本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及異長春花苷內(nèi)酰胺在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

膽木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard)，又名烏檀，是茜草科植物膽木的干燥根莖，主要分布于我國海南、廣東、廣西等省。其性味苦、寒，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，民間常用于感冒發(fā)熱、肺炎、腸炎、痢疾、濕疹、皮疹、膿瘍等病的治療。文獻報道膽木中主要含有生物堿類成分，而異長春花苷內(nèi)酰胺(Strictosamide)是含量最高的生物堿成分(Fenxia Zhu^*，Jiaquan Chen，Hui Wang，et al Journal of Chromatography B，2015，1007：54-66；胡欣.烏檀化學(xué)成分分離分析與相關(guān)成分活性、藥動學(xué)研究.沈陽藥科大學(xué)，2007；陳家全，徐光富，王慧，等.UPLC法同時測定膽木中6種成分的含量.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2014，45(4)：434-437)。

發(fā)明人前期利用柱色譜技術(shù)結(jié)合自動純化系統(tǒng)制備了異長春花苷內(nèi)酰胺單體化合物(朱粉霞，王靜靜，宋捷，等.膽木的化學(xué)成分研究.藥學(xué)學(xué)報，2013，48(2)：276-280)。異長春花苷內(nèi)酰胺在膽木中含量豐富，易于分離，其的分子式為C₂₆H₃₀N₂O₈，分子量為498.52，CAS登錄號為23141-25-5。

目前的專利報道中，異長春花苷內(nèi)酰胺主要有以下應(yīng)用：(1)異長春花苷內(nèi)酰胺在制備抗皮膚色素沉著藥物中的應(yīng)用(CN103585167A)，(2)異長春花苷內(nèi)酰胺制備治療咳嗽和哮喘藥物中的用途(CN102600197A)，(3)含有異長春花苷內(nèi)酰胺等成分的組合制劑在制備清熱解毒、消腫止痛藥物方面的用途(CN102600269A)等；但目前尚無異長春花苷內(nèi)酰胺在抗炎方面應(yīng)用的報道。

抗炎藥物一般是通過調(diào)節(jié)對炎癥具有重要作用的促炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)和炎癥介質(zhì)的水平，從而發(fā)揮其抗炎作用。關(guān)于抗炎機制方面的研究，文獻對很多信號通路在炎癥方面的作用進行了描述(Guha M，Mackman N.LPS induction of gene expression in human monocytes.Cell Signal.2001，13：85-94)，其中，核因子-κB(NF-κB)與絲裂原激活的蛋白激酶 (MAPK)通路是與炎癥相關(guān)的兩條重要通路。研究表明，NF-κB主要是通過IκB激酶(IKK)介導(dǎo)的IκB-α的磷酸化與降解而激活的；在MAPK信號通路中，ERK、JNK和p38被認為是抗炎藥物作用的重要靶點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供異長春花苷內(nèi)酰胺在制備抗炎藥物中的醫(yī)藥用途。

本發(fā)明的第一方面，發(fā)明人研究了異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞中炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平以及IL-1β和TNF-αmRNA表達的影響，從而研究了異長春花苷內(nèi)酰胺的抗炎活性。

本發(fā)明的第二方面，發(fā)明人研究了異長春花苷內(nèi)酰胺在LPS刺激的RAW 264.7細胞中發(fā)揮抗炎作用的分子機制。異長春花苷內(nèi)酰胺經(jīng)LPS刺激的RAW 264.7細胞體外實驗，發(fā)現(xiàn)該化合物可以抑制NF-κB信號通路中IKKα、IκB-α和p65的磷酸化；同時，也能夠抑制MAPK信號通路中ERK、JNK和p38的磷酸化。

實驗結(jié)果表明，本發(fā)明中的化合物異長春花苷內(nèi)酰胺能夠顯著地抑制IL-1β和TNF-α水平及其mRNA的表達，對炎癥有明顯的抑制作用，因此可以用于制備抗炎藥物。此外，抗炎機制研究表明，異長春花苷內(nèi)酰胺能夠抑制LPS刺激的RAW 264.7細胞中的NF-κB和MAPK信號通路。

附圖說明

圖1是異長春花苷內(nèi)酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

圖2是異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞活力的影響；

圖3是異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞中炎癥因子水平的影響，其中A是異長春花苷內(nèi)酰胺對IL-1β水平的影響，B是異長春花苷內(nèi)酰胺對TNF-α水平的影響；

圖4是異長春花苷內(nèi)酰胺對IL-1β和TNF-αmRNA表達的影響，其中A是異長春花苷內(nèi)酰胺對IL-1βmRNA水平的影響，B是異長春花苷內(nèi)酰胺對TNF-αmRNA水平的影響；

