本發(fā)明屬于醫(yī)藥材料領(lǐng)域，涉及一種抗癌藥物的高分子前藥及其應(yīng)用；具體涉及一種透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥、其制備方法與在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的主要?dú)⑹郑浒l(fā)病率和死亡率正呈逐年上升的趨勢(shì)。目前腫瘤治療方法主要包括外科手術(shù)切除、輻射治療和化療。這些治療手段存在明顯的不足：治療過(guò)程中會(huì)對(duì)機(jī)體正常組織造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，給患者帶來(lái)極大的痛苦。在過(guò)去幾十年中，高分子前藥從被提出已發(fā)展為一種被科學(xué)家們廣泛認(rèn)可的能夠有效用于腫瘤治療的納米藥物，它作為一種高效的藥物傳輸系統(tǒng)，能夠有效地減少化學(xué)藥物暴露于血液及正常組織，并且最終將藥物運(yùn)輸至腫瘤部位從而極大地提高抗癌藥物的治療效率。理論上它具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：增強(qiáng)了藥物的水溶性；EPR效應(yīng)使得病灶部位的藥物濃度極大的提高，進(jìn)而提高藥物的生物利用度；血液循環(huán)過(guò)程中足夠的穩(wěn)定，降低非特異性的釋藥行為；載藥量很大水平的提高并且可控，同時(shí)不容易出現(xiàn)暴釋。值得注意的是，目前已經(jīng)有許多的高分子前藥進(jìn)入到不同階段的臨床試驗(yàn)，如聚谷氨酸衍生化的紫杉醇（Xyotax，Opaxio）以及聚甲基丙烯酸羥丙酯衍生化的多柔比星（PK1，PK2）等。但是，上述高分子前藥由于缺乏對(duì)腫瘤的特異性選擇以及抗癌藥物的釋放過(guò)慢，其治療效果并不如人意，導(dǎo)致無(wú)法臨床應(yīng)用。一些具有優(yōu)異的腫瘤選擇性的抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）如Kadcyla和Adcetrics，已獲得美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床的應(yīng)用。然而抗體藥物偶聯(lián)物進(jìn)一步市場(chǎng)化遭遇到了一些根本性的挑戰(zhàn)，如很難達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)，成本過(guò)高，潛在的免疫反應(yīng)以及抗癌藥物含量過(guò)低等。美登素是一強(qiáng)效的微管蛋白抑制劑。曲妥珠單抗-美登素抗體偶聯(lián)物（T-DM1）在2013年已獲得FDA批準(zhǔn)用于晚期HER2陽(yáng)性乳腺癌的治療，但是除了生產(chǎn)和成本問(wèn)題外，T-DM1也可能導(dǎo)致一些不良反應(yīng)如惡心、肌肉骨骼疼痛、肝毒性、心臟損害和間質(zhì)性肺疾病。因此，開(kāi)發(fā)具有腫瘤靶向性、能在腫瘤部位快速釋放抗癌藥物，并且具有良好生物相容性的高分子前藥很有意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是，提供一種透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥、其制備方法與在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體的技術(shù)方案為：

一種透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），包括透明質(zhì)酸主鏈、美登素側(cè)鏈；所述美登素與透明質(zhì)酸之間通過(guò)二硫鍵連接；其主鏈為透明質(zhì)酸（HA），側(cè)鏈為美登素抗癌藥物；且美登素與透明質(zhì)酸之間通過(guò)具有還原響應(yīng)性的二硫鍵連接。HA-SS-DM1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式是：

本發(fā)明透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥中，所述透明質(zhì)酸的分子量為7~500 kDa；以質(zhì)量計(jì)，前藥中美登素含量為10%～50%。

