本發(fā)明涉及一種抗菌霜?jiǎng)?，尤其涉及一種含納米金的抗菌霜?jiǎng)约霸摽咕獎(jiǎng)┑闹苽浞椒ê蛻?yīng)用。

背景技術(shù)：

在處理病人傷口時(shí)，需要在傷口上覆蓋敷料，防止細(xì)菌侵入和防止水分損失。傳統(tǒng)的敷料如紗布、棉墊等對(duì)創(chuàng)面雖有保護(hù)作用，沒(méi)有保濕作用，對(duì)于一些傷口在移除傳統(tǒng)敷料時(shí)，敷料容易粘連傷口組織，造成二次傷口破壞。而霜?jiǎng)╊惙罅匣蛩幬锒芸朔鹘y(tǒng)敷料的一些不足，霜?jiǎng)┮子谇逑?，?duì)皮膚表面分泌物具有親和力，不妨礙皮膚表面水分蒸發(fā)，涂后較舒適，霜?jiǎng)┰卺t(yī)藥領(lǐng)域已被廣泛的使用于治療外科創(chuàng)傷、皮膚炎癥、婦科炎癥、直腸炎癥、美容等方面。

許多霜?jiǎng)╊惙罅匣蛩幬?，含有的抗菌成分有較大的不足。納米銀有較強(qiáng)的抗菌性能，但是由于納米銀的不穩(wěn)定性以及對(duì)人體細(xì)胞的毒性較大，美國(guó)FDA已經(jīng)明確禁止納米銀在醫(yī)療方面的使用，我國(guó)CFDA在醫(yī)用某些方面限制了納米銀的使用。

近年來(lái)，穩(wěn)定性更好、對(duì)人體細(xì)胞毒性更小的納米金作為抗菌劑的研究逐漸被報(bào)道。Zhao yuyun等(Zhao Y,Tian Y,Cui Y,et al.Small molecule-capped gold nanoparticles as potent antibacterial agents that target gram-negative bacteria[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(35):12349-12356；Zhao Y,Chen Z,Chen Y,et al.Synergy of non-antibiotic drugs and pyrimidinethiol on gold nanoparticles against superbugs[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(35):12940-12943.和Zhao Y,Ye C,Liu W,et al.Tuning the composition of AuPt bimetallic nanoparticles for antibacterial application[J].Angewandte Chemie International Edition,2014,53(31):8127-8131.)報(bào)道的氨基嘧啶或氨基嘧啶/含氨基小分子的雙組份藥物修飾的納米金抗菌劑和納米金鉑雙金屬抗菌劑有很強(qiáng)的廣譜抗菌性，其對(duì)人體細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于納米銀，并且不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，是一類非常有前途的抗菌劑。Anna Regiel-Futyra(Regiel-Futyra A,M,Sebastian V,et al.Development of Noncytotoxic Chitosan–Gold Nanocomposites as Efficient Antibacterial Materials[J].ACS applied materials&interfaces,2015,7(2):1087-1099.報(bào)道的殼聚糖絡(luò)合的納米金也具有優(yōu)異的抗菌性和對(duì)人體細(xì)胞低的毒性。

上述報(bào)道合成的納米金需要透析處理，工藝較復(fù)雜，工藝有待進(jìn)一步簡(jiǎn)化；單純的納米金溶液不易用于臨床的傷口治療與修復(fù)，抗菌性能有待進(jìn)一步提高。

目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)公開文獻(xiàn)報(bào)道添加納米金制作的抗菌霜?jiǎng)┓罅稀?/p>

