本發(fā)明涉及遠(yuǎn)志皂苷B在電離輻射防護(hù)中的應(yīng)用,屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

輻射防護(hù)劑的研究開始于20世紀(jì)60年代，輻射防護(hù)劑主要通過(guò)參與輻射與機(jī)體發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)發(fā)揮輻射保護(hù)作用，如輻射初期射線造成的機(jī)體內(nèi)自由基的增加、DNA、蛋白質(zhì)、磷脂等生物大分子的破壞等，輻射防護(hù)劑通過(guò)參與上述化學(xué)反應(yīng)來(lái)減輕輻射對(duì)目標(biāo)分子的損傷。因此這類輻射防護(hù)劑通常預(yù)防給藥或者在輻射發(fā)生后立即使用，才能發(fā)揮較好的輻射防護(hù)作用。現(xiàn)有輻射防護(hù)劑的研究存在毒副作用過(guò)大，治療效果有限，價(jià)格昂貴等限制，不能滿足輻射越來(lái)越普遍的情況下人們對(duì)輻射防護(hù)劑的要求，如何研發(fā)出高效低毒的輻射防護(hù)劑成為人們迫切需要解決的問(wèn)題。中藥具有來(lái)源廣、毒副作用小、價(jià)格低、易于獲得等特點(diǎn)，人們開始關(guān)注中藥有效成分的抗輻射研究，中藥抗輻射的研究主要集中在對(duì)輻射具有較強(qiáng)敏感性的造血系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的保護(hù)作用，圍繞著如何減輕輻射造成的DNA損傷、清除自由基、發(fā)揮抗氧化作用、抑制細(xì)胞內(nèi)凋亡通路的激活、減輕細(xì)胞的凋亡和壞死等方面進(jìn)行，取得了初步的研究結(jié)果。中藥有效成分如多糖類、黃酮類、多酚類、生物堿類、皂苷類等具有較好的輻射防護(hù)作用。

植物遠(yuǎn)志(Polygala)為遠(yuǎn)志科多年生草本植物，以干燥根入藥，為我國(guó)常用的中草藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，全草能益智強(qiáng)志，故稱遠(yuǎn)志。國(guó)內(nèi)外研究表明，遠(yuǎn)志富含皂苷類、寡糖酯類等化合物，遠(yuǎn)志皂苷是著名的益智中藥遠(yuǎn)志的有效成分,具有抗氧化、抗衰老、抗癡呆等藥理作用。據(jù)報(bào)道，遠(yuǎn)志皂苷可提高由過(guò)氧化氫（H₂O₂）所致大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)存活率，減輕細(xì)胞膜的損傷，其機(jī)制可能是遠(yuǎn)志皂苷有效成分進(jìn)入細(xì)胞后提高了SOD活性，進(jìn)而阻止H₂O₂介導(dǎo)的氧化損傷，降低了脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA的損傷，以發(fā)揮抗氧化作用[中藥材，2007，30（8）：991-993]。遠(yuǎn)志皂苷能明顯地減輕 Aβ_1-40誘發(fā)的神經(jīng)元毒性，對(duì)線粒體的超微結(jié)構(gòu)與功能有較好的保護(hù)作用，可能與其通過(guò)保護(hù)線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈復(fù)合物與 ATP 合酶的結(jié)構(gòu)，維持腦細(xì)胞線粒體膜電位的穩(wěn)定，降低內(nèi)膜上的細(xì)胞色素 C 的泄漏，保持線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度，提高抗氧化酶活性與減少自由基的產(chǎn)生，從而達(dá)到保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制有關(guān)。[中藥藥理與臨床 2015,31(1):93-96]。電離輻射通過(guò)直接或間接的作用于機(jī)體引發(fā)機(jī)體非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、機(jī)體功能發(fā)生異常、組織器官發(fā)生器質(zhì)性改變甚至死亡。射線直接或間接作用于細(xì)胞，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性發(fā)生改變以及產(chǎn)生大量的ROS，從而激細(xì)胞內(nèi)多種凋亡信號(hào)分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。遠(yuǎn)志皂苷有抗氧化作用，防止過(guò)多的氧自由基對(duì)機(jī)體的損害。本發(fā)明提供了遠(yuǎn)志皂苷 B的電離輻射防護(hù)新用途，現(xiàn)有技術(shù)未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供遠(yuǎn)志皂苷B預(yù)防及治療電離輻射損傷的新用途。

