技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過(guò)施用包含IgM的組合物治療或預(yù)防免疫癥狀或免疫狀況。

發(fā)明背景

微生物物種可變得對(duì)被感染的患者極為有害，如果該個(gè)體不能清除感染的話(huà)。感染也可變成膿毒性的，從被感染的器官擴(kuò)散到血流中。對(duì)于患者，這些膿毒性感染具有不良預(yù)后(poor outcome)。

充分表征了，血漿來(lái)源的IgM可結(jié)合內(nèi)毒素并防止針對(duì)患者的內(nèi)毒素介導(dǎo)的毒性。這歸因于IgM結(jié)合聚糖從而防止其效應(yīng)的固有能力或偏好。通常，內(nèi)毒素的這些毒性效應(yīng)響應(yīng)于由抗生素或患者的免疫系統(tǒng)引起的細(xì)菌死亡或溶菌。

另外，基于IgM與自身免疫性疾病或動(dòng)脈粥樣硬化的特定標(biāo)志物(hallmarks)，例如，自身抗體的相互作用已提出使用IgM組合物或IgM富集的組合物用于治療所述疾病(Hurez,V.等“Pooled Normal Human Polyspecific IgM Contains Neutralizing Anti-Idioitypes to IgG Autoantibodies of Autoimmune Patients and Protects from Exaperimental Autoimmune Disease”,Blood,1997，第90卷，第10期，4004-4013；以及Cesena,HY.“Immune-modulation by polyclonal IgM treatment reduces atherosclerosis in hypercholesterolemic apoE-/-mice”,Atherosclerosis,2012，第220卷,59-65)。

微生物感染的膿毒性狀況及其他并發(fā)癥通常與免疫系統(tǒng)的過(guò)度刺激相關(guān)，并且由于微生物的過(guò)度量級(jí)的且迅速的進(jìn)化通常不可能被控制。因此，仍存在對(duì)減少、抑制或預(yù)防免疫系統(tǒng)的過(guò)度刺激的有效治療方案的需要。

發(fā)明概述

本發(fā)明的實(shí)施方案提供了一種組合物，所述組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來(lái)源的IgM及任選地以藥物載體(carrier)形式的一種或更多種賦形劑。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在治療膿毒癥中使用的包含IgM的組合物。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在治療由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥中使用的包含IgM的組合物。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在需要其的患者中治療由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥的方法，其特征在于，所述方法包括施用包含IgM的組合物。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種用于免疫調(diào)節(jié)需要其的患者中的感染的方法，其特征在于，所述方法包括施用包含IgM的組合物。

附圖簡(jiǎn)述

為了更好的理解，以下參考通過(guò)舉例的方式呈現(xiàn)的附圖并參考不是對(duì)本發(fā)明的限制的說(shuō)明性實(shí)例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明。

圖1示出了評(píng)價(jià)IgM對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)LPS-誘導(dǎo)的攜帶穩(wěn)定NF-κB報(bào)告物質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞中的NF-κB活化的效應(yīng)獲得的結(jié)果。在圖1A和1B兩者中，y軸示出了如通過(guò)NF-κB SEAP報(bào)告物測(cè)量的NF-κB活性的倍數(shù)增加，所述增加與NF-κB活性的誘導(dǎo)成正比。此外，在兩圖(1A和1B)中，多個(gè)處理組在x軸上示出。標(biāo)準(zhǔn)誤差在各個(gè)條上指示。

圖2示出了艱難梭菌(Clostridium difficile)的類(lèi)毒素A或類(lèi)毒素B在攜帶穩(wěn)定NF-κB報(bào)告物質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞中誘導(dǎo)NF-κB獲得的結(jié)果。如通過(guò)NF-κB SEAP報(bào)告物測(cè)量的NF-κB活性的倍數(shù)增加在y軸上指示，并且與NF-κB活性的誘導(dǎo)成正比。以μg/mL計(jì)的類(lèi)毒素A或類(lèi)毒素B的濃度在x軸示出。

圖3示出了抑制艱難梭菌的類(lèi)毒素B誘導(dǎo)的攜帶穩(wěn)定NF-κB報(bào)告物質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞中的NF-κB活化獲得的結(jié)果。如通過(guò)NF-κB SEAP報(bào)告物測(cè)量的NF-κB活性的倍數(shù)增加在y軸上指示，并且與NF-κB活性的誘導(dǎo)成正比。多個(gè)處理組在x軸上示出。標(biāo)準(zhǔn)誤差在各個(gè)條上指示。

