本發(fā)明涉及一種口服疫苗運送載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

病毒感染引起的疾病是作為病原體的病毒感染宿主生物而引起的疾病。病毒感染部位及種類可引發(fā)多種癥狀，因腸道內(nèi)的感染引發(fā)的最常見的癥狀是腹瀉、腹膜炎等。

具有代表性的例子有如豬流行性腹瀉(PED; porcine epidemic diarrhea)最初在比利時和英國有報道過，之后又在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家（歐洲、包括日本、中國、韓國等的亞洲）出現(xiàn)，使國家遭受較大的經(jīng)濟損失。引起豬流行性腹瀉的PEDV(豬流行性腹瀉病毒)主要在小腸絨毛細胞上進行增殖，使絨毛上皮細胞發(fā)生變性或壞死，并伴有絨毛的萎縮及脫落，從而導致吸收障礙，最終引發(fā)持續(xù)性水瀉（watery diarrhea）。無論豬的年齡是多少，均會引發(fā)腸炎并伴有嚴重的腹瀉和脫水現(xiàn)象，甚至豬仔的致死率達到80%-90%。

在國內(nèi)，豬流行性腹瀉是從1992年P(guān)ED病毒被分離出來之后持續(xù)肆虐了2年，由于在臨床上無法與TGEV(豬傳染性胃腸炎病毒) 進行辨別而導致巨大的經(jīng)濟損失。最近，比起PED的單獨發(fā)生，往往與TGE一起混合感染的情況增加，且不分季節(jié)或主要在冬季頻發(fā)。發(fā)病率和致死率均高的豬流行性腹瀉的預防最為重要，如今可商購的用于在腸內(nèi)中和戶外病毒的口服PEDV疫苗。

然而，口服病毒疫苗在給藥時不會伴有痛苦與壓力，因此具有容易接種、便于供應及流通等優(yōu)點。然而，作為口服病毒疫苗，需要將它穩(wěn)定地運送到腸內(nèi)，但在胃中由于胃酸所致的低PH環(huán)境下，它會變得不穩(wěn)定，從而阻礙疫苗的效果。

因此，人們需要研發(fā)一種新技術(shù)，使口服病毒疫苗在低PH環(huán)境下不經(jīng)破壞有效地運送到腸道內(nèi)。

【現(xiàn)有技術(shù)文獻】

【專利文獻】

(專利文獻1)韓國專利申請?zhí)?998-0011874。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明在于提供一種口服病毒疫苗運送載體及其制備方法，該運送載體可以在低pH環(huán)境下使病毒疫苗不經(jīng)破壞并穩(wěn)定地運送到腸道內(nèi)。

技術(shù)方案

本發(fā)明提供一種口服病毒疫苗運送載體，該運送載體包含：口服病毒疫苗粒子；所述病毒疫苗粒子上形成的陽離子型高分子層；及所述陽離子型高分子層上形成的pH敏感性高分子層。

此外，本發(fā)明提供一種口服病毒疫苗運送載體，該運送載體包含：口服病毒疫苗粒子；所述病毒疫苗粒子上形成的pH敏感性高分子層；及所述pH敏感性高分子層上形成的陽離子型高分子層。

此外，本發(fā)明提供口服病毒疫苗運送載體的制備方法，該方法包括：通過混合口服病毒疫苗粒子與陽離子型高分子來在口服病毒疫苗粒子上形成陽離子型高分子層的步驟；和通過使形成有所述陽離子型高分子層的口服病毒疫苗粒子與pH敏感性高分子進行混合來在所述陽離子型高分子層上形成pH敏感性高分子層的步驟。

此外，本發(fā)明提供口服病毒疫苗運送載體的制備方法，該方法包括：通過混合口服病毒疫苗粒子與pH敏感性高分子來在口服病毒疫苗粒子上形成pH敏感性高分子層的步驟；和通過使形成有所述pH敏感性高分子層的口服病毒疫苗粒子與陽離子型高分子進行混合來在所述pH敏感性高分子層上形成陽離子型高分子層的步驟。

此外，本發(fā)明提供用于預防病毒感染的方法，該方法包括：口服給藥所述病毒疫苗運送載體。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明，將口服病毒疫苗在所述低pH環(huán)境下不經(jīng)破壞并有效地傳送至腸道內(nèi)。

