本發(fā)明涉及藥物組合物，更具體地，涉及一種穩(wěn)定的含有鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽兩種藥效成分的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
鹽酸納美芬是繼納洛酮和納曲酮后合成的新一代純阿片受體拮抗劑，由美國Ivax/Ohmeda公司研發(fā)，于1995年首次被美國FDA批準(zhǔn)上市，上市劑型為注射劑。目前，鹽酸納美芬已成為納洛酮的替代品，與納洛酮和納曲酮相比，其具有作用時間長、口服生物利用度高、用藥劑量小、安全范圍寬等優(yōu)點。鹽酸納美芬臨床用途廣泛，已用于拮抗麻醉性鎮(zhèn)痛劑引起的呼吸抑制、鎮(zhèn)靜和低血壓等癥狀，并應(yīng)用于酒精中毒和海洛因依賴等的治療。
還原型谷胱甘肽，商品名稱為阿拓莫蘭，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，含巰基，通過巰基和體內(nèi)自由基結(jié)合，可以轉(zhuǎn)化為容易代謝的酸性物質(zhì)，從而促進(jìn)自由基的排泄。急性重癥酒精中毒患者體內(nèi)酒精經(jīng)代謝后產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致體內(nèi)還原型谷胱甘肽減少，氧化型谷胱甘肽增加，及時補充還原型谷胱甘肽，清除自由基，清除酒精，是阿拓莫蘭治療急性重癥酒精中毒的主要作用機(jī)制。
目前，已有報道在急性重度酒精中毒的常規(guī)治療基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽具有協(xié)同作用，能夠縮短患者的意識清醒時間和癥狀消失時間，并減輕其它臨床癥狀，但是，尚沒有兩種藥物劑量配比和療效之間的關(guān)系研究，市場上也沒有將此兩種藥物成分制備成的復(fù)方制劑，這將導(dǎo)致臨床應(yīng)用時藥物劑量不可調(diào)控，并且每次使用均需要現(xiàn)用現(xiàn)配，十分不便。
但是，鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽的復(fù)方制劑并不容易制得，本發(fā)明申請人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩種藥物制備成復(fù)方制劑時，相關(guān)雜質(zhì)較單方制劑時增長更多，制劑的穩(wěn)定性較差，故而找到一種有效的技術(shù)手段對相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行控制對保證產(chǎn)品療效和安全性是十分必要的。
因此，迫切需要一種含有鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽的穩(wěn)定的藥物組合物以滿足臨床急救應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定的含有鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物中，含有兩種藥效成分，分別為鹽酸納美芬0.06mg/ml～0.2mg/ml、還原型谷胱甘肽50mg/ml～100mg/ml，另外還含有門冬氨酸0.01 mg/ml ~0.05mg/ml，并且所述藥物組合物的pH為3.0-4.6。
優(yōu)選藥物組合物包含鹽酸納美芬0.1mg/ml、還原型谷胱甘肽80mg/ml。
優(yōu)選藥物組合物的pH為3.8-4.2。
本發(fā)明還提供了一種具體的含有鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽的藥物組合物，所述藥物組合物的組成為：
。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種所述藥物組合物的制備方法：在充氮條件下，取鹽酸納美芬加入全量 20％的注射用水， 攪拌至完全溶解， 加入門冬氨酸攪拌使溶解；取還原型谷胱甘肽加入全量50％的注射用水，攪拌使溶解，兩者混合，再加入剩余30％的注射用水，混勻，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，另加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，用 0.22μm濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
本發(fā)明申請人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩種藥效成分，即鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽的重量比在1: 1667～1: 250的范圍內(nèi)時，兩者的協(xié)同作用最強，療效最好，尤其當(dāng)兩者的重量比為1: 800時，藥理實驗中急性重度酒精中毒小鼠中毒持續(xù)時間最短，癥狀改善最為明顯，配制成注射液時，具體含量則為鹽酸納美芬0.06mg/ml～0.2mg/ml、還原型谷胱甘肽50mg/ml～100mg/ml，優(yōu)選鹽酸納美芬0.1mg/ml、還原型谷胱甘肽80mg/ml。然而，由于上述兩種藥效成分穩(wěn)定性均較差，例如鹽酸納美芬中的酚羥基容易氧化變成雙納美芬，還原型谷胱甘肽中的巰基為活性極端，除了容易被氧化以外，還容易和其他藥物反應(yīng)，因此當(dāng)將鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽制備成復(fù)方注射液時，本申請人發(fā)現(xiàn)，其雜質(zhì)雙納美芬（以下稱為雜質(zhì)A）和氧化型谷胱甘肽（以下稱為雜質(zhì)B）的含量均比單方制劑時更高，為1.4%和1.7%（單方制劑時約為0.8%和1.1%），產(chǎn)品穩(wěn)定性差，極大地影響了產(chǎn)品的安全性。