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種具有光譜抗菌性且對(duì)人體細(xì)胞毒性較低的含納米金的抗菌霜?jiǎng)€提供了所述含納米金的抗菌霜?jiǎng)┑闹苽浞椒捌鋺?yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種含納米金的抗菌霜?jiǎng)隹咕獎(jiǎng)┖幸灾亓堪俜直?4～34％的油相、3～5％的乳化劑、5～10％的保濕劑、0.001～1％的具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒、0～0.01％的防腐劑，以及水。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌霜?jiǎng)?，其中，所述油相選自高級(jí)脂肪酸及其酯、蠟、高級(jí)醇、烴類、動(dòng)物油和植物油中的一種或多種；優(yōu)選地，所述高級(jí)脂肪酸及其酯選自己二酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、己二酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、癸二酸二乙酯、月桂酸己酯、異辛酸鯨蠟酯、氫化大豆磷脂、羊毛脂和羊毛脂衍生物中的一種或多種，所述蠟選自天然蠟、鯨蠟、蜂蠟、地蠟和石蠟中的一種或多種，所述高級(jí)醇選自鯨蠟醇、硬脂醇和鯨蠟硬脂醇中的一種或多種；所述烴類選自凡士林、親水性凡士林、白凡士林、純化羊毛脂和液體石蠟中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌霜?jiǎng)渲?，所述乳化劑選自皂類、月桂醇硫酸鈉、多元醇的脂肪酸酯和聚山梨酯類中的一種或多種，優(yōu)選為選自三乙醇胺、氫氧化鋁、雙硬脂酸鋁、十二烷基酸鈉、硬脂酸甘油酯和吐溫80中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌霜?jiǎng)?，其中，所述保濕劑選自甘油、丙二醇、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇和聚丙三醇中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明提供的抗菌霜?jiǎng)?，其中，所述具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒的粒徑小于50nm，優(yōu)選為1～10nm。

優(yōu)選地，所述具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒選自納米金、由單組份或多組分小分子藥物或大分子修飾的納米金、以及含納米金的雙組份或多組分金屬納米顆粒中的一種或多種。

更優(yōu)選地，所述由單組份或多組分小分子藥物或大分子修飾的納米金為以含氨基嘧啶類小分子或氨基類小分子作為單組份修飾的納米金顆粒或以含氨基嘧啶類小分子/氨基類小分子作為雙組份修飾的納米金顆粒，所述含氨基嘧啶類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1，所述氨基類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1，最優(yōu)選地，所述含氨基嘧啶類小分子為4,6-2氨基-2-巰基嘧啶，氨基類小分子為二甲雙胍或殼聚糖，所述殼聚糖的聚合度優(yōu)選為2～10。

或更優(yōu)選地，所述含納米金的雙組份或多組分金屬納米顆粒為納米金-鉑雙金屬納米顆粒。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述納米金-鉑雙金屬納米顆粒由50～80％原子百分比的金和20～50％原子百分比的鉑組成。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌霜?jiǎng)渲?，所述防腐劑選自羥苯甲酯和羥苯乙酯中的一種或兩種。優(yōu)選地，所述抗菌霜?jiǎng)┻€包含表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑中的一種或多種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述表面活性劑為氧乙烯乙二醇脂肪酸酯和聚氧乙烯乙二醇脂肪酸酯乙二醇烷基醚中的一種或兩種，所述pH調(diào)節(jié)劑為三乙醇胺、氫氧化鉀和氫氧化鈉中的一種或多種，所述穩(wěn)定劑為磷酸氫鈉、氯化鈉和亞硫酸鈉中的一種或多種，所述水為蒸餾水。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌霜?jiǎng)?，其中，所述抗菌霜?jiǎng)┻€含有占0～5％重量百分比的納米金制備相關(guān)物質(zhì)。優(yōu)選地，所述納米金制備物質(zhì)選自還原劑、表面活性劑和有機(jī)酸中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述還原劑為硼氫化鈉或抗壞血酸鈉，所述表面活性劑為吐溫80，所述有機(jī)酸為乙酸。

鑒于此，本發(fā)明的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┛梢员硎鰹橛芍亓堪俜直扔?jì)的24～34％的油相、3～5％的乳化劑、5～10％的保濕劑、0.001～1％的具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒、0～0.01％的防腐劑、0～0.5％的納米金制備相關(guān)物質(zhì)，以及余量的水組成。如不含該納米金制備相關(guān)物質(zhì)，則可表述為由重量百分比計(jì)的24～34％的油相、3～5％的乳化劑、5～10％的保濕劑、0.001～1％的具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒、0～0.01％的防腐劑，以及余量的水組成。

本發(fā)明還提供了上述抗菌霜?jiǎng)┑闹苽浞椒?，所述方法包括以下步驟：

(1)按照配比，將油相混合均勻，加熱到50～80℃；

(2)按照配比，將乳化劑、保濕劑、具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒和水混合均勻，加熱到50～80℃制成水相；