圖5是異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞中NF-κB信號通路的抑制作用。其中A是異長春花苷內(nèi)酰胺對IκB磷酸化的的影響，B是異長春花苷內(nèi)酰胺對p65磷酸化的影響，C是異長春花苷內(nèi)酰胺對IKKα磷酸化的影響；

圖6是異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞中MAPK信號通路的抑制作用。其中A是異長春花苷內(nèi)酰對ERK磷酸化的影響，B是異長春花苷內(nèi)酰胺對JNK磷酸化的影響，C是異長春花苷內(nèi)酰胺對p38磷酸化的影響。

具體實施方式

現(xiàn)結(jié)合實施例和附圖，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻方法制備。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例：異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞中炎癥具有良好的抑制作用。

(一)細胞培養(yǎng)

小鼠RAW 264.7巨噬細胞，購自中科院上海細胞庫。在37℃，5％CO₂條件下，用含10％HyClone胎牛血清、100U/mL青霉素及100mg/mL鏈霉素的DMEM不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.5％胰酶消化傳代。所有操作均為無菌操作。

(二)細胞活力實驗

RAW 264.7細胞接種于96孔板中(4×10⁶個/mL)，每組六個復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細胞貼壁后，用PBS洗滌細胞一遍，對照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的異長春花苷內(nèi)酰胺溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，加20μL 5mg/mL MTT培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞一遍，加150μL DMSO，微波震蕩15min，用酶標儀檢測570nm和490nm處的OD值。細胞活力＝[(OD₅₇₀-OD₄₉₀)_sanple/(OD₅₇₀-OD₄₉₀)_control]×100％。

結(jié)果如圖1所示，25、50、100和200μM濃度的異長春花苷內(nèi)酰胺對細胞活性的影響與對照組和誘導(dǎo)組相比無明顯差異(P＞0.05)；表明濃度為25～200μM異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞沒有顯著的細胞毒性。

(三)異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞中IL-1β產(chǎn)生的影響

本實驗通過ELISA試劑盒檢測異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞產(chǎn)生IL-1β的影響。將RAW 264.7細胞接種于96孔板中(4×10⁶個/mL)，每組六個復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細胞貼壁后，用PBS洗滌細胞一遍，對照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的異長春花苷內(nèi)酰胺溶液和含1μg/mLLPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，吸50μL上清液，根據(jù)ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)的操作說明書進行操作，檢測IL-1β含量。

結(jié)果如圖2A所示，LPS誘導(dǎo)組的IL-1β水平顯著高于空白對照組(P＜0.001)；25、50、100和200μM異長春花苷內(nèi)酰胺組的IL-1β水平與誘導(dǎo)組相比，有顯著差異(P＜0.01)，25μM水平的異長春花苷內(nèi)酰胺能夠?qū)L-1β的產(chǎn)量降至15.00±2.86pg/mL(P＜0.01)。上述結(jié)果表明異長春花苷內(nèi)酰胺顯著地且呈劑量依賴性的抑制LPS刺激的RAW 264.7小鼠巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β。

(四)異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞中TNF-α產(chǎn)生的影響

本實驗通過ELISA試劑盒檢測異長春花苷內(nèi)酰胺對LPS刺激的RAW 264.7細胞產(chǎn)生TNF-α的影響。RAW 264.7細胞接種于96孔板中(4×10⁶個/mL)，每組六個復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細胞貼壁后，用PBS洗滌細胞一遍，對照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的異長春花苷內(nèi)酰胺溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，吸50μL上清液，根據(jù)ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)的操作說明書進行操作，檢測TNF-α含量。

實驗結(jié)果如圖2B所示，LPS誘導(dǎo)組的TNF-α水平顯著高于空白對照組(P＜0.001)；25、50、100和200μM異長春花苷內(nèi)酰胺給藥組的TNF-α水平與誘導(dǎo)組相比，有顯著差異(P＜0.001)，且該化合物對LPS刺激的RAW264.7細胞中TNF-α生成的抑制作用呈劑量依 賴性，25μM水平的異長春花苷內(nèi)酰胺能夠?qū)NF-α的水平降至2370.34±22.28pg/mL(P＜0.001)。上述結(jié)果表明異長春花苷內(nèi)酰胺能顯著抑制LPS刺激的RAW264.7細胞產(chǎn)生TNF-α。

(五)異長春花苷內(nèi)酰胺對IL-1βmRNA表達的影響

本實驗使用Trizol試劑提取對照組、誘導(dǎo)組和異長春花苷內(nèi)酰胺給藥組的RAW 264.7細胞產(chǎn)生的IL-1βmRNA，利用RT-PCR確定mRNA的相對含量。RAW 264.7細胞接種于96孔板中(4×10⁶個/mL)，每組六個復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細胞貼壁后，用PBS洗滌細胞一遍，對照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的異長春花苷內(nèi)酰胺溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，根據(jù)Trizol試劑供應(yīng)商(美國Invitrogen公司)提供的方法提取RNA，并測定在260nm和280nm的吸收值，確定RNA的濃度和純度；隨后，利用RT-PCR擴增RNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCt法計算IL-1βmRNA的相對表達量。