為了克服上述技術(shù)問題，本發(fā)明申請人曾試圖在注射液中添加抗氧劑如亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、維生素C、叔丁基羥基茴香醚等；或者添加螯合劑如乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸四鈉等；或者添加緩沖液如檸檬酸-檸檬酸鈉等；或者在注射液制備過程中控制在線沖氮的程度和效果，但收效甚微，仍然難以將雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均控制在1.0%以下。
本發(fā)明申請人經(jīng)過大量實驗研究意外地發(fā)現(xiàn)，門冬氨酸對于鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽復(fù)方注射液具有極好的穩(wěn)定作用，特別是當(dāng)門冬氨酸的量在0.01 mg/ml ~0.05mg/ml范圍，并且同時注射液的PH值為3.0-4.6時，能夠大幅降低產(chǎn)品雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的含量，將其均控制在0.5%以下；此外，經(jīng)HPLC分析，注射液中，雜質(zhì)B的含量往往較高，達(dá)到0.44%，但當(dāng)注射液的PH值為3.8-4.2時，其值則可控制在0.2%以下，優(yōu)選本發(fā)明所述組合物的PH為3.8-4.2。
本發(fā)明還提供了一種具體的含有鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽的藥物組合物，所述藥物組合物的組成為：鹽酸納美芬（以納美芬計）0.5mg，還原型谷胱甘肽400mg，門冬氨酸0.25mg，PH調(diào)節(jié)劑（鹽酸或氫氧化鈉）適量調(diào)至PH為4.0，注射用水5ml，該組成制備的注射液其雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均控制在最低水平。
本發(fā)明還提供了一種具體的所述藥物組合物的制備方法：在充氮條件下，取鹽酸納美芬加入全量 20％的注射用水，攪拌至完全溶解，加入門冬氨酸攪拌使溶解；取還原型谷胱甘肽加入全量50％的注射用水，攪拌使溶解，兩者混合，再加入剩余30％的注射用水，混勻，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，另加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，用 0.22μm濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。相較于其他制備方法，該方法采用了特定的配制比例和順序，能夠最大限度的發(fā)揮門冬氨酸的穩(wěn)定性作用，在保證產(chǎn)品雜質(zhì)A和雜質(zhì)B控制在最低水平的前提下，其加入的門冬氨酸劑量最小，穩(wěn)定效果最好。
本發(fā)明所述雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的含量，是通過高效液相色譜法進(jìn)行檢測，具體方法如下。
【雜質(zhì)A】取本品，作為供試品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；取鹽酸納美芬對照品適量，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中含0.2mg的溶液，取10ml，置25ml量瓶中，加0.4%三氯化鐵溶液1ml，置水浴中加熱10分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。照高效液相色譜法（中國藥典2015年版四部 通則0512）試驗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Kromasil C18, 4.6mm×250mm,5μm 或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉7.8g，加水適量使溶解，加三乙胺2ml，加水至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.2)-乙腈（80:20）為流動相，流速為1.0ml/min；檢測波長為210nm；柱溫為30℃。取系統(tǒng)適用性溶液10μl注人液相色譜儀，調(diào)節(jié)流動相比例使納美芬峰保留時間約為7分鐘，雙納美芬（雜質(zhì)A）峰相對納美芬峰的保留時間約為1.6。精密量取供試品溶液、對照溶液各10μl，分別注人液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍。供試品溶液色譜圖中如有與雙納美芬(雜質(zhì)A，校正因子為2.0)保留時間一致的色譜峰，按下式計算雜質(zhì)A的含量：
雜質(zhì)A（%）=（A雜質(zhì)A×f/A對）×1.0%
式中，A雜質(zhì)A為供試品溶液色譜圖中雙納美芬峰面積；
A對為對照溶液色譜圖中納美芬峰面積；
f為雙納美芬的校正因子。
【雜質(zhì)B】臨用新配。精密量取本品適量,置棕色量瓶中，用水定量稀釋制成每1ml中約還原型谷胱甘肽0.5mg的溶液，作為供試品溶液。精密稱取氧化型谷胱甘肽對照品適量，置50ml棕色量瓶中，加供試品溶液10ml，搖勻，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密稱取氧化型谷胱甘肽對照品適量，置棕色量瓶中，加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含2.5μg的溶液，作為氧化型谷胱甘肽對照品溶液。照高效液相色譜法（中國藥典2015年版四部 通則0512）試驗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Kromasil C18, 4.6mm×250mm,5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉7.8g，加水適量使溶解，加三乙胺2ml，加水至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.2)為流動相A，乙腈為流動相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0ml/min；檢測波長為210nm；柱溫為30℃。取系統(tǒng)適用性溶液10μl注人液相色譜儀，還原型谷胱甘肽峰與氧化型谷胱甘肽峰之間的分離度應(yīng)大于3.0。精密量取供試品溶液和氧化型谷胱甘肽對照品溶液各10μl，分別注人液相色譜儀，記錄色譜圖。并按下式計算氧化型谷胱甘肽（雜質(zhì)B）的量。