(3)將油相加入水相中攪拌皂化形成水包油型乳化混合物，所述混合物降溫至40～60℃，攪拌均勻制得所述含納米金的抗菌霜?jiǎng)?/p>

優(yōu)選地，在所述步驟(2)中，將所述防腐劑與所述乳化劑、保濕劑、具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒和水混合均勻。

所述具有抗菌性能的含納米金的納米顆?？梢詾榧{米金溶液的形式。換言之，步驟(2)中的具有抗菌性能的含納米金的納米顆?？梢詾閷⒑猩鲜龊{米金的納米顆粒的納米金溶液。

根據(jù)本發(fā)明提供的抗菌凝膠的制備方法，其中，步驟(2)中所述具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒可以通過(guò)以下步驟制得：

(a)按照配比，將氯金酸溶液與含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液或氯鉑酸鉀溶液混合，得到混合溶液；

(b)在攪拌下向所述混合溶液中快速加入還原劑，充分反應(yīng)后即得到含有所述含納米金的納米顆粒的納米金溶液；

其中，所述還原劑的加入時(shí)間不超過(guò)5分鐘。優(yōu)選不超過(guò)1分鐘。更優(yōu)選10～60秒。

優(yōu)選地，步驟(a)中所述含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液還可以包括有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸。優(yōu)選為乙酸、丙酸或鹽酸。更優(yōu)選地，所述有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸在所述納米金溶液中的質(zhì)量百分比為0.01％～10％。

優(yōu)選地，步驟(a)中所述含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液中還可以包括非離子表面活性劑。優(yōu)選為吐溫或聚乙二醇。更優(yōu)選地，非離子表面活性劑在所述納米金溶液中的質(zhì)量百分比為0.005％～10％。

優(yōu)選地，步驟(b)中所述還原劑可以選自硼氫化鈉、檸檬酸鈉和抗壞血酸鈉中的一種或多種。步驟(b)中所述充分反應(yīng)溫度可以為室溫或室溫以下，例如可以為25℃以下，時(shí)間可以為0.5～3小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟(b)中所述含納米金的納米顆粒在所述納米金溶液中的濃度為10～4000ppm，優(yōu)選為400～4000ppm，更優(yōu)選為800～4000ppm。更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述還原劑與氯金酸的摩爾比或者所述還原劑與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾比為1:1～10:1。其中，1ppm通?？蓳Q算為1mg/L。更優(yōu)選地，上述含納米金的納米顆粒的制備方法不包含純化所述納米金溶液的步驟。進(jìn)一步優(yōu)選地，純化所述納米金溶液的步驟包括用透析袋透析處理或離心過(guò)濾處理。換言之，本發(fā)明生產(chǎn)方法不需要用透析袋透析處理或離心過(guò)濾處理等方式來(lái)純化含金納米顆粒。作為更進(jìn)一步的限定，上述含納米金的納米顆粒的制備方法也可以表述為由步驟(a)和步驟(b)組成。

本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在制備氯金酸溶液時(shí)使用的氯金酸原料可以為四水合氯金酸。

本發(fā)明還提供了上述抗菌霜?jiǎng)┗虿捎蒙鲜鲋苽浞椒ㄖ苽涞乃獎(jiǎng)┰谥苽溆糜谥委煙齻?、燙傷、褥瘡感染、皮膚炎癥、婦科疾病或肛腸疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景中所報(bào)道的抗菌納米金的制備方法中，還原劑是以滴加的方式加入，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)，背景報(bào)道的滴加方式耗時(shí)太長(zhǎng)，不能實(shí)現(xiàn)，而在本發(fā)明提供的含納米金的納米顆粒的制備方法中，還原劑為一次性快速加入到所述混合溶液，因此更節(jié)約時(shí)間，有助于提升生產(chǎn)效率。

現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道的納米金溶液在反應(yīng)完成后需要用透析袋透析或離心沉淀，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)，背景報(bào)道的后處理方法復(fù)雜，設(shè)備昂貴。而在本發(fā)明提供的含納米金的納米顆粒的制備方法不需要透析或離心沉淀處理，因此工藝更為簡(jiǎn)單，降低了生產(chǎn)成本，進(jìn)一步提升了生產(chǎn)效率。

通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)證明，本發(fā)明提供的制備方法所制備的含納米金的納米顆粒的抗菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于還原劑滴加和/或經(jīng)過(guò)透析處理所制備的含納米金的納米顆粒。