圖4示出了抑制肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)誘導(dǎo)的攜帶穩(wěn)定NF-κB報(bào)告物質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞中的NF-κB活化和IL-8分泌的結(jié)果。在圖4A中，y軸示出了如通過(guò)NF-κB SEAP報(bào)告物測(cè)量的NF-κB活性的倍數(shù)增加，所述倍數(shù)增加與NF-κB活性的誘導(dǎo)成正比；且x軸示出了多個(gè)處理組。在圖4B中，y軸示出了分泌到培養(yǎng)物上清液中的IL-8的濃度；且x軸示出了多個(gè)處理組。在圖4B中，“UD”指示在未處理的對(duì)照組中IL-8是檢測(cè)不到的。在兩圖中，標(biāo)準(zhǔn)誤差在各個(gè)條上指示。

圖5示出了對(duì)關(guān)于IgM介導(dǎo)的對(duì)佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate)(PMA)/離子霉素誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，特別是T細(xì)胞的細(xì)胞增殖的阻斷的實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。如通過(guò)Cell Titer Glow測(cè)量的相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)增殖的倍數(shù)增加在y軸上指示，且與細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)成正比。多個(gè)處理組在x軸上示出。標(biāo)準(zhǔn)偏差在各個(gè)條上指示。

發(fā)明詳述

在詳盡和大量的實(shí)驗(yàn)和研究之后，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，IgM組合物顯示出免疫調(diào)節(jié)活性(例如，通過(guò)減少NF-κB活性誘導(dǎo)和/或降低外周血單核細(xì)胞的增殖)，這使得所述組合物適合于治療與免疫系統(tǒng)的過(guò)度刺激相關(guān)的狀況，所述免疫系統(tǒng)的過(guò)度刺激例如，與膿毒性狀況相關(guān)的免疫系統(tǒng)的過(guò)度刺激。

本發(fā)明的實(shí)施方案提供了一種組合物，所述組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來(lái)源的IgM及任選地以藥物載體形式的一種或更多種賦形劑。根據(jù)特定的實(shí)施方案，一種或更多種賦形劑和/或藥物載體是合成的，即，非天然存在的。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指與本發(fā)明的血漿來(lái)源的IgM一起被施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類(lèi)載體可以是無(wú)菌液體，諸如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的那些油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等，聚乙二醇，甘油(glycerin)，丙二醇或其他合成的溶劑。鹽溶液和含水右旋糖和丙三醇(glycerol)溶液也可被用作液體載體，特別是用于可注射溶液的液體載體。根據(jù)特定的實(shí)施方案，藥學(xué)上可接受的載體是合成的(即，載體不是天然存在的)。

適合的賦形劑的非限制性實(shí)例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、丙三醇、丙二醇、水、乙醇等。賦形劑還可包括潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；抗細(xì)菌劑諸如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；以及用于調(diào)節(jié)張力(tonicity)的試劑諸如氯化鈉或右旋糖。根據(jù)特定的實(shí)施方案，一種或更多種賦形劑是合成的(即，賦形劑不是天然存在的)。

本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及用于獨(dú)立于內(nèi)毒素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答而對(duì)針對(duì)微生物感染的應(yīng)答進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的方法。

因此，在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在治療膿毒癥中使用的包含IgM的組合物。

在第二實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在治療由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥中使用的包含IgM的組合物。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在需要其的患者中治療由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥的方法，其特征在于，所述方法包括施用包含IgM的組合物。

此外，本發(fā)明還提供了一種用于免疫調(diào)節(jié)需要其的患者中的感染的方法，其特征在于，所述方法包括施用包含IgM的組合物。

如本文使用的，“高細(xì)胞因子血癥(hypercytokinemia)”及其復(fù)數(shù)意指這樣的免疫并發(fā)癥，所述免疫并發(fā)癥特征為，由于細(xì)胞因子和白細(xì)胞，包括T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的正反饋回路(positive feedback loop)而產(chǎn)生過(guò)量的促炎性細(xì)胞因子。

如本文使用的，“高凝血癥(hypercoagulopathy)”及其復(fù)數(shù)意指由某些血細(xì)胞組分，如血小板及微生物的外來(lái)的和固有的途徑的血液凝固因子及其產(chǎn)物的過(guò)度活化導(dǎo)致的免疫并發(fā)癥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在治療膿毒癥中使用的包含IgM的組合物。根據(jù)特定的實(shí)施方案，該組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來(lái)源的IgM及任選地以藥物載體形式的一種或更多種賦形劑。

膿毒癥可由一種或更多種細(xì)菌(革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性)、一種或更多種真菌(例如，黃曲霉(Aspergillus flavus))、一種或更多種病毒或其組合產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膿毒癥由一種或更多種細(xì)菌產(chǎn)生，更優(yōu)選地膿毒癥由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、艱難梭菌、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)或其組合產(chǎn)生。