本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞、動(dòng)物水平對(duì)遠(yuǎn)志皂苷B的抗電離輻射活性進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明遠(yuǎn)志皂苷B可以抑制X射線照射導(dǎo)致的胸腺細(xì)胞活力喪失，并能提高X射線6 Gy一次全身照射昆明種小鼠的活存率，從而完成了本發(fā)明。

遠(yuǎn)志皂苷B可與藥學(xué)上可接受的載體按本領(lǐng)域已知方法制備成各種藥物組合物，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑等各種固體、液體制劑等；或和其他中藥有效成分組合制成各種不同的劑型，通過(guò)不同的給藥途徑用于預(yù)防及治療電離輻射損傷。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1.發(fā)現(xiàn)了遠(yuǎn)志皂苷B新的醫(yī)療用途。

2.遠(yuǎn)志皂苷B來(lái)源廣，毒副作用小、價(jià)格低、易于獲得，藥用前景廣闊。

3.本發(fā)明將成為高效低毒抗電離輻射藥物的有益補(bǔ)充。

附圖說(shuō)明

圖1 遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)胸腺細(xì)胞的細(xì)胞毒性

圖2不同濃度的遠(yuǎn)志皂苷 對(duì)X射線6 Gy照射的胸腺細(xì)胞活力喪失的保護(hù)作用

圖3 遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)X射線6 Gy照射的胸腺細(xì)胞DNA的保護(hù)作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明：

[實(shí)施例一] 遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)胸腺細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測(cè)

小鼠胸腺細(xì)胞的制備：小鼠摘眼球后，脫頸椎處死，75%酒精浸泡3 min，超凈臺(tái)內(nèi)小心摘取小鼠胸腺，用消毒過(guò)的PBS清洗血跡；在200目細(xì)胞篩上用注射器芯輕輕研磨，用RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、10萬(wàn)單位青霉素鈉、10萬(wàn)單位硫酸鏈霉素）沖洗制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×10⁶/mL。

藥物準(zhǔn)備：將用RPMI 1640培養(yǎng)液溶解，超聲助溶，配置儲(chǔ)存濃度100 μg/mL母液備用。

毒性檢測(cè)：取胸腺細(xì)胞懸液，細(xì)胞(1×10⁶個(gè)/mL)接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，每孔藥物100 μL，使終濃度為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL (簡(jiǎn)稱藥物組)，每濃度5孔，另設(shè)空白對(duì)照組細(xì)胞懸液。于藥物作用48 h后，加入MTT溶液，于多功能酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光值。細(xì)胞存活率%= 實(shí)驗(yàn)組/正常組×100% ，數(shù)據(jù)用spss 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與正常組相比：#，P<0.05。表明，遠(yuǎn)志皂苷B在1.25-40 μg/mL無(wú)明顯細(xì)胞毒性。（見附圖1）

[實(shí)施例二] 遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)X 射線導(dǎo)致的胸腺細(xì)胞活力喪失的保護(hù)作用

取胸腺細(xì)胞(1×10⁵個(gè)/mL)接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，每孔藥物100μL，使終濃度為40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL，每濃度5孔，另設(shè)空白對(duì)照組細(xì)胞懸液、輻照組細(xì)胞懸液。于藥物作用2 h后6 Gy輻照，照后8 h于每孔中加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于多功能酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光值。與輻照組相比：#，P<0.05。結(jié)果表明，遠(yuǎn)志皂苷B在1.25-20 μg/mL對(duì)X射線6 Gy照射的胸腺細(xì)胞活力喪失呈劑量依賴的保護(hù)作用，對(duì)胸腺細(xì)胞電離輻射防護(hù)的最優(yōu)濃度為20 μg/mL。（見附圖2）