本發(fā)明提供的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┡c含同一類型同一重量百分比的納米金抗菌溶液相比，抗菌效果更優(yōu)，且對(duì)人體細(xì)胞的毒性也更低，且也明顯低于納米銀霜?jiǎng)┖拖跛徙y霜?jiǎng)?/p>

本發(fā)明制備的含納米金的抗菌霜?jiǎng)?，有?yōu)異的廣譜抗菌性、對(duì)人體細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于市場(chǎng)上銷售的含納米銀或其他銀離子類的抗菌霜?jiǎng)?，該霜?jiǎng)?duì)患者無(wú)疼痛感、具有較強(qiáng)的患者適應(yīng)性，可應(yīng)用于治療各種燒傷、燙傷、褥瘡感染、各種創(chuàng)傷感染，皮膚炎癥如手足癬、婦科疾病如女性生殖道炎癥、宮頸炎、宮頸糜爛，肛腸疾病如直腸炎癥等，也可與傳統(tǒng)的傷口包扎配合使用。

附圖說(shuō)明

以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1示出了示出了實(shí)施例1的納米金與商購(gòu)納米銀的透射電鏡(TEM)圖；

圖2示出了實(shí)施例1的含納米金的抗菌霜?jiǎng)⒓{米金的抗菌溶液、納米銀霜?jiǎng)┖拖跛徙y霜?jiǎng)┑募?xì)胞毒性比較。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說(shuō)明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。

本部分對(duì)本發(fā)明試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在上下文中，如果未特別說(shuō)明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。

以下實(shí)施例中使用的試劑和儀器如下：

試劑：

硬脂酸，白凡士林、甘油、液體石蠟、羊毛脂、鯨醋醇、吐溫80、硬脂酸甘油酯、甘油、羥苯乙酯、硝酸銀、殼聚糖、四水合氯金酸、氯鉑酸鉀均購(gòu)自國(guó)藥試劑。

4,6-2氨基-2-巰基嘧啶、二甲雙胍、硼氫化鈉、抗壞血酸鈉均購(gòu)自Sigma公司。

納米銀溶液購(gòu)自張家港耐爾納米科技有限公司。

納米銀霜?jiǎng)┖拖跛徙y霜?jiǎng)┎捎门c實(shí)施例1的納米金霜?jiǎng)┫嗤乃獎(jiǎng)┗|(zhì)配方配制而成。

儀器：

200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡，購(gòu)自美國(guó)FEI公司、型號(hào)Tecnai G2S-TWIN。

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)；型號(hào)iCAP 6300；購(gòu)自：美國(guó)Thermo Scientific公司。

實(shí)施例1

本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┘捌渲苽浞椒ā?/p>

抗菌霜?jiǎng)┑呐浞?以重量百分比計(jì))：4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒：0.01％；硬脂酸：14％，白凡士林：5％；液體石蠟：15％；甘油：10％；吐溫80：5％；余量的水。

制備步驟：

(1)將硬脂酸、白凡士林、液體石蠟混合均勻，加熱到50℃，制得油相；

(2)將4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒、甘油、吐溫80混合均勻，加熱到80℃，制得水相；

(3)將油相緩緩加到水相中攪拌皂化形成水包油型乳化混合物，混合物在60℃以下時(shí)，攪拌均勻即得到所述含納米金的抗菌霜?jiǎng)?/p>

上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的制備方法為：

(a)將0.4g的四水合氯金酸溶于0.1L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶和二甲雙胍溶于0.1L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助于促進(jìn)氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于0.05L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時(shí)10s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時(shí)至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.25L的濃度約為800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為0.5:1，二甲雙胍與金元素的摩爾含量比為2:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為3:1，乙酸占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％，表面活性劑吐溫80占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％。

經(jīng)ICP-OES測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械暮鹆繛?.01％(重量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械募{米金顆粒的平均粒徑為5nm。其透射電鏡圖如圖1所示(以商購(gòu)自張家港耐爾納米科技公司的納米銀作對(duì)比)。

對(duì)比例1

按照與實(shí)施例1相同的制備方法制得對(duì)比例1的納米金顆粒，加入純化水，制成納米金抗菌溶液，使其與實(shí)施例1中的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┯邢嗤募{米金質(zhì)量百分含量。

