本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種全球范圍內(nèi)常見的慢性病，目前在全球死亡原因中排名第四，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2020年，COPD將在全球疾病發(fā)病中排名第五，死亡原因中排名第三。
COPD是一種不完全可逆的氣流受限特征的疾病，與肺部對有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，其慢性炎癥反應(yīng)遍及氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管。參與COPD的細(xì)胞有中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞被激活后釋放多種炎性介質(zhì)，如白三烯B4(LTB4)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、RANTES、Eotaxin、腫瘤壞死因子α(TNFα)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等，參與肺實(shí)質(zhì)破壞、肺血管等炎癥反應(yīng)。病理變化特征表現(xiàn)為肺泡腔炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)浸潤、小支氣管和細(xì)支氣管周圍灶性炎性細(xì)胞浸潤，肺組織邊緣肺泡腔擴(kuò)張、破壞，肺泡壁變寬，其上皮細(xì)胞腫脹、變圓、部分脫落。COPD與慢性支氣管炎和肺氣腫密切相關(guān)，但定義上有所不同，支氣管哮喘與特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，其氣流受限具可逆性(與慢性氣管炎合并時(shí)會(huì)出現(xiàn)氣流受限不完全可逆)?，F(xiàn)在尚無藥物能遏制COPD病情的進(jìn)行性發(fā)展，其藥物治療的研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢，目前臨床常常將治療哮喘的藥物用于治療COPD，由于COPD的發(fā)病機(jī)制不同于哮喘，難以取得滿意的療效。
從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2009年發(fā)表(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的化合物，我們對化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗慢性阻塞性肺病活性進(jìn)行了評價(jià)，其具有抗慢性阻塞性肺病活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為75％和25％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
長期吸煙是最常見的人類COPD致病因素，我們實(shí)驗(yàn)室用香煙誘導(dǎo)模擬小鼠COPD模型，擬研究本發(fā)明組合物對香煙誘導(dǎo)的小鼠COPD的緩解作用。
本發(fā)明目的在于提供本發(fā)明組合物在制備抗COPD疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明組合物在劑量10mg/kg下灌胃給藥，對香煙誘導(dǎo)的COPD小鼠BALF中炎性細(xì)胞因子TNFα的生成有抑制作用；對趨化因子RANTES的分泌有抑制作用；對BALF中的炎性細(xì)胞的募集有抑制作用。
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1化合物Atropurpuran的制備
化合物Atropurpuran(I)的制備方法參照Pei Tang等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的方法。
實(shí)施例2 Atropurpuran的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(312mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液。混合物在35攝氏度攪拌6h。6h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(309mg，74％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),5.23(s,1H),4.87(s,1H),4.83(s,1H),4.39(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,1H),3.58(s,2H),3.01(s,1H),2.27(s,1H),2.15(d,J＝6.3Hz,2H),2.09–2.00(m,5H),1.78(dd,J＝35.2,19.2Hz,2H),1.71–1.65(m,1H),1.41(s,2H),0.99(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.55(s),203.16(s),150.94(s),125.16(s),111.66(s),78.63(s),71.39(s),57.77(s),47.73(s),40.79(s),34.58(s),33.01(s),32.69(s),29.25(s),29.34(s),26.52(s),24.23(s),22.30(s),20.64(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C22H28BrO3:419.1222；found 419.1226.
實(shí)施例3 Atropurpuran的O-(四氫吡咯基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于18mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和吡咯烷(1420mg，20mmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的棕色固體(125mg,61％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),5.15(s,1H),4.61(d,J＝10.5Hz,2H),4.45(s,1H),3.83(s,1H),3.53(s,2H),2.94(s,1H),2.62(s,2H),2.46(s,4H),2.20(s,1H),2.08(d,J＝6.0Hz,2H),2.00–1.91(m,3H),1.75(d,J＝2.1Hz,2H),1.69(s,2H),1.62(d,J＝5.5Hz,5H),1.30(s,2H),0.91(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.65(s),203.36(s),151.04(s),125.36(s),111.76(s),78.83(s),67.20(s),57.97(s),54.33(d,J＝17.1Hz),47.82(s),41.00(s), 34.67(s),32.79(s),29.45(s),29.22(s),26.61(s),25.14(s),24.43(s),22.40(s),20.84(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H36NO3:410.2695；found:410.2699。
實(shí)施例4 Atropurpuran的O-(1H-四氮唑基)乙基衍生物的合成