上述透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥可以通過(guò)兩步反應(yīng)得到：透明質(zhì)酸與氨基二吡啶鹽酸鹽酰胺化反應(yīng)得到二硫吡啶官能化的透明質(zhì)酸；然后二硫吡啶官能化的透明質(zhì)酸與巰基官能化的美登素反應(yīng)得到透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥；具體為首先透明質(zhì)酸（HA）與氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）在4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）催化下通過(guò)酰胺化反應(yīng)得到不同取代度的雙硫吡啶官能化的透明質(zhì)酸，然后與巰基官能化的美登素（DM1）在冰醋酸催化下通過(guò)巰基-二硫交換反應(yīng)得到不同載藥量的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），更具體為透明質(zhì)酸水溶液中加入氨基二吡啶鹽酸鹽，在pH為6.5下，30~35℃下，酰胺化反應(yīng)20~25小時(shí)，然后透析、凍干得到二硫吡啶官能化的透明質(zhì)酸；然后將巰基官能化的美登素的二甲亞砜溶液加入二硫吡啶官能化的透明質(zhì)酸的二次水溶液中，30~35℃下，反應(yīng)45~55小時(shí)，然后透析、凍干得到透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥。本發(fā)明的兩步反應(yīng)均在很溫和的條件中進(jìn)行，既保持了藥性，又避免了反應(yīng)條件的苛刻，具有很高的載藥量（50%），同時(shí)不影響透明質(zhì)酸的水溶性以及主動(dòng)靶向性，避免了潛在的免疫反應(yīng)。

本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥具有兩親性，在水溶液中能夠自組裝形成納米藥物，外層親水層由透明質(zhì)酸構(gòu)成，內(nèi)層疏水層由疏水藥物美登素構(gòu)成。因此本發(fā)明還公開(kāi)了由上述透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥自組裝制備的納米藥物；通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得該高分子前藥組裝的納米藥物在不同濃度下粒徑為10-200納米之間。

本發(fā)明中，高分子前藥的親水外殼透明質(zhì)酸，作為一種可生物降解，具有良好生物相容性和生物活性的天然材料，對(duì)許多CD44受體過(guò)度表達(dá)的惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等具有很輕的親和力，從而該高分子前藥能夠很好的通過(guò)CD44受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。美登素通過(guò)可還原斷裂的二硫鍵連接到透明質(zhì)酸側(cè)鏈中，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有很高的還原勢(shì)能（谷胱甘肽濃度：2~10 mM），二硫鍵能夠快速斷裂，抗癌藥物迅速釋放出來(lái)，進(jìn)而高效殺死癌細(xì)胞。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述高分子前藥HA-SS-DM1在制備抗腫瘤納米藥物中的應(yīng)用；所述腫瘤優(yōu)選為細(xì)胞表面CD44受體過(guò)量表達(dá)的腫瘤。

由于上述方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1. 本發(fā)明公開(kāi)的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥在很溫和的條件中兩步即可合成，其整個(gè)合成步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，既保持了藥性，又避免了反應(yīng)條件的苛刻，有很好的重現(xiàn)性。

2. 本發(fā)明公開(kāi)的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥中美登素通過(guò)二硫鍵與透明質(zhì)酸連接，能夠自組裝形成納米藥物，在體內(nèi)循環(huán)能夠保持很好的穩(wěn)定性；當(dāng)?shù)竭_(dá)腫瘤環(huán)境后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高濃度的谷胱甘肽促使美登素快速地釋放出來(lái)，同時(shí)能夠完整的保留原有的美登素的分子結(jié)構(gòu)，很好地保留藥物的抗腫瘤活性。

3. 本發(fā)明公開(kāi)的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥與目前很多進(jìn)入臨床試驗(yàn)的高分子前藥（Xyotax，Opaxio，PK1，PK2）相比，前藥外層親水層為透明質(zhì)酸，其對(duì)許多CD44受體過(guò)度表達(dá)的惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌和卵巢癌等具有很好的特異性主動(dòng)靶向，能夠有效克服現(xiàn)有高分子前藥細(xì)胞攝取能力低等問(wèn)題。

4.本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥能夠大量的合成，具有很高的載藥量（50%），同時(shí)不影響透明質(zhì)酸的水溶性以及主動(dòng)靶向性，避免了潛在的免疫反應(yīng)；解決了現(xiàn)有抗體藥物偶聯(lián)物很難達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)、成本過(guò)高、具有潛在的免疫反應(yīng)以及抗癌藥物含量過(guò)低的問(wèn)題。

5. 本發(fā)明公開(kāi)的該透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥，與自由美登素抗癌藥物相比，能夠很大程度提高抗癌藥物的最大耐藥量；并且無(wú)需另外修飾靶向分子即具有主動(dòng)靶向能力，在腫瘤部位的富集率高，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很高的細(xì)胞毒性，在對(duì)荷腫瘤裸鼠體內(nèi)治療過(guò)程中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)能夠很好的抑制。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1)的合成路線圖；