實驗結(jié)果如圖3A所示，結(jié)果表明，25～200μM水平的異長春花苷內(nèi)酰胺能夠顯著抑制IL-1βmRNA的表達(P＜0.001)，并且抑制作用呈劑量依賴性；當(dāng)異長春花苷內(nèi)酰胺的濃度達到200μM時，與LPS誘導(dǎo)組相比，IL-1βmRNA的表達被抑制了80.59％。

(六)異長春花苷內(nèi)酰胺對TNF-αmRNA表達的影響

本實驗使用Trizol試劑提取對照組、誘導(dǎo)組和異長春花苷內(nèi)酰胺給藥組的RAW 264.7細胞產(chǎn)生的TNF-αmRNA，利用RT-PCR確定mRNA的相對含量。RAW 264.7細胞接種于96孔板中(4×10⁶個/mL)，每組六個復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細胞貼壁后，用PBS洗滌細胞一遍，對照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的異長春花苷內(nèi)酰胺溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，根據(jù)Trizol試劑供應(yīng)商(美國Invitrogen公司)提供的方法提取RNA，并測定在260nm和280nm的吸收值，確定RNA的濃度和純度；隨后，利用RT-PCR擴增RNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCt法計算TNF-αmRNA的相對表達量。

實驗結(jié)果如圖3B所示，結(jié)果表明，25～200μM水平的異長春花苷內(nèi)酰胺能夠顯著抑制TNF-αmRNA的表達(P＜0.001)，并且抑制作用呈劑量依賴性；當(dāng)異長春花苷內(nèi)酰胺 的濃度達到200μM時，與LPS誘導(dǎo)組相比，TNF-αmRNA的表達也被抑制了80.59％。

(七)異長春花苷內(nèi)酰胺對NF-κB通路的抑制作用

RAW 264.7細胞接種于96孔板中(4×10⁶個/mL)，每組六個復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細胞貼壁后，用PBS洗滌細胞一遍，對照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的異長春花苷內(nèi)酰胺溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，胰酶消化，于冷PBS中洗滌2遍，各加入200ul冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30min，每隔5min渦旋震蕩10s，充分裂解，4℃離心10min，上清液分裝，存于-70℃保存，待檢測。利用Western blot法，以GAPDH為內(nèi)參，計算IκBα、p-IκBα、IKKα、p-IKKα、p65、p-p65的相對表達量。

實驗結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，異長春花苷內(nèi)酰胺能夠顯著地降低LPS-刺激的RAW264.7細胞中p-IκBα、p-IKKα和p-p65的表達，并且抑制作用呈劑量依賴性；當(dāng)異長春花苷內(nèi)酰胺的濃度達到200μM時，p-p65/p65比值下降至0.43±0.05，與空白對照組接近。

(八)異長春花苷內(nèi)酰胺對MAPK通路的抑制作用

RAW 264.7細胞接種于96孔板中(4×10⁶個/mL)，每組六個復(fù)孔，每孔含200μL不完全高糖DMEM培養(yǎng)基。細胞貼壁后，用PBS洗滌細胞一遍，對照組加入不完全高糖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，給藥組加入25、50、100和200μM的異長春花苷內(nèi)酰胺溶液和含1μg/mL LPS的不完全高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)24h后，胰酶消化，于冷PBS中洗滌2遍，各加入200uL冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30min，每隔5min渦旋震蕩10s，充分裂解，4℃離心10min，上清液分裝，存于-70℃保存，待檢測。利用Western blot法，以GAPDH為內(nèi)參，計算ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38的相對表達量。

實驗結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，異長春花苷內(nèi)酰胺能夠顯著地降低LPS-刺激的RAW 264.7細胞中p-ERK、p-JNK和p-p38的表達，并且抑制作用呈劑量依賴性；當(dāng)異長春花苷內(nèi)酰胺的濃度達到200μM水平時，對ERK、JNK和p-38磷酸化的抑制率分別為90.00％、71.69％和75.49％。

上述實驗結(jié)果表明，異長春花苷內(nèi)酰胺可顯著抑制LPS刺激的RAW 264.7細胞中IL-1β和TNF-α的生成，同時也抑制了IL-1β和TNF-αmRNA的表達，這些結(jié)果說明異長春花苷內(nèi)酰胺具有良好的抗炎活性，且無細胞毒性，因此可用于制備抗炎藥物。抗炎機制方面的研究結(jié)果顯示，異長春花苷內(nèi)酰胺能夠抑制RAW 264.7細胞中LPS刺激的NF-κB和MAPK通路的激活。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出其他的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)力要求所限定的范圍。