附圖說明

圖1展示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的口服病毒疫苗運送載體的結(jié)構(gòu)的模擬圖。

圖2展示了確認根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的口服病毒疫苗運送載體的pH變化的結(jié)果。

圖3展示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的口服病毒疫苗運送載體的pH變化的穩(wěn)定性變化的結(jié)果。

具體實施方式

對用于預防腸內(nèi)增殖病毒的感染的口服病毒疫苗而言，為了將病毒疫苗運送到腸道，首先要通過胃。與腸道不同，胃具有1-3之間的低pH值，因此有必要保持在低pH條件下的病毒疫苗的穩(wěn)定性。然而，那些可商購的口服病毒疫苗在低pH下并不穩(wěn)定，從而難以使疫苗有效地運送到腸內(nèi)，進而疫苗的病毒預防效果不夠有效。

因此，本發(fā)明人為了解決口服病毒疫苗的運送問題，經(jīng)過反復研究驗證了以下內(nèi)容并完成了本發(fā)明，通過利用陽離子型高分子及pH敏感性高分子，使口服病毒疫苗粒子在低pH條件下不受破壞并穩(wěn)定地運送到腸內(nèi)。

因此，本發(fā)明提供包含形成有陽離子型高分子層和pH敏感性高分子層的口服病毒疫苗粒子的口服病毒疫苗運送載體。圖1展示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的口服病毒疫苗運送載體的結(jié)構(gòu)模擬圖。在本發(fā)明中，可以將陽離子型高分子層和pH敏感性高分子層不分順序形成在口服病毒疫苗粒子上。

在本發(fā)明中，“…上形成”，不僅有將這些組成要素通過直接接觸進行疊層之意，還有在這些組成要素之間包含其他要素而形成之意。例如，“…上形成”，不僅包括在第一組成要素的表面上直接接觸第二組成要素之意，還包括在第一組成要素與第二組成要素之間可進一步形成第三組成要素之意。

在一個實施例中，本發(fā)明提供一種口服病毒疫苗運送載體，該運送載體包含：口服病毒疫苗粒子；所述病毒疫苗粒子上形成的陽離子型高分子層；及所述陽離子型高分子層上形成的pH敏感性高分子層。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種口服病毒疫苗運送載體，該運送載體包含：口服病毒疫苗粒子；所述病毒疫苗粒子上形成的pH敏感性高分子層；及所述pH敏感性高分子層上形成的陽離子型高分子層。

所述疫苗粒子是指在被病原體感染之前人為注射到人體內(nèi)并起激活免疫系統(tǒng)的活性成分，例如，可以為衰減性或未被激活的病原體、蛋白質(zhì)或片段，但不限于此。所述疫苗粒子可根據(jù)種類優(yōu)選固體形態(tài)，此外還包括水溶液形態(tài)。

在一個具體實施例中，口服病毒疫苗粒子的平均粒徑可以為0.1-10um，但不限于此。然而，所述口服病毒疫苗粒子的形狀可不限于完整的球形，還可包括類似于球形的形狀、部分直徑更長的長形橢圓形狀或類似于四邊形的形狀。

所述疫苗粒子的表面可帶有包括中性電荷、負電荷和正電荷的電荷。無論粒子所帶的電荷為何種，在所述粒子上形成的高分子層可通過改變疊層順序來包含在疫苗運送載體內(nèi)。此外，在一個優(yōu)選實施例中，當所述疫苗粒子帶負電荷時，本發(fā)明的疫苗運送載體可包含在所述粒子上形成的陽離子型高分子層及在該陽離子型高分子層上形成的pH敏感性高分子層。此外，當所述疫苗粒子帶正電荷時，本發(fā)明的疫苗運送載體可包含在所述粒子上形成的pH敏感性高分子層和在該pH敏感性高分子層上形成的陽離子型高分子層。此外，當所述疫苗粒子不帶任何電荷或中性電荷時，疫苗運送載體可包含在該粒子上不分順序形成的pH高分子層和陽離子型高分子層。該實施例僅用來展示更容易形成高分子層的一個實施例，本發(fā)明并不僅限于此。