膿毒癥或膿毒性狀況的治療通過(guò)治療免疫并發(fā)癥，諸如促炎性反應(yīng)或免疫系統(tǒng)的過(guò)度活化來(lái)進(jìn)行，膿毒癥或膿毒性狀況的治療繼而通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)進(jìn)行。所述免疫調(diào)節(jié)優(yōu)選地獨(dú)立于內(nèi)毒素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且可通過(guò)多種方法來(lái)施加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)抑制NF-κB誘導(dǎo)來(lái)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)抑制外周血單核細(xì)胞，優(yōu)選地T-細(xì)胞的增殖來(lái)進(jìn)行。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)以上提及的兩種方法施加。

優(yōu)選地，組合物具有至少90％(w/v)的IgM純度，更優(yōu)選地至少95％的IgM純度。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物具有95％(w/v)的IgM純度。

組合物的待施用的劑量?jī)?yōu)選地為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者，更優(yōu)選地從75mg IgM/kg患者至600mg IgM/kg患者，且最優(yōu)選地，從75mg IgM/kg患者至300mg IgM/kg患者。另外，組合物優(yōu)選地被至少一周一次或每隔一天或者每周三次或每天提供或施用。

另外，所述IgM可以是重組的、血漿來(lái)源的、細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的、轉(zhuǎn)基因的或化學(xué)合成的。

如果IgM是重組的，它可根據(jù)蛋白表達(dá)、生產(chǎn)和純化領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來(lái)獲得。例如，IgM核酸序列可被插入到適合于在被選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何載體(vector)中，該被選擇的宿主細(xì)胞例如細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)及葡萄球菌屬(Staphylococcus))、酵母(酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces))、昆蟲(chóng)細(xì)胞(家蠶(Bombyx mori)、甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)或黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS-1)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，Hep G2)、人腺病毒轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞、小鼠L-929細(xì)胞、HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系、來(lái)源于瑞士(Swiss)小鼠、Balb-c或NIH小鼠的鼠(murine)3T3細(xì)胞、CV-1細(xì)胞系、來(lái)源于原代組織或原代外植塊(explant)的體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株)。

細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的IgM可通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法或程序，例如，雜交瘤方法來(lái)產(chǎn)生。

轉(zhuǎn)基因和化學(xué)合成的IgM可通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法或程序來(lái)產(chǎn)生。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，IgM是血漿來(lái)源的IgM，分離自合適的血漿級(jí)分例如，如美國(guó)專(zhuān)利6,307,028中描述的收集IgG之后的兩個(gè)ANX柱程序的洗滌物或者通過(guò)負(fù)選擇親和色譜(negative selection affinity chromatography)或尺寸排阻色譜(size exclusion chromatography)進(jìn)一步純化所述級(jí)分。

關(guān)于所述血漿來(lái)源的IgM，任選地，它可被分離或純化以增加針對(duì)給定的外毒素、分泌型蛋白、微生物物種或其組合的特異性抗體的相對(duì)量。

根據(jù)特定的實(shí)施方案，設(shè)想了單獨(dú)地施用包含IgM的組合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含IgM的組合物連同一種或更多種其他組合物或分子一起被施用。所述其他組合物或分子優(yōu)選地選自抗炎分子、抗生素(例如，小分子抗生素、本質(zhì)上是抗微生物劑的分子、天然或合成的肽抗微生物劑和/或具有抗微生物特性的蛋白)、其他免疫調(diào)節(jié)劑或其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其他組合物或分子是萬(wàn)古霉素、美洛培南、乳鐵蛋白或其組合。包含IgM的組合物連同如以上提及的一種或更多種其他組合物或分子一起的施用包括同時(shí)施用待提供的所有組合物或分子或者一種接著另一種地施用這些組合物或分子。

包含IgM的組合物可被用于治療膿毒癥(如以上提及的)以及用于預(yù)防所述疾病兩者。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了一種用于在治療由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥中使用的包含IgM的組合物。

感染可由一種或更多種細(xì)菌(革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性)、一種或更多種真菌(例如，黃曲霉)、一種或更多種病毒或其組合產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，感染由一種或更多種細(xì)菌產(chǎn)生，更優(yōu)選地，感染由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、艱難梭菌、肉毒梭菌或其組合產(chǎn)生。

免疫并發(fā)癥，諸如促炎性反應(yīng)或免疫系統(tǒng)的過(guò)度活化的治療通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)進(jìn)行。所述免疫調(diào)節(jié)優(yōu)選地獨(dú)立于內(nèi)毒素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且可通過(guò)多種方法來(lái)施加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)抑制NF-κB誘導(dǎo)來(lái)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)抑制外周血單核細(xì)胞，優(yōu)選地T-細(xì)胞的增殖來(lái)進(jìn)行。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)以上提及的兩種方法施加。

組合物優(yōu)選地具有至少90％(w/v)的IgM純度，更優(yōu)選地至少95％(w/v)的IgM純度。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的組合物包括95％(w/v)的IgM純度。

組合物的待施用的劑量?jī)?yōu)選地為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者，更優(yōu)選地從75mg IgM/kg患者至600mg IgM/kg患者，且最優(yōu)選地，從75mg IgM/kg患者至300mg IgM/kg患者。另外，組合物優(yōu)選地被至少一周一次或每隔一天或者每周三次或每天提供或施用。