雜質(zhì)B（%）=（C氧化型谷胱甘肽對照品×AS氧化型谷胱甘肽×V）/（Ar氧化型谷胱甘肽）×100mg/ml) ×100%
式中，C氧化型谷胱甘肽對照品為氧化型谷胱甘肽對照品溶液的濃度；
AS氧化型谷胱甘肽為氧化型谷胱甘肽對照品溶液色譜圖中主峰面積；
Ar氧化型谷胱甘肽為供試品溶液色譜圖中氧化型谷胱甘肽峰面積；
V為氧化型谷胱甘肽對照品溶液的體積。
對比例
對比例1
整個制備過程中采用沖氮工藝。取80%處方量注射用水，加入處方全量的鹽酸納美芬，攪拌使其溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)溶解PH至3.5，補加剩余的注射用水至全量，加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，0.22um微孔濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
對比例2
整個制備過程中采用沖氮工藝。取80%處方量注射用水，加入處方全量的還原型谷胱甘肽，攪拌使其溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)溶解PH至3.5，補加剩余的注射用水至全量，加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，0.22um微孔濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
對比例3
整個制備過程中采用沖氮工藝。取80%處方量注射用水，加入處方全量的鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽，攪拌使其溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)溶解PH至3.5，補加剩余的注射用水至全量，加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，0.22um微孔濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
對比例4
整個制備過程中采用沖氮工藝。取80%處方量注射用水，加入處方全量的鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽，攪拌使其溶解，然后加入焦亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)溶解PH至3.5，補加剩余的注射用水至全量，加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，0.22um微孔濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
對比例5
整個制備過程中采用沖氮工藝。取80%處方量注射用水，加入處方全量的鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽，攪拌使其溶解，然后加入焦亞硫酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉，攪拌使其溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)溶解PH至3.5，補加剩余的注射用水至全量，加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，0.22um微孔濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
對比例6
整個制備過程中采用沖氮工藝。取80%處方量注射用水，加入處方量的檸檬酸和檸檬酸鈉，攪拌使其溶解，然后加入處方全量的鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽，攪拌使其溶解，最后加入亞硫酸氫鈉和乙二胺四乙酸二鈉，攪拌使其溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)溶解PH至3.5，補加剩余的注射用水至全量，加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，0.22um微孔濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
對比例7
整個制備過程中采用沖氮工藝。取80%處方量注射用水，加入處方全量的鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽，攪拌使其溶解，然后加入門冬氨酸，攪拌使其溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)溶解PH至3.5，補加剩余的注射用水至全量，加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，0.22um微孔濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
對比例8
按對比例7所述制備方法制備復(fù)方注射液。
對比例9
按對比例7所述制備方法制備復(fù)方注射液。
對比例10
按對比例7所述制備方法制備復(fù)方注射液。
對比例11
按對比例7所述制備方法制備復(fù)方注射液。
按對比例1～11制備的復(fù)方注射液，檢測0天雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的含量，其檢測結(jié)果見下表。
。