本發(fā)明的口服病毒疫苗粒子的使用可不受限制，只要是針對用于引起腸內(nèi)感染的病毒的疫苗即可。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的口服病毒疫苗可以為針對阿爾法冠狀病毒、輪狀病毒（Rotavirus）、札如病毒(Sapovirus)、貓腸道冠狀病毒（Feline entric corona virus）、細小病毒（Parvovirus）和杯狀病毒（Calicivirus）屬（genus）中的任一種病毒的疫苗。更具體地，例如有用于預防選自流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎（TGE）病毒、輪狀病毒、腸道杯狀病毒、泛白細胞減少癥（panleukopenia）病毒、傳染性腹膜炎病毒、細小病毒和諾如病毒（Norovirus）中的病毒感染的病毒疫苗。

所述疫苗的受體可以為包含人在內(nèi)的哺乳動物，具體例子包括豬、貓、狗和人。

更具體地，所述疫苗可以為用于預防選自豬流行性腹瀉（PED）病毒、豬傳染性胃腸炎（TGE）病毒、輪狀病毒、豬腸道杯狀病毒、貓泛白細胞減少癥病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、犬細小病毒和諾如病毒中的病毒感染所致的疾病的病毒疫苗。

在一個實施例中，本發(fā)明的口服豬流行性腹瀉病毒疫苗的使用不受限制，只要是用于預防和治療豬流行性腹瀉病毒的口服疫苗即可。例如，口服豬流行性腹瀉病毒疫苗可從綠十字獸醫(yī)藥品中購得?？缮藤彽目诜i流行性腹瀉病毒疫苗在pH7-8的范圍內(nèi)最為穩(wěn)定，而在低于pH5或高于pH11的環(huán)境下病毒將迅速死亡而受到破壞。最終，難以有效地運送到腸道。然而，當在所述口服豬流行性腹瀉病毒疫苗粒子上涂有pH高分子層和陽離子型高分子層時，即使在低于pH5或pH1-3的低pH范圍內(nèi)，也不會使病毒粒子死亡或受到破壞(參見實施例)。

由于口服豬流行性腹瀉病毒疫苗帶有弱的負電荷，在所述病毒疫苗粒子上可以更好地形成由陽離子型高分子組成的涂層。通過形成陽離子型高分子層，幫助在低pH環(huán)境下保持病毒疫苗粒子的穩(wěn)定性。此外，陽離子型高分子層會被腸內(nèi)的如胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶等進行分解，從而將病毒疫苗有效地運送到腸內(nèi)。

在一個具體實施例中，陽離子型高分子可優(yōu)選為陽離子型聚氨基酸。所述陽離子型高分子包括聚賴氨酸、聚組氨酸和聚精氨酸，但不限于此。所述陽離子型高分子層可包括一種或以上的陽離子型高分子或可由一種或以上的陽離子型高分子組成。

在一個具體實施例中，陽離子型高分子可由以下化學式1表示。

【化學式1】

(聚合-M)k

在上述化學式中，M表示賴氨酸、組氨酸或精氨酸，k表示2-50。

在一個具體實施例中，陽離子型高分子層的厚度可以為1nm-1um、5nm-500nm、10nm-300nm、10nm-200nm、10nm-100nm、10nm-90nm、10nm-70nm、10nm-50nm、10nm-30nm或10nm-20nm。在上述范圍內(nèi)，能使病毒疫苗粒子的穩(wěn)定性在pH1-3的范圍內(nèi)得到有效維持，既不引起免疫反應，也將病毒疫苗以未受破壞的狀態(tài)有效地運送至作為目的地的腸道內(nèi)。此外，在陽離子型高分子層上形成pH敏感性高分子層時，如陽離子型高分子層的厚度在上述范圍內(nèi)時，能夠良好地形成pH敏感性高分子層。

在本發(fā)明中，pH敏感性高分子層在pH1-3的范圍內(nèi)可保持其結(jié)構(gòu)，而在pH7-9的范圍內(nèi)發(fā)生離子化。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的pH敏感性高分子的pKa值為4.66，pKb值為7.0。當pKb范圍小于所述pKa值時，由于高分子層內(nèi)的氫鍵保持不變，高分子層的結(jié)構(gòu)也能穩(wěn)定不變，而當pKa范圍高于所述pKb值時，由于高分子發(fā)生離子化而生成陰離子，結(jié)果會誘導靜電排斥現(xiàn)象，使高分子發(fā)生分解，最終排放病毒疫苗粒子。因此，通過形成pH敏感性高分子層，可以防止病毒疫苗粒子在低pH范圍內(nèi)出現(xiàn)死亡和/或受損，同時保持疫苗粒子的穩(wěn)定性，且在腸內(nèi)的pH條件下排放出病毒疫苗。