另外，所述IgM可以是重組的、血漿來(lái)源的、細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的、轉(zhuǎn)基因的或化學(xué)合成的。

如果IgM是重組的，它可根據(jù)蛋白表達(dá)、生產(chǎn)和純化領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來(lái)獲得。例如，IgM核酸序列可被插入到適合于在被選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何載體中，該被選擇的宿主細(xì)胞例如細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬及葡萄球菌屬)、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬或克魯維酵母屬)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(家蠶、甘藍(lán)夜蛾、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS-1)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，Hep G2)、人腺病毒轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞、小鼠L-929細(xì)胞、HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系、來(lái)源于瑞士小鼠、Balb-c或NIH小鼠的鼠3T3細(xì)胞、CV-1細(xì)胞系、來(lái)源于原代組織或原代外植塊的體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株)。

細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的IgM可通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法或程序，例如，雜交瘤方法來(lái)產(chǎn)生。

轉(zhuǎn)基因和化學(xué)合成的IgM可通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法或程序來(lái)產(chǎn)生。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，IgM是血漿來(lái)源的IgM，分離自合適的血漿級(jí)分，例如，如在美國(guó)專(zhuān)利6,307,028中描述的收集IgG之后的兩個(gè)ANX柱程序的洗滌物，或者通過(guò)負(fù)選擇親和色譜或尺寸排阻色譜進(jìn)一步純化所述級(jí)分。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥是高細(xì)胞因子血癥、高凝血癥或器官衰竭。

關(guān)于所述血漿來(lái)源的IgM，任選地，它可被分離或純化以增加針對(duì)給定的外毒素、分泌型蛋白、微生物物種或其組合的特異性抗體的相對(duì)量。

根據(jù)特定的實(shí)施方案，設(shè)想了單獨(dú)地施用包含IgM的組合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含IgM的組合物連同一種或更多種其他組合物或分子一起被施用。所述其他組合物或分子優(yōu)選地選自抗炎分子、抗生素(例如，小分子抗生素、本質(zhì)上是抗微生物劑的分子、天然或合成的肽抗微生物劑和/或具有抗微生物特性的蛋白)、其他免疫調(diào)節(jié)劑或其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其他組合物或分子是萬(wàn)古霉素、美洛培南、乳鐵蛋白或其組合。包含IgM的組合物連同如以上提及的一種或更多種其他組合物或分子一起的施用包括同時(shí)施用待提供的所有組合物或分子或者一種接著另一種地施用這些組合物或分子。

包含IgM的組合物可被用于治療由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥(如以上提及的)以及用于預(yù)防所述免疫并發(fā)癥兩者。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于在需要其的患者中治療由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥的方法，其特征在于，所述方法包括施用包含IgM的組合物。

感染可由一種或更多種細(xì)菌(革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性)、一種或更多種真菌(例如，黃曲霉)、一種或更多種病毒或其組合產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，感染由一種或更多種細(xì)菌產(chǎn)生，更優(yōu)選地感染由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、艱難梭菌、肉毒梭菌或其組合產(chǎn)生。

免疫并發(fā)癥，諸如促炎性反應(yīng)或免疫系統(tǒng)的過(guò)度活化的治療通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)進(jìn)行。所述免疫調(diào)節(jié)優(yōu)選地獨(dú)立于內(nèi)毒素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且可通過(guò)多種方法來(lái)施加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)抑制NF-κB誘導(dǎo)來(lái)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)抑制外周血單核細(xì)胞，優(yōu)選地T-細(xì)胞的增殖來(lái)進(jìn)行。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)以上提及的兩種方法施加。

組合物優(yōu)選地具有至少90％(w/v)的IgM純度，更優(yōu)選地至少95％(w/v)的IgM純度。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的組合物包括95％(w/v)的IgM純度。

組合物的待施用的劑量?jī)?yōu)選地為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者，更優(yōu)選地從75mg IgM/kg患者至600mg IgM/kg患者，且最優(yōu)選地，從75mg IgM/kg患者至300mg IgM/kg患者。另外，組合物優(yōu)選地被至少一周一次或每隔一天或者每周三次或每天提供或施用。

另外，所述IgM可以是重組的、血漿來(lái)源的、細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的、轉(zhuǎn)基因的或化學(xué)合成的。

如果IgM是重組的，它可根據(jù)蛋白表達(dá)、生產(chǎn)和純化領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來(lái)獲得。例如，IgM核酸序列可被插入到適合于在被選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何載體中，該被選擇的宿主細(xì)胞例如細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬及葡萄球菌屬)、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬或克魯維酵母屬)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(家蠶、甘藍(lán)夜蛾、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS-1)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，Hep G2)、人腺病毒轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞、小鼠L-929細(xì)胞、HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系、來(lái)源于瑞士小鼠、Balb-c或NIH小鼠的鼠3T3細(xì)胞、CV-1細(xì)胞系、來(lái)源于原代組織或原代外植塊的體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株)。