[實(shí)施例三] 遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)X 射線6 Gy一次全身照射昆明種小鼠存活率的影響

將雄性昆明種種小鼠適應(yīng)環(huán)境后根據(jù)需要分為正常組、照射組、陽(yáng)性藥組和藥物組，每組10只。正常組和照射組灌胃給予蒸餾水，用藥組照前灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)3天，陽(yáng)性藥組照前24 h灌胃給予“E523”一次，劑量5 mg/kg，給藥后全身一次性照射，劑量為6 Gy，照后連續(xù)觀察30天。結(jié)果表明，遠(yuǎn)志皂苷B 20 mg/kg給予小鼠，30天存活率可達(dá)到90%，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)再次表明刺梨黃酮的較強(qiáng)的電離輻射防護(hù)作用。（見表1）

[實(shí)施例四]彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)DNA雙鏈斷裂的影響

按上述細(xì)胞分組和照射方式，輻射后2 h收集細(xì)胞，離心后去上清，用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度1×10⁶/mL。

鋪膠取干凈的載玻片使用具有磨砂的一面，第1層膠，0.8%的正常瓊脂糖凝膠50 μL，4 ℃凝固；第2層膠，0.4%低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMRA）50 μL與10 μL細(xì)胞懸液混勻后鋪第二層膠，4 ℃凝固；第3層膠，0.4%的低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMPA）50 μL，4 ℃凝固20 min。

裂解將凝膠玻片進(jìn)入新鮮配制的細(xì)胞裂解液中，4 ℃裂解1.5 h。

堿化電泳放置20 min使DNA解鏈。恒壓19 V，300 mA電泳20 min。

中和取出玻片，Tris緩沖液沖洗3 min×3次

染色PI（20 μg/mL）滴于載玻片上，染色15 min，洗去染液。

熒光顯微鏡下采集圖像，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖3A所示，輻射后的胸腺細(xì)胞出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，給予遠(yuǎn)志皂苷B保護(hù)組細(xì)胞其彗星尾的長(zhǎng)度比單純輻射組明顯縮短，顯示對(duì)遠(yuǎn)志皂苷B輻射損傷小鼠胸腺細(xì)胞的DNA具有較好的保護(hù)作用。

[實(shí)施例五] DNA ladder實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用

細(xì)胞凋亡會(huì)引起DNA鏈的斷裂，凋亡晚期DNA在核小體間斷裂形成一些DNA片段，不同的DNA片段在凝膠電泳上移動(dòng)的速度不同，會(huì)產(chǎn)生類似于階梯狀的條帶，稱之為DNA ladder。按上述細(xì)胞分組和照射方式，輻射后3h收集細(xì)胞，參照試劑盒方法提取DNA進(jìn)行凋亡檢測(cè)：a. 離心收集5×10⁵個(gè)細(xì)胞（2000 r，4 ℃，7 min）PBS洗兩遍；b. 沉淀的細(xì)胞中每管加入20 μL Lysis Buffer，輕輕混勻細(xì)胞沉淀；c. 每管加入10 μL Enzyme A溶液，輕輕混勻，30℃孵育30-120 min；d. 制備1.5%瓊脂糖凝膠30 mL (含EB染料0.5 μg/mL)，在上述孵育步驟結(jié)束后，每管加入5 μL loading buffer 混勻，干膠上樣；e. 75 v電泳至1/2處；f. 紫外燈拍照觀察。DNA ladder顯示結(jié)果如附圖3B所示，與正常組相比，6 Gy輻射組細(xì)胞的DNA斷裂明顯，呈特征性DNA凋亡條帶，階梯條帶輝度較高。給予遠(yuǎn)志皂苷B保護(hù)組與單純輻射組相比，階梯條帶模糊，灰度減弱，能夠減輕輻射損傷細(xì)胞的晚期凋亡。