將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和1H-四氮唑(1401mg，20mmol)，混合物加熱回流4h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。因?yàn)榛プ儺悩?gòu)作用，在反應(yīng)條件下會(huì)生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑基兩種取代產(chǎn)物。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:0.8，v/v)，收集黃色集中洗脫帶，再將洗脫帶濃縮，用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:0.4，v/v)，依次收集兩個(gè)淡黃色的洗脫帶，濃縮前1個(gè)洗脫帶即得到化合物IV的黃色粉末(83.6mg,41％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.51(s,1H),9.74(s,1H),5.05(s,1H),4.61–4.48(m,3H),4.19(s,1H),4.12(s,1H),3.80(s,2H),3.75(s,1H),2.86(s,1H),2.08(s,1H),1.97(d,J＝2.9Hz,2H),1.90–1.81(m,3H),1.69–1.57(m,4H),1.54(s,1H),1.25(s,2H),0.80(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.46(s),203.17(s),150.83(s),144.83(s),125.18(s),111.56(s),78.65(s),66.57(s),57.79(s),47.63(s),46.37(s),40.80(s),34.49(s),32.59(s),29.27(s),29.02(s),26.43(s),24.24(s),22.21(s),20.67(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C23H29N4O3:409.2240；found:409.2244。
實(shí)施例5組合物抗慢性阻塞性肺病實(shí)驗(yàn)
方法：SPF級雌性BALB/c小鼠，18-20g，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、藥物處理組(組合物、化合物III和化合物IV 10mg/kg，灌胃給藥)，每組10只。將小鼠置于4L容器內(nèi)，每日煙熏(南京牌香煙—紅殼，焦油含量小于16mg)，一周五次，連續(xù)四周，每日煙熏前1小時(shí)灌胃給藥，小鼠在末次煙熏后1小時(shí)，以苯巴比妥鈉麻醉，用0.6mL預(yù)冷的PBS緩沖液(pH7.0)肺部灌流，沖洗3次，吸出支氣管肺泡灌洗液(BALF)，250×g離心10min，上清用于分析TNFα、RANTES的含量。細(xì)胞用PBS緩沖液重懸，計(jì)數(shù)，細(xì)胞涂片后用瑞氏-吉姆薩染色，分析BALF中炎性細(xì)胞的變化。
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的75mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的25mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時(shí)用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
實(shí)驗(yàn)例1組合物對COPD小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥介質(zhì)生成抑制作用
(1)組合物對COPD小鼠BALF中TNFα生成抑制作用
前炎性細(xì)胞因子TNFα是COPD的發(fā)病過程中的啟動(dòng)因子。COPD患者的TNFα水平高于正常人，培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞與香煙的煙霧接觸可分泌TNFα。TNFα可促使中性粒細(xì)胞脫顆粒，誘導(dǎo)起到粘膜細(xì)胞增生和高分泌，增加上皮細(xì)胞IL-8生成，增加巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶生成，促進(jìn)氣道高反應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對COPD小鼠BALF中TNFα生成的影響，結(jié)果見表1.
表1組合物對COPD小鼠BALF中TNFα生成的影響
注：*P<0.05，與模型對照組相比；#P<0.05，與正常對照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對COPD模型小鼠灌胃給藥，可顯著降低小鼠BALF中TNFα的生成，而化合物III和化合物IV無此作用。
(2)組合物對COPD小鼠BALF中RANTES分泌抑制作用
炎癥細(xì)胞的遷移受到趨化因子的調(diào)節(jié)，各種結(jié)構(gòu)細(xì)胞核炎性細(xì)胞均可分泌這些小分子蛋白，COPD發(fā)病過程中RANTES分泌增加，趨化單核/巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對COPD小鼠BALF中RANTES分泌的影響，結(jié)果見表2。
表2組合物對COPD小鼠BALF中RANTES分泌的影響
注：*P<0.05，與模型對照組相比；#P<0.01，與正常對照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對COPD模型小鼠灌胃給藥，可降低小鼠BALF中RANTES的分泌，而化合物III和化合物IV無此作用。
實(shí)驗(yàn)例2組合物對COPD小鼠BALF中炎性細(xì)胞募集的抑制作用
(1)組合物對COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的抑制作用
中性粒細(xì)胞在COPD發(fā)病中具有重要作用，它可以釋放兩種絲氨酸蛋白酶，彈性蛋白酶和半胱氨酰蛋白酶-3，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生人類肺氣腫樣的病理變化。中性粒細(xì)胞生命短暫，它循環(huán)招募到氣道以及穿越間隙腔的過程十分迅速。病理研究證明有些COPD患者支氣管組織內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目增加與氣流阻塞的程度有關(guān)。吸煙的COPD患者氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目增加，特別是那些伴有慢性支氣管炎的患者。影響COPD患者肺內(nèi)中性粒細(xì)胞募集的主要因素為IL-8趨化活性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的影響，結(jié)果見表3。
表3組合物對COPD小鼠BALF中中性粒細(xì)胞募集的影響
注：*P<0.05；#P<0.01，與正常對照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對COPD模型小鼠灌胃給藥，可降低小鼠BALF 中中性粒細(xì)胞的募集，而化合物III和化合物IV無此作用。
(2)組合物對COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的抑制作用
吸煙者和COPD患者肺內(nèi)巨噬細(xì)胞較正常人群水平增加，多聚集在肺泡、細(xì)支氣管和小氣道。肺泡壁巨噬細(xì)胞數(shù)目和輕中度肺氣腫以及COPD患者的小氣道疾病程度呈正相關(guān)。組織病變和損傷部位可見到COPD緩慢進(jìn)展和慢性病變與巨噬細(xì)胞長期增加平行。巨噬細(xì)胞可能通過釋放基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致彈性組織降解能力異常增高，誘發(fā)肺氣腫的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诳疾旖M合物對COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的影響，結(jié)果見表4。
表4組合物對COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞募集的影響
注：*P<0.05，與模型對照組相比；#P<0.01，與正常對照組相比。n＝10。
結(jié)果：組合物在10mg/kg下對COPD模型小鼠灌胃給藥，可顯著降低小鼠BALF中巨噬細(xì)胞的募集，而化合物III和化合物IV無此顯著作用。
結(jié)論：組合物在10mg/kg下灌胃給藥，對香煙誘導(dǎo)的小鼠慢性阻塞性肺病過程中的炎性介質(zhì)的生成和趨化因子的分泌有顯著抑制作用，對炎性細(xì)胞的浸潤有顯著的抑制，對慢性阻塞性肺病有顯著的治療作用。而化合物III和化合物IV在10mg/kg下灌胃給藥，對香煙誘導(dǎo)的小鼠慢性阻塞性肺病過程中的炎性介質(zhì)的生成和趨化因子的分泌無顯著抑制作用，對炎性細(xì)胞的浸潤無顯著抑制，對慢性阻塞性肺病無任何治療作用。
實(shí)施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
實(shí)施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。