在一個具體實施例中，pH敏感性高分子層的特征在于，在pH7-9的范圍內(nèi)發(fā)生離子化。

在一個具體實施例中，pH敏感性高分子層可以包含丙烯酸酯類高分子，或者由丙烯酸酯類高分子組成，但不限于此。

丙烯酸酯類高分子可選自聚（甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯）和聚（丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸）中的一種或多種物質(zhì)，但不限于此。可商購的丙烯酸酯類高分子可使用EUDRAGIT?的L 30 D-55、L 100-55、L 100、L12,5、S 100、S 12,5、FS 30 D。所述丙烯酸酯類高分子的重均摩爾質(zhì)量可以為100000-400000g/mol、100000-350000g/mol、120000-330000g/mol。

在一個具體實施例中，pH敏感性高分子層的厚度可以為1nm-1um、5nm-500nm、10nm-300nm、10nm-200nm、10nm-100nm、10nm-90nm、10nm-70nm、10nm-50nm、10nm-30nm或10nm-20nm。當厚度在上述范圍內(nèi)時，在pH1-3的范圍內(nèi)可以有效地保持病毒疫苗粒子的穩(wěn)定性，在pH5-9的范圍內(nèi)病毒疫苗粒子可以得到有效排放。此外，當pH敏感性高分子層的厚度在上述范圍內(nèi)時，不會引起免疫反應，同時將病毒疫苗粒子有效地運送至目的地。此外，當陽離子型高分子層和pH敏感性高分子層的厚度同時滿足上述范圍時，可以使效果進一步最大化。

此外，本發(fā)明提供口服病毒疫苗運送載體的制備方法，該方法包括：通過混合口服病毒疫苗粒子與陽離子型高分子來在口服病毒疫苗粒子上形成陽離子型高分子層的步驟；和通過使形成有所述陽離子型高分子層的口服病毒疫苗粒子與pH敏感性高分子進行混合來在所述陽離子型高分子層上形成pH敏感性高分子層的步驟。

如上所述，陽離子型高分子層與pH敏感性高分子層的疊層順序不受限制。因此，本發(fā)明還提供口服病毒疫苗運送載體的制備方法，該方法包括：通過混合口服病毒疫苗粒子與pH敏感性高分子來在口服病毒疫苗粒子上形成pH敏感性高分子層的步驟；和通過使形成有所述pH敏感性高分子層的口服病毒疫苗粒子與陽離子型高分子進行混合來在所述pH敏感性高分子層上形成陽離子型高分子層的步驟。

在本發(fā)明中，口服病毒疫苗粒子的使用不受限制，只要是針對腸內(nèi)病毒的疫苗即可。例如，本發(fā)明的一個實施例的口服病毒疫苗可以為針對阿爾法冠狀病毒、輪狀病毒、札如病毒、貓腸道冠狀病毒、細小病毒和杯狀病毒（Calicivirus）屬（genus）中的任一種病毒的疫苗。

病毒疫苗粒子和病毒可參見上述描述。

在一個具體實施例中，口服病毒疫苗粒子的平均粒徑可以為0.1-10um，但不限于此。然而，所述口服病毒疫苗粒子的形狀不限于完整的球形，還可包括類似于球形的形狀、部分直徑更長的長形橢圓形狀或類似于四邊形的形狀。

在一個具體實施例中，可以在低于7的pH值或在5-6的pH值范圍內(nèi)形成pH敏感性高分子層。本發(fā)明的pH敏感性高分子層，由于在pH7-9的范圍內(nèi)發(fā)生離子化，在如上所述的既不損害病毒疫苗粒子的穩(wěn)定性又能順利形成pH敏感性高分子層的pH值下，形成pH敏感性高分子層。此外，在上述pH值范圍下，除了形成pH敏感性高分子層，還進行陽離子型高分子層的形成和口服病毒疫苗運送載體的制備等全過程。