圖2為實(shí)施例中Cy5標(biāo)記的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (Cy5-HA-SS-DM1)的合成路線圖；

圖3為實(shí)施例一中透明質(zhì)酸-二硫吡啶 (HA-SS-Py) 前藥分子的核磁氫譜圖；

圖4為實(shí)施例一中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 前藥分子的核磁氫譜圖；

圖5為實(shí)施例十中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物粒徑分布圖；

圖6為實(shí)施例十中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物在不同濃度下的藥物粒徑分布圖；

圖7為實(shí)施例十三中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物在谷胱甘肽觸發(fā)下體外釋放結(jié)果圖；

圖8為實(shí)施例十四中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物以及事先經(jīng)自由HA封閉的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞攝取結(jié)果圖；

圖9為實(shí)施例十五中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物、自由美登素（DM1）以及HA封閉的透明質(zhì)酸-二硫-美登素 (HA-SS-DM1) 納米藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果圖；

圖10為實(shí)施例十六中Cy5標(biāo)記的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥納米藥物在小鼠體內(nèi)血液循環(huán)結(jié)果圖；

圖11為實(shí)施例十七中Cy5標(biāo)記的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥納米藥物在荷MCF-7腫瘤裸鼠體內(nèi)的活體成像結(jié)果圖；

圖12為實(shí)施例十八中Cy5標(biāo)記的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥納米藥物在荷MCF-7腫瘤裸鼠各臟器的生物分布結(jié)果圖；

圖13為實(shí)施例十九中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物在正常小鼠體內(nèi)最大耐受量的結(jié)果圖；

圖14為實(shí)施例十九中自由美登素（DM1）在正常小鼠體內(nèi)最大耐受量的結(jié)果圖；

圖15為實(shí)施例二十中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物在荷MCF-7腫瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤體積生長(zhǎng)變化結(jié)果圖；

圖16為實(shí)施例二十中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物在荷MCF-7腫瘤裸鼠治療后腫瘤重量結(jié)果圖；

圖17為實(shí)施例二十中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 納米藥物在荷MCF-7腫瘤裸鼠治療過(guò)程中老鼠體重變化結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

圖1為實(shí)施例中透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (HA-SS-DM1) 前藥的合成路線圖；圖2為實(shí)施例中Cy5標(biāo)記的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥 (Cy5-HA-SS-DM1) 前藥的合成路線圖。

實(shí)施例一 合成透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA =35 kDa，DM1% = 20 wt.%）

首先，于室溫在透明質(zhì)酸（HA）(400 mg, 1.04 mmol 羧基)水溶液（20 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（34.7 mg, 0.156 mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（57.51 mg, 0.208 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為85%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為6%。核磁圖見(jiàn)圖3，¹H NMR (D₂O): 透明質(zhì)酸 (HA): δ (ppm) 1.86-2.01, 3.28-4.02, and 4.21-4.75; 二硫吡啶官能團(tuán) (-SS-Py): δ (ppm) 2.90 (t, 2H), 2.98 (t, 2H), 7.33 (m, 1H), 7.85 (m, 2H), 8.40 (m, 1H)。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于100mL的三口燒瓶中依次加入溶解在8mL二次水中的HA-SS-Py（100 mg, 27.1微摩爾二硫吡啶官能團(tuán)），接著向三口瓶中加入20 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(57.85 mg, 81微摩爾)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入催化量（10μL）的冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），其中美登素載藥量為20 wt.%。核磁圖見(jiàn)圖4，¹H NMR (D₂O & DMSO-d6): 透明質(zhì)酸 (HA): δ (ppm) 1.86-2.01, 3.28-4.02, and 4.21-4.75; 美登素 (DM1): δ (ppm) 5.22-7.24, 0.71-1.52, and 3.25-3.55。

實(shí)施例二 合成透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA =35 kDa，DM1% = 26 wt.%）

首先，于室溫在透明質(zhì)酸（HA）(400 mg, 1.04 mmol 羧基)水溶液（20 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（53 mg, 0.24 mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（86.3 mg, 0.316 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為85%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為8.5%。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于100mL的三口燒瓶中依次加入溶解在8mL二次水中的HA-SS-Py（100 mg, 40.6微摩爾二硫吡啶官能團(tuán)），接著向三口瓶中加入20 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(86.78 mg, 121微摩爾)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入催化量的（10 μL）冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），其中美登素載藥量為26 wt.%。