結(jié)果表明，對比例1～3中，鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽制備成復(fù)方注射液時，產(chǎn)品穩(wěn)定性較差，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均高達(dá)1.5%左右，而單方制劑雜質(zhì)A和B僅有0.8%和1.1%。雖然對比例4～6分別在注射液中加入了抗氧劑、金屬離子螯合劑以及緩沖液等，但對于穩(wěn)定性的提高效果并不顯著，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均在1.2%左右，而對比例7在復(fù)方注射液中加入門冬氨酸后，產(chǎn)品的穩(wěn)定性大大提高，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均有一定程度的降低，直至對比例8將門冬氨酸的用量提高至0.01mg/ml時，其雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的含量均可降低至0.5%以下。
令人驚訝的是，門冬氨酸的這種穩(wěn)定作用還與復(fù)方注射液的PH值有關(guān)，例如在對比例9中，當(dāng)將注射液的PH調(diào)整至4.9時，其發(fā)揮的穩(wěn)定作用則不如在PH為3.5時，經(jīng)過一系列實驗，最終確定PH為3.0-4.6時，門冬氨酸的穩(wěn)定性效果最好。
此外，另一項驚人的發(fā)現(xiàn)是，門冬氨酸的穩(wěn)定效果與其用量并不一直呈現(xiàn)正比關(guān)系，例如對比例10（門冬氨酸用量為0.05mg/ml）與對比例11（門冬氨酸用量為0.08mg/ml）的穩(wěn)定性效果相差不大，適宜的門冬氨酸的濃度應(yīng)為0.01 mg/ml～0.05mg/ml。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實施例僅限于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的保護(hù)范圍的進(jìn)一步限定。
實驗方法
昆明種小鼠50只，體重（21±2）g，雌雄各半。所有小鼠按8ml/kg腹腔注射60%的乙醇，制備小鼠乙醇中毒模型。模型制備成功后，將小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。比較例1組，將注射用還原型谷胱甘肽(0.1g)用1.2ml注射用水溶液配制成80mg/ml，以及納美芬注射液（0.1mg/ml）；實施例2-4組，為不同劑量配比的納美芬和還原型谷胱甘肽復(fù)方注射液。待翻正反射消失后，各組分別腹腔注射上述藥物，模型組動物則給于等體積的生理鹽水，劑量均按0.6ml/kg腹腔注射給予。然后記錄小鼠中毒時間t1（以翻正反射消失為準(zhǔn)）、中毒消失時間t2（以翻正反射恢復(fù)為準(zhǔn)），t2-t1即中毒持續(xù)時間，對比不同組別的中毒持續(xù)時間，以觀察其對急性乙醇中毒的催醒作用。
實施例
比較例1
鹽酸納美芬注射液，規(guī)格1ml:0.1mg，成都天臺山制藥有限公司；
注射用還原型谷胱甘肽，規(guī)格0.1g，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司。
實施例2
整個制備過程中采用沖氮工藝。取80%處方量注射用水，加入處方全量的鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽，攪拌使其溶解，然后加入門冬氨酸，攪拌使其溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)溶解PH至4.0，補加剩余的注射用水至全量，加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，0.22um微孔濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
實施例3
按實施例2所述制備方法制備復(fù)方注射液。
實施例4
按實施例2所述制備方法制備復(fù)方注射液。
各組小鼠中毒持續(xù)時間結(jié)果見下表。
鹽酸納美芬及還原型谷胱甘肽復(fù)方對急性重度酒精中毒小鼠中毒持續(xù)時間比較
*，與模型組相比，p<0.05 ； **與模型組相比，p<0.01
從結(jié)果分析，當(dāng)鹽酸納美芬0.06mg/ml～0.2mg/ml、還原型谷胱甘肽50mg/ml～100mg/ml，并搭配0.01mg/ml ~0.05mg/ml門冬氨酸時，兩種有效成分的協(xié)同作用更強，小鼠的中毒持續(xù)時間更短，尤其是當(dāng)鹽酸納美芬0.1mg/ml、還原型谷胱甘肽80mg/ml時，協(xié)同作用最強，療效最為顯著。
實施例5
按實施例2所述制備方法制備復(fù)方注射液。
實施例6
按實施例2所述制備方法制備復(fù)方注射液。
實施例7
按實施例2所述制備方法制備復(fù)方注射液。
實施例8
按實施例2所述制備方法制備復(fù)方注射液。
實施例9
按實施例2所述制備方法制備復(fù)方注射液。
實施例10
按實施例2所述制備方法制備復(fù)方注射液。
實施例11
藥物組合物成分如實施例4；
在充氮條件下，取門冬氨酸加入全量20％的注射用水，攪拌至完全溶解，取鹽酸納美芬和還原型谷胱甘肽加入全量60％的注射用水，攪拌使溶解，兩者混合，再加入剩余20％的注射用水，混勻，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，另加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，用 0.22μm濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
實施例12
藥物組合物成分如實施例4；
在充氮條件下，取鹽酸納美芬加入全量 20％的注射用水，攪拌至完全溶解，加入門冬氨酸攪拌使溶解；取還原型谷胱甘肽加入全量50％的注射用水，攪拌使溶解，兩者混合，再加入剩余30％的注射用水，混勻，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，另加入處方量 0.05％ (w/v)的活性炭，在 60℃保溫攪拌吸附 30min，粗濾，脫炭，用 0.22μm濾膜過濾后分裝，充氮，封口，于 121℃下熱壓滅菌12min。
按實施例2～12制備的復(fù)方注射液，檢測0天單雜氧化型谷胱甘肽以及總雜的含量，其檢測結(jié)果見下表。
。