細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的IgM可通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法或程序，例如，雜交瘤方法來(lái)產(chǎn)生。

轉(zhuǎn)基因和化學(xué)合成的IgM可通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法或程序來(lái)產(chǎn)生。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，IgM是血漿來(lái)源的IgM，分離自合適的血漿級(jí)分，例如，如在美國(guó)專(zhuān)利6,307,028中描述的收集IgG之后的兩個(gè)ANX柱程序的洗滌物或者通過(guò)負(fù)選擇親和色譜或尺寸排阻色譜進(jìn)一步純化所述級(jí)分。

關(guān)于所述血漿來(lái)源的IgM，任選地，它可被分離或純化以增加針對(duì)給定的外毒素、分泌型蛋白、微生物物種或其組合的特異性抗體的相對(duì)量。

根據(jù)特定的實(shí)施方案，設(shè)想了單獨(dú)地施用包含IgM的組合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含IgM的組合物連同一種或更多種其他組合物或分子一起被施用。所述其他組合物或分子優(yōu)選地選自抗炎分子、抗生素(例如，小分子抗生素、本質(zhì)上是抗微生物劑的分子、天然或合成的肽抗微生物劑和/或具有抗微生物特性的蛋白)、其他免疫調(diào)節(jié)劑或其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其他組合物或分子是萬(wàn)古霉素、美洛培南、乳鐵蛋白或其組合。包含IgM的組合物連同如以上提及的一種或更多種其他組合物或分子一起的施用包括同時(shí)施用待提供的所有組合物或分子或者一種接著另一種地施用這些組合物或分子。

本發(fā)明的方法可被用于治療由感染產(chǎn)生的免疫并發(fā)癥(如以上提及的)以及用于預(yù)防所述免疫并發(fā)癥兩者。

最后，本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于免疫調(diào)節(jié)需要其的患者中的感染的方法，其特征在于，所述方法包括施用包含IgM的組合物。

所述免疫調(diào)節(jié)可被用于治療或預(yù)防感染或感染相關(guān)的癥狀或狀況。

感染可由一種或更多種細(xì)菌(革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性)、一種或更多種真菌(例如，黃曲霉)、一種或更多種病毒或其組合產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，感染由一種或更多種細(xì)菌產(chǎn)生，更優(yōu)選地感染由大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、艱難梭菌、肉毒梭菌或其組合產(chǎn)生。

所述免疫調(diào)節(jié)允許治療免疫并發(fā)癥，諸如促炎性反應(yīng)或免疫系統(tǒng)的過(guò)度活化，并且優(yōu)選地獨(dú)立于內(nèi)毒素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，且可以通過(guò)多種方法來(lái)施加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)抑制NF-κB誘導(dǎo)來(lái)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)抑制外周血單核細(xì)胞，優(yōu)選地T-細(xì)胞的增殖來(lái)進(jìn)行。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)通過(guò)以上提及的兩種方法施加。

組合物優(yōu)選地具有至少90％(w/v)的IgM純度，更優(yōu)選地至少95％(w/v)的IgM純度。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的組合物包括95％(w/v)的IgM純度。

組合物的待施用的劑量?jī)?yōu)選地為從75mg IgM/kg患者至1g IgM/kg患者，更優(yōu)選地從75mg IgM/kg患者至600mg IgM/kg患者，且最優(yōu)選地，從75mg IgM/kg患者至300mg IgM/kg患者。另外，組合物優(yōu)選地被至少一周一次或每隔一天或者每周三次或每天提供或施用。

另外，所述IgM可以是重組的、血漿來(lái)源的、細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的、轉(zhuǎn)基因的或化學(xué)合成的。

如果IgM是重組的，它可根據(jù)蛋白表達(dá)、生產(chǎn)和純化領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來(lái)獲得。例如，IgM核酸序列可被插入到適合于在被選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何載體中，該被選擇的宿主細(xì)胞例如細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬及葡萄球菌屬)、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬或克魯維酵母屬)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(家蠶、甘藍(lán)夜蛾、草地貪夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS-1)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，Hep G2)、人腺病毒轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞、小鼠L-929細(xì)胞、HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系、來(lái)源于瑞士小鼠、Balb-c或NIH小鼠的鼠3T3細(xì)胞、CV-1細(xì)胞系、來(lái)源于原代組織或原代外植塊的體外培養(yǎng)物的細(xì)胞株)。

細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的IgM可通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法或程序，例如，雜交瘤方法來(lái)產(chǎn)生。