實(shí)施例三 合成透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA =35 kDa，DM1% = 30 wt.%）

首先，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在透明質(zhì)酸（HA）(400 mg, 1.04 mmol 羧基)水溶液（20 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（70 mg, 0.312 mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（115.01 mg, 0.416 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為85%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為11%。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于100mL的三口燒瓶中加入溶解在8mL二次水中的HA-SS-Py（100 mg, 54.2微摩爾二硫吡啶官能團(tuán)），接著向三口瓶中加入20 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(116 mg, 81微摩爾)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入（10 μL）催化量的冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），其中美登素載藥量為30 wt.%。

實(shí)施例四 合成透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA =35 kDa，DM1% = 10 wt.%）

首先，于室溫在透明質(zhì)酸（HA）(400 mg, 1.04 mmol 羧基)水溶液（20 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（17.3 mg, 0.078 mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（28.95 mg, 0.104 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為86%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為6%。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于100mL的三口燒瓶中依次加入溶解在8mL二次水中的HA-SS-Py（100 mg, 13.5微摩爾二硫吡啶官能團(tuán)），接著向三口瓶中加入20 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(28.93 mg, 40.5微摩爾)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入（10 μL）催化量的冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），其中美登素的載藥量為10 wt.%。

實(shí)施例五 合成透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA =8.9 kDa，DM1% = 10 wt.%）

首先，于室溫在透明質(zhì)酸（HA）(400 mg, 1.04 mmol 羧基)水溶液（20 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（17.3 mg, 0.078 mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（28.85 mg, 0.104 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為80%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為3%。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于100mL的三口燒瓶中依次加入溶解在8mL二次水中的HA-SS-Py（100 mg, 13.5微摩爾二硫吡啶官能團(tuán)），接著向三口瓶中加入20 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(28.96 mg, 40.5微摩爾)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入（10 μL）催化量的冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），其中美登素載藥量為10 wt.%。

實(shí)施例六 合成透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA =20 kDa，DM1% = 20 wt.%）

首先，于室溫在透明質(zhì)酸（HA）(200 mg, 0.52 mmol 羧基)水溶液（10 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（17.35 mg, 0.078 mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（28.95 mg, 0.104 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為82%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為6%。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于100mL的三口燒瓶中依次加入溶解在8mL二次水中的HA-SS-Py（100 mg, 27.1微摩爾二硫吡啶官能團(tuán)），接著向三口瓶中加入20 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(57.85 mg, 81微摩爾)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入（10 μL）催化量的冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），其中美登素的載藥量為20 wt.%。

實(shí)施例七 合成透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA =100 kDa，DM1% = 20 w.t.%）

首先，于室溫在透明質(zhì)酸（HA）(200 mg, 0.52 mmol 羧基)水溶液（30 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（17.35 mg, 0.078 mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（28.95 mg, 0.104 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為84%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為6%。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于100mL的三口燒瓶中依次加入溶解在12 mL二次水中的HA-SS-Py（100 mg），接著向三口瓶中加入20 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(57.85 mg,)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入（10 μL）催化量的冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），其中美登素載藥量為20 wt.%。

實(shí)施例八 合成透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA =300 kDa，DM1% = 20 wt.%）

首先，于室溫在透明質(zhì)酸（HA）(200 mg, 0.52 mmol 羧基)水溶液（40 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（17.35 mg, 0.078 mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（28.95 mg, 0.104 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為89%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為6%。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于100mL的三口燒瓶中依次加入溶解在16 mL二次水中的HA-SS-Py（100 mg），接著向三口瓶中加入20 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(57.85 mg)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入（10 μL）催化量的冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1），其中美登素載藥量為20 wt.%。

實(shí)施例九 合成Cy5標(biāo)記的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（Cy5-HA-SS-DM1）（M_nHA =35 kDa，DM1% = 20 wt.%）

