中，于高速剪切混合探頭下，以30000rpm的速率高速剪切混合30s，再置于37℃水浴鍋中固化交聯(lián)3min，取出，得到多孔支架材料。

實(shí)施例5：多孔支架的制備

取實(shí)施例3中配置的Ⅰ溶液100uL，Ⅱ溶液200uL，Ⅲ溶液26uL置于EP管中，于高速剪切混合探頭下，以8000rpm的速率高速剪切混合3min，再置于37℃水浴鍋中固化交聯(lián)3min，取出，得到多孔支架材料。

實(shí)施例6

通過(guò)實(shí)施例3、4、5中的多孔支架材料的制備方法，制備不同配比的多孔支架材料，將其鋪于96孔板中，用含雙抗的PBS溶液浸泡滅菌處理，用完全培養(yǎng)基（90%F12:DMED=1:1,10%FBS,1%anti-anti）進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)24h，以除去雜質(zhì)，將小鼠成纖細(xì)胞（l929）種植于該支架材料上，體外靜態(tài)培養(yǎng)7天后電鏡觀察及CCK-8測(cè)試分析細(xì)胞粘附增殖情況，見(jiàn)細(xì)胞能在支架上良好生長(zhǎng)，且細(xì)胞存活率高達(dá)70%以上。

實(shí)施例7

取第一步所得醛基化海藻酸鈉溶于PBS中，配成10w/v%溶液，取明膠溶于PBS中，配成20w/v%溶液，取ADH溶于PBS中，配成50w/v%溶液，將三溶液分別置于100℃沸水中煮5min。無(wú)菌條件下，將三者以一定配比高速剪切混合。取100uL混合物，將其與l929細(xì)胞混合，細(xì)胞濃度為10000個(gè)/孔，渦旋震蕩2min；添加到96孔板中。培養(yǎng)24h，通過(guò)死活檢測(cè)裝置檢測(cè)細(xì)胞在材料上的生長(zhǎng)情況，如圖所示，細(xì)胞在該多孔組織工程支架材料上生長(zhǎng)良好。

具體實(shí)施方式只用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，同時(shí)該領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，都位于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。