轉(zhuǎn)基因和化學(xué)合成的IgM可通過(guò)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法或程序來(lái)產(chǎn)生。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，IgM是血漿來(lái)源的IgM，分離自合適的血漿級(jí)分，例如，如美國(guó)專(zhuān)利6,307,028中描述的收集IgG之后的兩個(gè)ANX柱程序的洗滌物，或者通過(guò)負(fù)選擇親和色譜或尺寸排阻色譜進(jìn)一步純化所述級(jí)分。

關(guān)于所述血漿來(lái)源的IgM，任選地，它可被分離或純化以增加針對(duì)給定的外毒素、分泌型蛋白、微生物物種或其組合的特異性抗體的相對(duì)量。

根據(jù)特定的實(shí)施方案，設(shè)想了單獨(dú)地施用包含IgM的組合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含IgM的組合物連同一種或更多種其他組合物或分子一起施用。所述其他組合物或分子優(yōu)選地選自抗炎分子、抗生素(例如，小分子抗生素、本質(zhì)上是抗微生物劑的分子、天然或合成的肽抗微生物劑和/或具有抗微生物特性的蛋白)、其他免疫調(diào)節(jié)劑或其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其他組合物或分子是萬(wàn)古霉素、美洛培南、乳鐵蛋白或其組合。包含IgM的組合物連同如以上提及的一種或更多種其他組合物或分子一起的施用包括同時(shí)施用待提供的所有組合物或分子或者一種接著另一種地施用這些組合物或分子。

本文描述的實(shí)施方案意圖是對(duì)本發(fā)明示例性的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可對(duì)本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案和實(shí)施例作出修改而不偏離本公開(kāi)內(nèi)容的范圍。

以上使用術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”及其變型描述本發(fā)明的實(shí)施方案。然而，本發(fā)明人的意圖是，在本文描述的任何實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”可被“由......組成(consisting of)”及“主要由......組成(consisting essentially of)”代替，而不偏離本發(fā)明的范圍。除非另外指明，否則本文提供的所有值包括多達(dá)給定的起點(diǎn)和終點(diǎn)并且包括給定的起點(diǎn)和終點(diǎn)。

以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的實(shí)施方案，并且應(yīng)該被理解為是說(shuō)明性的而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1.分析IgM對(duì)由大腸桿菌的脂多糖(LPS)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的NF-κB活性的影響。

作為監(jiān)測(cè)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑活化的方法，使用人THP-1單核細(xì)胞細(xì)胞系進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，所述人THP-1單核細(xì)胞細(xì)胞系攜帶具有驅(qū)動(dòng)分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報(bào)告物的NF-κB依賴(lài)型啟動(dòng)子的穩(wěn)定質(zhì)粒(Invivogen,San Diego,CA USA)。

根據(jù)制造商的推薦在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

該實(shí)驗(yàn)用來(lái)源于大腸桿菌菌株O111:B4的LPS和來(lái)源于大腸桿菌菌株K12的LPS兩者來(lái)進(jìn)行。以上提及的THP-1細(xì)胞用100ng/mL來(lái)源于菌株O111:B4的大腸桿菌LPS(參見(jiàn)圖1A)或1ng/mL來(lái)源于菌株K12的大腸桿菌LPS(參見(jiàn)圖1B)處理24小時(shí)。

當(dāng)使用IgM時(shí)，LPS與純化的IgM(95％(w/v)或更高的純度)一起預(yù)孵育，然后處理細(xì)胞。

對(duì)于NF-κB活性測(cè)定，將1x10⁵個(gè)細(xì)胞接種在96孔板的每個(gè)孔中。測(cè)定培養(yǎng)基與增殖培養(yǎng)基相同，例外是測(cè)定培養(yǎng)基包含減少的血清以減少胎牛血清(FBS)來(lái)源的蛋白的非特異性效應(yīng)。如以上描述的，使用終濃度2.5mg/mL的IgM(至少95％(w/v)純的IgM)處理細(xì)胞。

NF-κB活性通過(guò)評(píng)價(jià)上清液中分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的水平來(lái)確定，分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的水平通過(guò)Quanti-Blue測(cè)定(Invivogen,San Diego,CAUSA)測(cè)量并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在NF-κB測(cè)定時(shí)的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目通過(guò)Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來(lái)確定并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。圖1中示出的相對(duì)NF-κB活性通過(guò)以下來(lái)計(jì)算：針對(duì)通過(guò)Cell Titer Glow測(cè)定確定的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目將NF-κB測(cè)定值規(guī)范化，然后將實(shí)驗(yàn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化為值1。

令人驚訝地，觀察到，在以上測(cè)試和提及的任何情況下，純化的IgM對(duì)LPS介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的活化不具有任何顯著效應(yīng)(參見(jiàn)圖1A和圖1B)。