首先，于室溫在透明質(zhì)酸（HA）(60 mg, 0.156 mmol 羧基)水溶液（6 mL）中加入氨基二硫吡啶鹽酸鹽（PDA?HCl）（5.2 mg, 0.0234 mmol）以及Cy5氨基鹽酸鹽（2.65 mg, 0.039mmol）并將整個(gè)溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，隨后向其中加入4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）（10 mg, 0.036 mmol），在35℃攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，透析，凍干得到透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py）。產(chǎn)物產(chǎn)率為84%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為透明質(zhì)酸-二硫吡啶（HA-SS-Py），其中二硫吡啶官能團(tuán)（-SS-Py）的取代度(DS)為6%。紫外-可見(jiàn)測(cè)試結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為Cy5標(biāo)記的透明質(zhì)酸-二硫吡啶（Cy5-HA-SS-Py），其中每條聚合物鏈上大概有一個(gè)Cy5熒光分子。

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于50mL的三口燒瓶中依次加入溶解在5mL二次水中的HA-SS-Py（50 mg），接著向三口瓶中加入18 mL 巰基功能化的美登素（DM1）(57.85 mg)的二甲亞砜溶液，同時(shí)向其中加入（10 μL）催化量的冰醋酸，反應(yīng)器放置在35℃的油浴中，攪拌反應(yīng)48小時(shí)后，依次在水/二甲亞砜（1/3）及水中透析，凍干，產(chǎn)率90%。核磁結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)為Cy5標(biāo)記的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（Cy5-HA-SS-DM1），其中美登素載藥量為20 wt.%。

實(shí)施例十 透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1） (M_nHA = 35kDa，DM1% = 20 wt.%) 納米藥物制備

聚合物HA-SS-DM1納米藥物通過(guò)透析方法制備。具體過(guò)程是：將1.2 mg聚合物HA-SS-DM1 (DM1% = 20 wt.%)溶在2.4 mL水/二甲亞砜混合液（1/1，V/V）中，而后裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中（SPECTRA/POR, MWCO: 3500），用水溶液透析24h。圖5為上述HA-SS-DM1納米藥物粒徑分布；前藥納米藥物平均粒徑為179納米，粒徑分布為0.06。而后將該前藥納米藥物稀釋至不同濃度，圖6為上述HA-SS-DM1納米藥物在不同濃度下的納米藥物粒徑分布；通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得該高分子前藥的粒徑在10-200 nm之間。

實(shí)施例十一 透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1）（M_nHA = 35kDa，DM1% = 26 wt.%）納米藥物制備

聚合物HA-SS-DM1納米藥物通過(guò)透析方法制備。具體過(guò)程是：將1.2 mg聚合物HA-SS-DM1 (DM1% = 26 wt.%)溶在2.4 mL水/二甲亞砜混合液（1/1，V/V）中，而后裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中（SPECTRA/POR, MWCO: 3500），用水溶液透析24h。前藥納米藥物平均粒徑為177納米，粒徑分布為0.06。而后將該前藥納米藥物稀釋至不同濃度，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得該高分子前藥的粒徑在10-200 nm之間。

實(shí)施例十二 透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥（HA-SS-DM1） (M_nHA = 35kDa，DM1% = 30 wt.%) 納米藥物制備

聚合物HA-SS-DM1納米藥物通過(guò)透析方法制備。具體過(guò)程是：將1.2 mg聚合物HA-SS-DM1 (DM1% = 30 wt.%)溶在2.4 mL水/二甲亞砜混合液（1/1，V/V）中，而后裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中（SPECTRA/POR, MWCO: 3500），用水溶液透析24h。前藥納米藥物平均粒徑為184納米，粒徑分布為0.06。而后將該前藥納米藥物稀釋至不同濃度，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得該高分子前藥的粒徑在10-200 nm之間。

實(shí)施例十三 HA-SS-DM1納米藥物在谷胱甘肽觸發(fā)下的體外釋放

把實(shí)施例十制得的HA-SS-DM1前藥納米藥物稀釋10倍，動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得粒徑在10-20 nm之間。依次在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0.5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 24h）取出釋放剩余液，對(duì)釋放剩余液冷凍干燥后進(jìn)行HPLC測(cè)試。具體操作為將這單分子前藥溶液分成兩等份，一組釋放介質(zhì)為還有10mM GSH的PB 緩沖液, 另一組加入等體積的不含GSH 的PB緩沖液（均含0.1%（w/v）吐溫80），而后轉(zhuǎn)移到透析袋中，均浸入30 mL對(duì)應(yīng)的釋放介質(zhì)，置于37℃恒溫?fù)u床（200rpm）中。當(dāng)?shù)礁鱾€(gè)設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取出1 mL的釋放剩余液，冷凍干燥，進(jìn)行HPLC測(cè)試。