對(duì)比例1.1

按照與對(duì)比例1相似的制備方法制得對(duì)比例1.1的納米金抗菌溶液，其區(qū)別在于，對(duì)比例1.1中還原劑以滴加的方式加入到混合溶液中，并且采用透析處理24小時(shí)的方式得到納米金抗菌溶液，加入純化水，使其與對(duì)比例1中的納米金抗菌溶液有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

試驗(yàn)例1

通過(guò)試驗(yàn)例1中的抗菌實(shí)驗(yàn)，證明對(duì)比例1的納米金抗菌溶液要優(yōu)于對(duì)比例1.1的納米金抗菌溶液。

比較方法如下：采用最小抑菌濃度MIC(mg/L)來(lái)衡量，采用微孔稀釋方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，將100μL不同濃度的納米金加入到96微孔板中，10μL相同濃度(10⁴CFU/mL)的細(xì)菌培養(yǎng)液加入每個(gè)微孔中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察，沒(méi)有可看見的細(xì)菌生長(zhǎng)的微孔最少的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

測(cè)試結(jié)果見表1。從測(cè)試結(jié)果可見，對(duì)比例1的納米金抗菌溶液的抗菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)比例1.1的納米金抗菌效果。說(shuō)明采用與對(duì)比例1制備方法相同的納米金顆粒制備的含納米金的抗菌霜?jiǎng)淇咕Ч矐?yīng)遠(yuǎn)優(yōu)于采用與對(duì)比例1.1制備方法相同的納米金顆粒制備的含納米金的抗菌霜?jiǎng)?/p>

表1 對(duì)比例1和對(duì)比例1.1的納米金抗菌溶液的抗菌性能比較

實(shí)施例2

本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┘捌渲苽浞椒ā?/p>

抗菌霜?jiǎng)┑呐浞?以重量百分比計(jì))：4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒：1％；硬脂酸甘油酯：3％；羊毛脂：5％；硬脂酸：10％；白凡士林：3％；液體石蠟：10％；甘油：10％；余量的水。

制備步驟：

(1)將硬脂酸、白凡士林、液體石蠟混合均勻，加熱到80℃，制得油相；

(2)將4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒、甘油、硬脂酸甘油酯混合均勻，加熱到50℃，制得水相；

(3)將油相緩緩加到水相中攪拌皂化形成水包油型乳化混合物，混合物在50℃以下時(shí)，攪拌均勻即得到所述含納米金的抗菌霜?jiǎng)?/p>

上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的制備方法為：

(a)將2g的四水合氯金酸溶于0.1L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶和二甲雙胍溶于0.1L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助于促進(jìn)氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于0.05L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時(shí)20s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌0.6小時(shí)至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.25L的濃度約為4000ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為2:1，二甲雙胍與金元素的摩爾含量比為0.5:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為2:1，乙酸占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％，表面活性劑吐溫80占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.005％。

經(jīng)ICP-OES測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械暮鹆繛?％(重量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械募{米金顆粒的平均粒徑為6nm。

對(duì)比例2

按照與實(shí)施例2相同的制備方法制得對(duì)比例2的納米金顆粒，加入純化水，制成納米金抗菌溶液，使其與實(shí)施例2中的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┯邢嗤募{米金質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例3

本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┘捌渲苽浞椒ā?/p>

抗菌霜?jiǎng)┑呐浞?以重量百分比計(jì))：納米金-鉑(金含量80％原子百分比，鉑含量20％原子百分比)雙金屬納米顆粒：0.04％；硬脂酸甘油酯：3％；鯨蠟醇：2％；硬脂酸：10％；白凡士林：5％；液體石蠟：15％；甘油：5％；余量的水。

制備步驟：

(1)將鯨蠟醇、硬脂酸、白凡士林、液體石蠟混合均勻，加熱到60℃，制得油相；

(2)將納米金-鉑雙金屬納米顆粒、甘油、硬脂酸甘油酯混合均勻，加熱到60℃，制得水相；

(3)將油相緩緩加到水相中攪拌皂化形成水包油型乳化混合物，混合物在60℃以下時(shí)，攪拌均勻即得到所述含納米金的抗菌霜?jiǎng)?/p>

上述納米金-鉑雙金屬納米顆粒的制備方法為：

(a)將0.41g的四水合氯金酸和0.12氯鉑酸鉀溶于0.1L的去離子水中，得到混合溶液。

(b)將一定量的硼氫化鈉溶于0.1L的去離子水中，在攪拌下將上述硼氫化鈉溶液快速加入(用時(shí)30s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時(shí)至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.2L的含有約1200ppm(按照投料比算出)的納米金-鉑雙金屬納米顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，還原劑硼氫化鈉與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾含量比為3:1，金的原子百分比為80％，鉑的原子百分比為20％，因此該金-鉑納米顆?？杀硎緸锳u₈₀Pt₂₀納米顆粒。