在一個具體實施例中，pH敏感性高分子層還可以包含丙烯酸酯類高分子，或者由丙烯酸酯類高分子組成，但不限于此。

丙烯酸酯類高分子可選自聚（甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯）和聚（丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸）中的一種或多種物質(zhì)，但不限于此。可商購的丙烯酸酯類高分子可使用EUDRAGIT?的L 30 D-55、L 100-55、L 100、L12,5、S 100、S 12,5、FS 30 D。所述丙烯酸酯類高分子的重均摩爾質(zhì)量可以為100000-400000g/mol、100000-350000g/mol、120000-330000g/mol。

在一個具體實施例中，基于100重量份的口服病毒疫苗粒子，可以混合0.5-20重量份、1-15重量份或5-10重量份的pH敏感性高分子。在上述重量份的范圍內(nèi)，可以形成具有適當厚度的pH敏感性高分子層。

在一個具體實施例中，陽離子型高分子可選自聚賴氨酸、聚組氨酸和聚精氨酸中的一種或多種物質(zhì)，但不限于此。

在一個具體實施例中，陽離子型高分子可由以下化學式1表示。

【化學式1】

(聚合-M)k

在上述化學式中，M表示賴氨酸、組氨酸或精氨酸，k表示2-50。

在一個具體實施例中，基于100重量份的口服病毒疫苗粒子，可以混合0.5-20重量份、1-15重量份或5-10重量份的陽離子型高分子。在上述重量份的范圍內(nèi)，可以形成具有適當厚度的陽離子型高分子層。

此外，本發(fā)明提供用于預防病毒感染的方法，該方法包括：口服給藥本發(fā)明的病毒疫苗運送載體。

在本發(fā)明中，口服病毒疫苗粒子的使用不受限制，只要是針對腸內(nèi)病毒的疫苗即可，具體內(nèi)容可見上述描述。

所述口服給藥通?？赏ㄟ^疫苗或醫(yī)藥制劑的口服給藥方法來進行，具體的給藥次數(shù)、給藥量、給藥途徑可根據(jù)給藥對象的年齡、體重、性別及其他特征所決定。例如，所述給藥可與其他食品或飼料等一同混合進行，因此可將有效劑量分一次或多次進行給藥。

所述病毒感染是指病毒進入受體體內(nèi)并感染細胞等的現(xiàn)象，根據(jù)包含在疫苗運送載體內(nèi)的疫苗粒子的種類，引起感染的病毒可以不同，具體通過提高針對腸內(nèi)病毒的疫苗的運送效率來獲得更優(yōu)秀的預防效果。

下面，通過實施例具體說明本發(fā)明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明，并不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例

【對比實施例1】口服病毒疫苗運送載體的制備：病毒疫苗粒子-陽離子型高分子層

在1ml的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)溶解30mg陽離子型高分子聚賴氨酸。將1ml的所述混合液以小量滴入到進行600rpm攪拌中的5ml口服病毒疫苗（PEDV，綠十字獸醫(yī)藥品）水溶液（pH5-6）中。然后，在600rpm下攪拌1小時，從而合成涂有陽離子型高分子的口服病毒疫苗的載體。

【對比實施例2】口服病毒疫苗運送載體的制備：病毒疫苗粒子-pH敏感性高分子層

在由1ml乙醇和1ml的DMEM培養(yǎng)基組成的共溶劑內(nèi)溶解20mg的pH敏感性高分子（Eudragit S100）。將50ul的所述混合液以小量滴入到進行600rpm攪拌中的5ml口服病毒疫苗（PEDV，綠十字獸醫(yī)藥品）水溶液中。然后，在600rpm下攪拌1小時，去除乙醇后，從而合成涂有pH敏感性高分子的口服病毒疫苗的載體。

【制備實施例1】口服病毒疫苗運送載體的制備：病毒疫苗粒子-陽離子型高分子層-pH敏感性高分子層

在由1ml乙醇和1ml的DMEM培養(yǎng)基組成的共溶劑內(nèi)溶解20mg的pH敏感性高分子（Eudragit S100）。將50ul的所述混合液以小量滴入到進行600rpm攪拌中的5ml對比實施例1的運送載體溶液中。然后，在600rpm下攪拌1小時，去除乙醇后，制備由病毒疫苗粒子-陽離子型高分子層-pH敏感性高分子層組成的口服病毒疫苗運送載體。圖1展示了本發(fā)明的口服病毒疫苗運送載體的制備過程。