圖7為HA-SS-DM1納米藥物在谷胱甘肽（GSH）觸發(fā)下體外釋放結(jié)果圖。結(jié)果表明：HA-SS-DM1納米藥物在10 mM GSH、37℃下，二硫鍵很快發(fā)生斷裂，DM1在2小時(shí)內(nèi)釋放出約60%，24 h內(nèi)則有超過(guò)90%的DM1被釋放出來(lái)；而在無(wú)GSH條件下HA-SS-DM1前藥分子很穩(wěn)定，釋放很少，24 h過(guò)后僅有14%的DM1被釋放出來(lái)。可以說(shuō)明本發(fā)明制備的透明質(zhì)酸衍生化的美登素前藥自組裝可以形成體內(nèi)循環(huán)非常穩(wěn)定的納米藥物，利于保證藥物的傳輸并不會(huì)對(duì)其他組織造成損傷，而在腫瘤部位則可以迅速有效的釋放藥物，保證治療效果。

實(shí)施例十四 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察Cy5-HA-SS-DM1（M_nHA =35 kDa，DM1% = 20 wt.%）納米藥物在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞攝取過(guò)程

采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察了Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子 (M_nHA = 35kDa，DM1% = 20 wt.%) 在CD44受體過(guò)量表達(dá)的人源乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中的細(xì)胞攝取行為。首先將MCF-7細(xì)胞以3×10⁴個(gè)/孔的密度鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板中，并于37℃，5%二氧化碳條件下，在含有10%血清、100 IU/mL抗生素青霉素和100μg/mL鏈霉素的1mL1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞的單層覆蓋率達(dá)到70%。然后向每個(gè)孔中加入200μL Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液（Cy5濃度：1微克/mL）；在37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)1h或4h后，移去培養(yǎng)基并用PBS溶液洗滌3次。接著用4%的多聚甲醛溶液固定15 min后用PBS溶液清洗3次。最后用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色10min，并用PBS溶液清洗3次。封閉受體實(shí)驗(yàn)時(shí)在加入Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液之前將自由的HA溶液（5mg/mL）與細(xì)胞一起孵育4h，接下來(lái)的步驟如前所述。制備好的樣品采用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。

圖8為Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥納米藥物以及HA封閉的Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥納米藥物在MCF-7細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)在化結(jié)果圖（Ⅰ是培養(yǎng)1 h，Ⅱ是培養(yǎng)4 h，Ⅲ是用自由HA封閉的前藥分子培養(yǎng)1 h）。結(jié)果表明：Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥納米藥物可以很快被細(xì)胞內(nèi)吞，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)熒光分子的強(qiáng)度明顯要更強(qiáng)，而對(duì)于自由HA封閉的對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)熒光分子的熒光強(qiáng)度基本觀察不到，說(shuō)明該納米藥物有顯著的靶向性和細(xì)胞內(nèi)吞的能力。

實(shí)施例十五 HA-SS-DM1（M_nHA =35 kDa，DM1% = 20 wt.%）納米藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞毒性測(cè)試

HA-SS-DM1前藥 (M_nHA = 35kDa; DM1% = 20 wt.%)在MCF-7細(xì)胞中的毒性通過(guò)MTT法測(cè)定。首先將100μL細(xì)胞的DMEM懸浮液(DMEM培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)鋪于96孔培養(yǎng)板中，使細(xì)胞的最終密度為3×10³個(gè)/孔，并置于37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24h使單層細(xì)胞的覆蓋率達(dá)到70~80%。然后向每孔中加入20μL不同濃度的HA-SS-DM1前藥的PB 溶液，使DM1在細(xì)胞孔中的最終濃度為0.001~10 mg/mL。待繼續(xù)培養(yǎng)68 h后，向每孔中加入20μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)的PBS溶液(5mg/mL)，并放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h以使MTT與活細(xì)胞作用。隨后移除含有MTT的培養(yǎng)液，向每孔中加入150μL DMSO以溶解活細(xì)胞與MTT產(chǎn)生的紫色甲瓚結(jié)晶，并使用酶標(biāo)儀(BioTek)測(cè)定每個(gè)孔在570nm處的吸收。細(xì)胞相對(duì)存活率通過(guò)與只有空白細(xì)胞的對(duì)照孔在570nm處的吸收相比得到。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均是平行四組進(jìn)行的。