經(jīng)ICP-OES測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械暮鹆繛?.04％(重量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械募{米金顆粒的平均粒徑為6nm。

對(duì)比例3

按照與實(shí)施例3相同的制備方法制得對(duì)比例3的納米金顆粒，加入純化水，制成納米金抗菌溶液，使其與實(shí)施例3中的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┯邢嗤募{米金質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例4

本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┘捌渲苽浞椒ā?/p>

抗菌霜?jiǎng)┑呐浞?以重量百分比計(jì))：納米金-鉑(金含量50％原子百分比，鉑含量50％原子百分比)雙金屬納米顆粒：0.001％；硬脂酸甘油酯：3％；磷脂：2％；硬脂酸：10％；白凡士林：7％；液體石蠟：8％；甘油：10％；羥苯乙酯：0.01％；余量的水。

制備步驟：

(1)將磷脂、硬脂酸、白凡士林、液體石蠟混合均勻，加熱到70℃，制得油相；

(2)將納米金-鉑雙金屬納米顆粒、甘油、硬脂酸甘油酯、羥苯乙酯混合均勻，加熱到60℃，制得水相；

(3)將油相緩緩加到水相中攪拌皂化形成水包油型乳化混合物，混合物在60℃以下時(shí)，攪拌均勻即得到所述含納米金的抗菌霜?jiǎng)?/p>

上述納米金-鉑雙金屬納米顆粒的制備方法為：

(a)將0.17g的四水合氯金酸和0.2g氯鉑酸鉀溶于0.1L的去離子水中，得到混合溶液。

(b)將一定量的硼氫化鈉溶于0.1L的去離子水中，在攪拌下將上述硼氫化鈉溶液快速加入(用時(shí)30s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時(shí)至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.2L的含有約800ppm(按照投料比算出)的納米金-鉑雙金屬納米顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，還原劑硼氫化鈉與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾含量比為3:1，鉑的質(zhì)量百分比為50％，因此該金-鉑納米顆粒可表示為Au₅₀Pt₅₀納米顆粒。

經(jīng)ICP-OES測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械暮鹆繛?.001％(重量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械募{米金顆粒的平均粒徑為4nm。

對(duì)比例4

按照與實(shí)施例4相同的制備方法制得對(duì)比例4的納米金顆粒，加入純化水，制成納米金抗菌溶液，使其與實(shí)施例4中的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┯邢嗤募{米金質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例5

本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┘捌渲苽浞椒ā?/p>

抗菌霜?jiǎng)┑呐浞?以重量百分比計(jì))：殼聚糖包覆的納米金金屬納米顆粒：0.1％；硬脂酸甘油酯：3％；硬脂酸：10％；白凡士林：6％；液體石蠟：8％；甘油：8％；余量的水。

制備步驟：

(1)將硬脂酸、白凡士林、液體石蠟混合均勻，加熱到60℃，制得油相；

(2)將殼聚糖包覆的納米金金屬納米顆粒、甘油、硬脂酸甘油酯混合均勻，加熱到60℃，制得水相；

(3)將油相緩緩加到水相中攪拌皂化形成水包油型乳化混合物，混合物在40℃以下時(shí)，攪拌均勻即得到所述含納米金的抗菌霜?jiǎng)?/p>

上述殼聚糖包裹的納米金金屬納米顆粒的制備方法為：

(a)將0.4g的四水合氯金酸溶于0.1L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的殼聚糖溶于0.1L的去離子水中，將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于0.05L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時(shí)10s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時(shí)至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.25L的濃度約為800ppm的(按照投料比算出的)含有上述殼聚糖組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為3:1。

經(jīng)ICP-OES測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械暮鹆繛?.1％(重量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測(cè)定，該抗菌霜?jiǎng)┲械募{米金顆粒的平均粒徑為5nm。