實(shí)施例2.分析IgM對(duì)由艱難梭菌的類(lèi)毒素B誘導(dǎo)的NF-κB活性的影響。

已知艱難梭菌的毒素在單核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌，包括IL-8和TNF-α(Linevsky,JK.，等，“IL-8release and neutrophil activation by Clostridium difficile toxin-exposed human monocytes,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,1997,273,G1333-G1340；以及Sun,X.，等“Essential role of the glucosyltransferase activity in Clostridium difficile toxin-induced secretion of TNF-αby macrophages”,Microbial Pathogenesis,2009,16,298-305)。還已知這些細(xì)胞因子中的每個(gè)在NF-κB活化后被誘導(dǎo)。

因此，測(cè)試了艱難梭菌的類(lèi)毒素B是否能夠在如以上提及的攜帶穩(wěn)定地整合的NF-κB報(bào)告物質(zhì)粒(Invivogen,San Diego,CA USA)的人THP-1細(xì)胞中誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。根據(jù)制造商的推薦在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

由于毒素本身是細(xì)胞毒性的，使用滅活的類(lèi)毒素以避免復(fù)雜的結(jié)果解釋。對(duì)于NF-κB活性測(cè)定，在處理之前將2x10⁵個(gè)細(xì)胞接種在96孔板的每個(gè)孔中24小時(shí)。然后，用幾種濃度的艱難梭菌的類(lèi)毒素A(List Biological Labs,Inc,Campbell,CA USA)或類(lèi)毒素B(List Biological Labs,Inc,Campbell,CA USA)來(lái)處理細(xì)胞。NF-κB活性通過(guò)評(píng)價(jià)上清液中分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的水平來(lái)確定，分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的水平通過(guò)Quanti-Blue測(cè)定(Invivogen,San Diego,CA USA)測(cè)量并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。在NF-κB測(cè)定時(shí)的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目通過(guò)Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來(lái)確定并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。圖2中示出的相對(duì)NF-κB活性通過(guò)以下來(lái)計(jì)算：針對(duì)通過(guò)Cell Titer Glow測(cè)定確定的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目將NF-κB測(cè)定值規(guī)范化，然后將實(shí)驗(yàn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化為值1。

盡管類(lèi)毒素A在這些細(xì)胞中不誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，但是類(lèi)毒素B在這些細(xì)胞中顯示了NF-κB報(bào)告物的誘導(dǎo)(參見(jiàn)圖2)。

評(píng)價(jià)了相比于BSA(牛血清白蛋白)對(duì)照IgM(90％-95％純度的IgM)的溶液抑制NF-κB活性的能力。

細(xì)胞用9.25μg/mL的艱難梭菌類(lèi)毒素B處理24小時(shí)。在另外用BSA或IgM組合物處理的情況下，將類(lèi)毒素B與所述BSA或與IgM(90％-95％(w/v)純度的IgM)的溶液一起預(yù)孵育，然后處理細(xì)胞。

測(cè)定培養(yǎng)基與增殖培養(yǎng)基相同，例外是測(cè)定培養(yǎng)基包含0.025μM維生素D3。對(duì)于NF-κB活性測(cè)定，在處理之前將2x10⁵個(gè)細(xì)胞接種在96孔板的每個(gè)孔中24小時(shí)。然后，如以上描述的，使用終濃度3mg/mL IgM(90％-95％(w/v)純度的IgM)或BSA處理細(xì)胞。NF-κB活性通過(guò)評(píng)價(jià)上清液中分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的水平來(lái)確定，堿性磷酸酶(SEAP)的水平通過(guò)Quanti-Blue測(cè)定(Invivogen,San Diego,CAUSA)測(cè)量并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。在NF-κB測(cè)定時(shí)的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目通過(guò)Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來(lái)確定并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。圖3中示出的相對(duì)NF-κB活性通過(guò)以下來(lái)計(jì)算：針對(duì)通過(guò)Cell Titer Glow測(cè)定確定的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目將NF-κB測(cè)定值規(guī)范化，然后將實(shí)驗(yàn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化為值1。

BSA對(duì)類(lèi)毒素B的NF-κB活化沒(méi)有作用，而以上提及的IgM的溶液使類(lèi)毒素B效應(yīng)減弱(參見(jiàn)圖3)。

實(shí)施例3.分析IgM對(duì)肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌引起的NF-κB活性誘導(dǎo)和IL-8分泌的影響。

由于IgM不能使由大腸桿菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素LPS介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)減弱(參見(jiàn)實(shí)施例1)，因此評(píng)價(jià)純化的IgM對(duì)未受損傷的完整細(xì)菌(具有細(xì)胞壁組分如LPS)的效應(yīng)。

用活的微生物培養(yǎng)物的處理將摧毀(overtaken)并妨礙哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定系統(tǒng)的結(jié)果。因此，將完整細(xì)菌(肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌)進(jìn)行甲醛固定以殺死所述細(xì)菌，同時(shí)保持細(xì)胞完整。

將如以上提及的攜帶穩(wěn)定NF-κB報(bào)告物質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞用甲醛殺死的肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌處理24小時(shí)。