細(xì)胞存活率(%)=(OD570樣品/OD570對(duì)照)×100%

封閉受體實(shí)驗(yàn)時(shí)在加入HA-SS-DM1前藥的PB溶液之前將自由的HA溶液（5mg/mL）與細(xì)胞一起孵育4h，即完成HA對(duì)腫瘤細(xì)胞的封閉，接下來(lái)的步驟同上，作為對(duì)照組。

圖9為不同納米藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果圖。結(jié)果表明： HA-SS-DM1前藥分子溶液具有很優(yōu)異的抗腫瘤活性。

實(shí)施例十六 HA-SS-DM1納米藥物在小鼠體內(nèi)循環(huán)研究

以下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的批準(zhǔn)協(xié)議。將6只體重為18-22g約5-8周齡的裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組分別尾靜脈給藥Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)或自由Cy5熒光分子。在給藥后2min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h各時(shí)間點(diǎn)通過(guò)眼眶取血，每次取血量約為30微升。取血結(jié)束后將血樣稱重，并溶解在100微升1%曲拉通溶液中，后再加入0.6 mL 二甲亞砜，于-20℃避光條件下靜置過(guò)夜，離心后取上清液進(jìn)行熒光測(cè)試。

%ID/g=（FL樣品×(V曲拉通+V二甲亞砜)）/（M血×FL標(biāo)樣×V標(biāo)樣×標(biāo)樣稀釋倍數(shù)）×100%。

附圖10為Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)與自由Cy5在小鼠體內(nèi)血液循環(huán)結(jié)果圖。結(jié)果表明：Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液具有良好的穩(wěn)定性，可以在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)。

實(shí)施例十七 Cy5-HA-SS-DM1納米藥物在乳腺癌荷瘤裸鼠體內(nèi)的活體成像研究

HA-SS-DM1前藥分子溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中在各個(gè)部位分布的情況用Maestro活體成像儀進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)。乳腺癌裸鼠移植瘤模型通過(guò)皮下注射50微升、含有1′10⁷個(gè)MCF-7細(xì)胞的懸浮液接種到裸鼠（體重18-22g）的體側(cè)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到200 mm³，荷瘤裸鼠通過(guò)尾靜脈注射0.2 mL Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液，然后在一定的時(shí)間點(diǎn)將裸鼠麻醉，并固定在黑色塑料板上，放入Maestro活體成像儀內(nèi)，在636 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定Cy5在體內(nèi)分布的強(qiáng)度。

圖11為Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)在荷瘤裸鼠體內(nèi)的活體成像結(jié)果圖；結(jié)果表明：隨著時(shí)間延長(zhǎng)，裸鼠腫瘤部位Cy5熒光逐漸增強(qiáng)，且當(dāng)24 h時(shí)腫瘤部位的熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，48 h后腫瘤部位Cy7熒光仍然較強(qiáng)，說(shuō)明可以有效地富集在腫瘤部位并維持較長(zhǎng)時(shí)間。

實(shí)施例十八 Cy5-HA-SS-DM1納米藥物在乳腺癌荷瘤裸鼠各臟器的生物分布研究

將六只腫瘤體積達(dá)到200mm³的荷瘤裸鼠隨機(jī)分成兩組，每只裸鼠通過(guò)尾靜脈分別注射0.2mL的（1）Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)；（2）自由HA封閉30 min后，Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)。24 h后，將每只裸鼠的心，肝，脾，肺，腎，及腫瘤取出，洗凈，稱重，加入400微升1%曲拉通，用勻漿機(jī)勻漿，再加入二甲亞砜600微升，置于-20℃度冰箱，24h后離心，取上清液進(jìn)行熒光測(cè)試分析。