【制備實施例2】口服病毒疫苗運送載體的制備：病毒疫苗粒子- pH敏感性高分子層-陽離子型高分子層

在1ml的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)溶解30mg陽離子型高分子聚賴氨酸。將1ml的所述混合液以小量滴入到進行600rpm攪拌中的5ml對比實施例2的運送載體溶液中。然后，在600rpm下攪拌1小時，從而制備由病毒疫苗粒子-pH敏感性高分子層-陽離子型高分子層組成的口服病毒疫苗運送載體。

【實驗實施例1】口服病毒疫苗運送載體的穩(wěn)定性的鑒定

為了鑒定本發(fā)明的口服病毒疫苗運送載體根據(jù)pH值的中間變化，通過利用豬流行性腹瀉病毒快速試劑盒（PEDV Rapid kit），測定穩(wěn)定性。

將未形成涂層的pH7-8的口服PEDV疫苗、未形成涂層的pH5-6的口服PEDV疫苗及僅涂有pH敏感性高分子的PEDV疫苗運送載體（對比實施例2）用作對照組，將制備實施例1（先形成陽離子型高分子層的疫苗運送載體）和制備實施例2（先形成pH敏感性高分子層的疫苗運送載體）用作實驗組，然后利用快速試劑盒，針對三組對照組及兩組實驗組進行口服病毒疫苗運送載體的穩(wěn)定性的鑒定。

實驗條件為，為了鑒定根據(jù)pH值的中間變化，將pH值先降至胃內(nèi)環(huán)境下的pH1-2，而后提高至腸內(nèi)環(huán)境下的pH7.6-8.5，然后利用快速試劑盒鑒定穩(wěn)定性。

在鑒定穩(wěn)定性之前，首先通過利用pH指示劑酚紅來確認pH的變化。將各組中的運送載體處理至含有酚紅的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，先將pH值降至1（胃內(nèi)pH值），然后提高至8（腸內(nèi)pH值），而后確認顏色變化。其結(jié)果可見，如圖2所示，通過酚紅（低于pH6.8時顯示黃色，pH6.8-8時顯示紅色（紫紅色））的顏色變化，可確認各組的運送載體的環(huán)境變成胃內(nèi)的pH環(huán)境和腸內(nèi)的pH環(huán)境。

在圖3中展示了快速試劑盒的實驗結(jié)果。圖3中的對照組（Control）顯示，當利用快速試劑盒處理陽性對照組時應當出現(xiàn)線條。測試（TEST）線作為確認PEDV存在與否的線條，當出現(xiàn)線條時可確認PEDV的存在。

在圖3中，1號為未形成涂層的純口服PEDV疫苗（pH8.77）的結(jié)果，2號為未形成涂層的口服PEDV疫苗（pH5.8），2號(低->高）展示了將2號的pH值先降至1后提高至8之后的結(jié)果。

3號中的第一次為將陽離子型高分子聚賴氨酸（pLys）涂在2號的PEDV疫苗上時的結(jié)果，3號中的第二次為將pH敏感性高分子進一步涂在3號的第一次上時的結(jié)果，3號(低->高）展示了將3號中第二次的pH值先降到1后提高至8之后的結(jié)果。

4號中的第一次為將pH敏感性高分子涂在2號的PEDV疫苗上時的結(jié)果，4號中的第二次為將陽離子型高分子聚賴氨酸（pLys）進一步涂在4號中的第一次上時的結(jié)果，4號(低->高）展示了將4號中的第二次的pH值先降到1后提高至8之后的結(jié)果。

5號中的第一次為將pH敏感性高分子涂在2號的PEDV疫苗上時的結(jié)果，5號(低->高）展示了將5號中的第一次的pH值先降到1后提高至8之后的結(jié)果。

結(jié)果可見，當同時形成陽離子型高分子層和pH敏感性高分子層時，不分涂層的順序（3號和4號的低->高），即使在低pH條件下也能確認病毒疫苗粒子的穩(wěn)定性。與此相反，未形成涂層或僅形成pH敏感性高分子層時，可確認穩(wěn)定性的降低。