對(duì)比例5

按照與實(shí)施例5相同的制備方法制得對(duì)比例5的納米金顆粒，加入純化水，制成納米金抗菌溶液，使其與實(shí)施例5中的納米金的抗菌霜?jiǎng)┯邢嗤募{米金質(zhì)量百分含量。

試驗(yàn)例1

將實(shí)施例1采用的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金抗菌霜?jiǎng)┡c市售含納米銀抗菌的抗菌霜?jiǎng)?購(gòu)自張家港耐爾納米科技公司)的抗菌性能相比較，說(shuō)明本發(fā)明的含納米金的抗菌霜?jiǎng)?yīng)具有良好的抗菌性能。

比較方法如下：采用最小抑菌濃度MIC(mg/L)來(lái)衡量，采用微孔稀釋方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，將100μL不同濃度的納米金或納米銀加入到96微孔板中，10μL相同濃度(10⁴CFU/mL)的細(xì)菌培養(yǎng)液加入每個(gè)微孔中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察，沒(méi)有可看見的細(xì)菌生長(zhǎng)的微孔中最少的納米金或納米銀的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。測(cè)試結(jié)果見表2。

從測(cè)試結(jié)果可見，實(shí)施例1的大腸桿菌和綠膿桿菌的MIC都小于市售含納米銀抗菌抗菌霜?jiǎng)┑腗IC，由此說(shuō)明，實(shí)施例1對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌的抗菌性能優(yōu)于含市售納米銀的抗菌霜?jiǎng)?/p>

表2 實(shí)施例1與市售含納米銀的抗菌霜?jiǎng)┑目咕阅鼙容^結(jié)果

試驗(yàn)例2

通過(guò)不同納米金含量的霜?jiǎng)┮志?shí)驗(yàn)，來(lái)說(shuō)明含納米金的抗菌霜?jiǎng)┑囊志钚浴?/p>

按照《藥品微生物檢驗(yàn)手冊(cè)》第18章第1節(jié)管碟法進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)實(shí)施例1-5和對(duì)比例1-5進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

測(cè)試結(jié)果可見，盡管各實(shí)施例的納米金重量百分比和類型不同，但均可觀察到明顯的抑菌圈，說(shuō)明含納米金的抗菌霜?jiǎng)?duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均有良好的抑菌效果。且同一濃度同一類型的含納米金的抗菌霜?jiǎng)┑囊志笥诩{米金抗菌溶液，說(shuō)明含納米金的抗菌霜?jiǎng)┑囊志Ч獌?yōu)于有相同納米金含量相同納米金類型的納米金抗菌溶液。

表3 不同納米金含量的霜?jiǎng)┖腿芤阂志y(cè)試結(jié)果(單位：mm)

試驗(yàn)例3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞毒性試驗(yàn)操作過(guò)程：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在含有10％牛胎血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。在96微孔板的每個(gè)孔中加入10⁴個(gè)HUVEC細(xì)胞，每個(gè)孔中加入含不同濃度的納米顆粒(2-巰基-4,6-二氨基嘧啶/二甲雙胍雙組分修飾的納米金顆粒)的抗菌霜?jiǎng)?、含不同濃度的納米顆粒(2-巰基-4,6-二氨基嘧啶/二甲雙胍雙組分修飾的納米金顆粒)的抗菌溶液、納米銀霜?jiǎng)⑾跛徙y霜?jiǎng)┑?00微升。微孔介質(zhì)中在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)，沒(méi)有加入抗菌劑的HUVEC細(xì)胞作為對(duì)照。培養(yǎng)完后，微孔中的溶液用磷酸緩沖溶液(PBS，0.01mol/L，pH 7.4)洗一次，加入10％(v/v)的CCK-8溶液在微孔介質(zhì)中，在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450nm處測(cè)量各樣品孔以及對(duì)照孔的吸光值。計(jì)算各個(gè)樣品孔細(xì)胞相對(duì)活力。各樣品孔細(xì)胞相對(duì)活力定義為：各個(gè)孔吸光值/對(duì)照孔的吸光值×100％。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

從圖2所示的試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明提供的含納米金的霜?jiǎng)┰诓煌瑵舛认碌募?xì)胞毒性均明顯低于納米金抗菌溶液、納米銀霜?jiǎng)┖拖跛徙y霜?jiǎng)?/p>

盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各個(gè)條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個(gè)因素的等同替換。