%ID/g=FL器官×（V處理液+V器官）/（V藥物×稀釋倍數(shù)×FL藥物×M器官）×100%

圖12為Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液(M_nHA = 35kDa, DS = 6 %, DLC = 20%)在荷腫瘤裸鼠各臟器的生物分布結(jié)果圖。結(jié)果表明：Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液在腫瘤部位有很高富集達(dá)到8.1%ID/g，而自由HA封閉30 min后，Cy5標(biāo)記的HA-SS-DM1前藥分子溶液在腫瘤部位的富集顯著減少，只有4.0 %ID/g。

實(shí)施例十九 HA-SS-DM1納米藥物對(duì)正常老鼠最大耐受劑量（MTD）的研究

實(shí)驗(yàn)選用體重為18-20g，4-6周齡的正常小鼠，隨機(jī)分成6組（每組5只），通過(guò)尾靜脈分別注射0.2mL的HA-SS-DM1前藥的PB溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)（DM1濃度：2，3，4，5 mg DM1 equiv./kg）和自由DM1溶液（DM1濃度：0.5 mg/kg，0.75 mg/kg，1 mg/kg，1.25 mg/kg），將這天定位第0天。繼續(xù)觀察10天，記錄實(shí)驗(yàn)老鼠的體重變化以及死亡情況。

圖13及14為HA-SS-DM1溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)在正常小鼠體內(nèi)的體重變化及存活率結(jié)果圖。結(jié)果表明：HA-SS-DM1溶液 (M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)的最大耐受量能夠達(dá)到4 mg/kg，相比自由DM1溶液（MTD為1 mg/kg），該前藥分子能夠很大程度的提高DM1的耐受量，高達(dá)四倍。

實(shí)施例二十 HA-SS-DM1納米藥物在乳腺癌荷瘤裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果研究

將腫瘤體積達(dá)到50mm³的荷瘤裸鼠隨機(jī)分成三組（每組六只），這天被定為第0天。通過(guò)尾靜脈分別注射0.2mL的（1）HA-SS-DM1納米藥物溶液 (M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)（DM1濃度：0.8 mg DM1 equiv./kg）；（2）HA-SS-DM1納米藥物溶液 (M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)( DM1濃度：0.6 mg DM1 equiv./kg)；（3）自由DM1溶液(0.6 mg/kg)；（4）自由DM1溶液(0.3 mg/kg);（5）PBS溶液。載藥膠束制劑對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響定期用卡尺進(jìn)行測(cè)量。裸鼠體重變化定期用天平稱量。腫瘤的體積大小通過(guò)V=0.5×L×W×H公式計(jì)算得到（L是腫瘤最長(zhǎng)點(diǎn)的長(zhǎng)度；W是測(cè)量腫瘤最短點(diǎn)的長(zhǎng)度；H是測(cè)量腫瘤的高度）。在治療過(guò)程中記錄實(shí)驗(yàn)老鼠體重的變化。18天后，每組所有老鼠通過(guò)頸與脊椎骨脫臼處死，稱量所有組老鼠的腫瘤重量，并將每只老鼠心，肝，脾，肺，腎，腫瘤取出，用4%甲醛固定，切片，并用蘇木精和曙紅（H&E）染色用于組織學(xué)分析。

相對(duì)腫瘤體積（%）=腫瘤體積/第0天腫瘤體積×100%。

相對(duì)體重變化（%）=裸鼠體重/第0天裸鼠體重×100%。

圖15、16及17為HA-SS-DM1前藥分子溶液(M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)在荷瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)變化以及體重變化結(jié)果圖。結(jié)果表明：HA-SS-DM1納米藥物 (M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)（DM1濃度：0.8 mg/kg）可以有效抑制腫瘤體積增長(zhǎng)，具有很高的抗腫瘤活性；而自由DOX不能抑制腫瘤生長(zhǎng)。裸鼠體重變化情況表明HA-SS-DM1納米藥物 (M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)（DM1濃度：0.8 mg/kg）對(duì)體重沒(méi)有影響，副作用小，腫瘤抑制效果最明顯，而自由DOX毒副作用大。此外，H&E染色組織學(xué)分析結(jié)果顯示HA-SS-DM1納米藥物 (M_nHA = 35kDa, DM1% = 20 wt.%)（DM1濃度：0.8 mg/kg）對(duì)應(yīng)的腫瘤組織有大面積的壞死，但心臟和肝臟均正常，說(shuō)明其具有很好的生物相容性以及很好的腫瘤抑制效果。