當(dāng)使用IgM時(shí)，在處理時(shí)，以上提及的微生物與純化的IgM共處理。

對(duì)于NF-κB活性測(cè)定，將1x10⁵個(gè)細(xì)胞接種在96孔板的每個(gè)孔中。測(cè)定培養(yǎng)基與增殖培養(yǎng)基相同，例外是測(cè)定培養(yǎng)基包含減少的血清以減少FBS來(lái)源的蛋白的非特異性效應(yīng)。如附圖說(shuō)明中描述的，使用終濃度2.5mg/mL IgM(至少95％純的IgM)處理細(xì)胞。NF-κB活性通過(guò)評(píng)價(jià)上清液中分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的水平來(lái)確定，分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的水平通過(guò)Quanti-Blue測(cè)定(Invivogen,San Diego,CA USA)測(cè)量并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。在NF-κB測(cè)定時(shí)的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目通過(guò)Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來(lái)確定并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。所示的相對(duì)NF-κB活性通過(guò)以下來(lái)計(jì)算：針對(duì)通過(guò)Cell Titer Glow測(cè)定確定的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目將NF-κB測(cè)定值規(guī)范化，然后將實(shí)驗(yàn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化為值1。

兩個(gè)種類(lèi)的經(jīng)甲醛處理的細(xì)菌能夠在實(shí)施例1和實(shí)施例2中使用的細(xì)胞系統(tǒng)或模型(即，攜帶穩(wěn)定地整合的NF-κB報(bào)告物質(zhì)粒的人THP-1細(xì)胞)中有效地誘導(dǎo)NF-κB途徑(參見(jiàn)圖4A)。

令人驚訝地，用經(jīng)甲醛處理的肺炎克雷伯桿菌或銅綠假單胞菌的任一種和純化的IgM的共處理顯示NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的減少。

NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的活化誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的分泌是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的。IL-8是在人類(lèi)中被充分表征的NF-κB響應(yīng)性促炎性細(xì)胞因子。因此，評(píng)價(jià)了以上提及的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)物上清液中的IL-8分泌，以觀察所述IL-8分泌是否也響應(yīng)于細(xì)菌(肺炎克雷伯桿菌或銅綠假單胞菌)和IgM(參見(jiàn)圖4B)。分泌進(jìn)上清液中的IL-8細(xì)胞因子使用AlphaLISAIL-8免疫測(cè)定試劑盒(Perkin-Elmer,Waltham,MA USA)根據(jù)制造商的操作方案通過(guò)AlphaLISA來(lái)測(cè)量。

類(lèi)似于NF-κB活化，單獨(dú)的經(jīng)甲醛固定的細(xì)菌誘導(dǎo)IL-8的分泌，而相對(duì)于僅單獨(dú)處理的培養(yǎng)物，用所述細(xì)菌和IgM的共處理顯示減少的IL-8分泌(參見(jiàn)圖4B)。

實(shí)施例4.分析IgM對(duì)外周血單核細(xì)胞增殖的影響。

由于IgM顯示明顯的對(duì)于NF-κB促炎性途徑的效應(yīng)，因此還評(píng)價(jià)了純化的IgM是否對(duì)免疫功能具有更普遍的效應(yīng)。由抗原刺激的血液淋巴細(xì)胞，特別是T細(xì)胞的增殖是最基本的促炎性免疫應(yīng)答中的一種。

使用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和離子霉素(一種非常常見(jiàn)的增殖刺激物)來(lái)誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞，更確切地講是血液T-淋巴細(xì)胞或T細(xì)胞的增殖。

在具有10％熱滅活的人血清的RPMI中培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞。對(duì)于增殖測(cè)定，使用培養(yǎng)基將3x10⁵個(gè)細(xì)胞接種在96孔板的每個(gè)孔中。

T細(xì)胞用10ng/mL PMA和0.5μM離子霉素處理3天。在使用IgM的情況下，在處理時(shí)，視情況而定，用純化的IgM(以約5mg/mL的終濃度和至少95％的純度)處理或共處理細(xì)胞。

對(duì)于不同組的細(xì)胞滴度使用Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)測(cè)量(根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，并基于將對(duì)細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)的測(cè)量值作為ATP含量的函數(shù)。

在PMA/離子霉素刺激3天后，在外周血單核細(xì)胞中觀察到增殖的顯著增加(參見(jiàn)圖5)。相對(duì)于對(duì)照未處理的細(xì)胞及相對(duì)于PMA/離子霉素處理，在存在或不存在PMA/離子霉素下，用IgM處理細(xì)胞降低了外周血單核細(xì)胞的增殖。由于PMA/離子霉素是極強(qiáng)的、極為非特異的促細(xì)胞分裂原，該觀察結(jié)果是高度令人驚訝的。這表明IgM本身具有對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。