本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

基于不同的臨床特點(diǎn)，貧血有不同的分類(lèi)。如：按貧血進(jìn)展速度分急、慢性貧血；按骨髓紅系增生情況分增生性貧血(如溶血性貧血、缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞貧血等)和增生低下性貧血(如再生障礙性貧血)。

臨床上常從貧血發(fā)病機(jī)制和病因的分類(lèi)：

1.紅細(xì)胞生成減少性貧血

造血細(xì)胞、骨髓造血微環(huán)境和造血原料的異常影響紅細(xì)胞生成，可形成紅細(xì)胞生成減少性貧血。

(1)造血干祖細(xì)胞異常所致貧血

1)再生障礙性貧血(AA)AA是一種骨髓造血功能衰竭癥，與原發(fā)和繼發(fā)的造血干祖細(xì)胞損害有關(guān)。部分全血細(xì)胞減少癥的發(fā)病機(jī)制與B細(xì)胞產(chǎn)生抗骨髓細(xì)胞自身抗體，進(jìn)而破壞或抑制骨髓造血細(xì)胞有關(guān)。

2)純紅細(xì)胞再生障礙貧血(PRCA)PRCA是指骨髓紅系造血干祖細(xì)胞受到損害，進(jìn)而引起貧血。依據(jù)病因，該病可分為先天性和后天性?xún)深?lèi)。先天性PRCA即Diamond-Blackfan綜合征，系遺傳所致；后天性PRCA包括原發(fā)、繼發(fā)兩類(lèi)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分原發(fā)性PRCA患者血清中有自身EPO或幼紅細(xì)胞抗體。繼發(fā)性PRCA主要有藥物相關(guān)型、感染相關(guān)型(細(xì)菌和病毒，如微小病毒B₁₉、肝炎病毒等)、自身免疫病相關(guān)型、淋巴細(xì)胞增殖性疾病相關(guān)型(如胸腺瘤、淋巴瘤、漿細(xì)胞病和淋巴細(xì)胞白血病等)以及急性再生障礙危象等。

3)先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血(CDA)CDA是一類(lèi)遺傳性紅系干祖細(xì)胞良性克隆異常所致的、以紅系無(wú)效造血和形態(tài)異常為特征的難治性貧血。根據(jù)遺傳方式，該病可分為常染色體隱陛遺傳型和顯性遺傳型。

4)造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病這些疾病造血干祖細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)的異常，包括骨髓增生異常綜合征及各類(lèi)造血系統(tǒng)腫瘤性疾病如白血病等。前者因?yàn)椴B(tài)造血，高增生，高凋亡，出現(xiàn)原位溶血；后者腫瘤性增生、低凋亡和低分化，造血調(diào)節(jié)也受到影響，從而使正常成熟紅細(xì)胞減少而發(fā)生貧血。

(2)造血微環(huán)境異常所致貧血

造血微環(huán)境包括骨髓基質(zhì)，基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子。

1)骨髓基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞受損所致貧血骨髓壞死、骨髓纖維化、骨髓硬化癥、大理石病、各種髓外腫瘤性疾病的骨髓轉(zhuǎn)移以及各種感染或非感染性骨髓炎，均可因損傷骨髓基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞，造血微環(huán)境發(fā)生異常而影響血細(xì)胞生成。

2)造血調(diào)節(jié)因子水平異常所致貧血干細(xì)胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素(IL)、粒-單系集落刺激因子(GM-CSF)、粒系集落刺激因子(G-CSF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、血小板生長(zhǎng)因子(TGF)、腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素(IFN)等均具有正負(fù)調(diào)控造血作用。腎功能不全、肝病和垂體或甲狀腺功能低下等時(shí)產(chǎn)生EPO不足；腫瘤性疾病或某些病毒感染會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較多的造血負(fù)調(diào)控因子如TNF、IFN、炎癥因子等，均可導(dǎo)致慢性病性貧血(ACD)。

(3)造血原料不足或利用障礙所致貧血

造血原料是指造血細(xì)胞增殖、分化、代謝所必需的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、維生素(葉酸、維生素B12等)、微量元素(鐵、銅、鋅等)等。任一種造血原料不足或利用障礙都可能導(dǎo)致紅細(xì)胞生成減少。

1)葉酸或維生素B₁₂缺乏或利用障礙所致貧血由于各種生理或病理因素導(dǎo)致機(jī)體葉酸或維生素B12絕對(duì)或相對(duì)缺乏或利用障礙可引起的巨幼細(xì)胞貧血。

2)缺鐵和鐵利用障礙性貧血這是臨床上最常見(jiàn)的貧血。缺鐵和鐵利用障礙影響血紅素合成，有稱(chēng)該類(lèi)貧血為血紅素合成異常性貧血。該類(lèi)貧血的紅細(xì)胞形態(tài)變小，中央淡染區(qū)擴(kuò)大，屬于小細(xì)胞低色素性貧血。

2.溶血性貧血(HA)

即紅細(xì)胞破壞過(guò)多性貧血。

3.失血性貧血

根據(jù)失血速度分急性和慢性，慢性失血性貧血往往合并缺鐵性貧血?？煞譃槌瞿约膊?如特發(fā)性血小板減少性紫癜、血友病和嚴(yán)重肝病等)所致和非出凝血性疾病(如外傷、腫瘤、結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、消化性潰瘍、痔和婦科疾病等)所致兩類(lèi)。

從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。

本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2009年發(fā)表(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的化合物，我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗紅細(xì)胞低下性貧血活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗紅細(xì)胞低下性貧血活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為35％和65％。

本發(fā)明公開(kāi)的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明組合物在制藥領(lǐng)域中的新的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及組合物作為制備治療紅細(xì)胞低下性貧血藥物中的應(yīng)用。

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 化合物Atropurpuran的制備

化合物Atropurpuran(I)的制備方法參照Pei Tang等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的方法。

實(shí)施例2 Atropurpuran的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(312mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌6h。6h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(309mg，74％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.86(s,1H),5.23(s,1H),4.87(s,1H),4.83(s,1H),4.39(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,1H),3.58(s,2H),3.01(s,1H),2.27(s,1H),2.15(d,J＝6.3Hz,2H),2.09–2.00(m,5H),1.78(dd,J＝35.2,19.2Hz,2H),1.71–1.65(m,1H),1.41(s,2H),0.99(s,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.55(s),203.16(s),150.94(s),125.16(s),111.66(s),78.63(s),71.39(s),57.77(s),47.73(s),40.79(s),34.58(s),33.01(s),32.69(s),29.25(s),29.34(s),26.52(s),24.23(s),22.30(s),20.64(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₂₂H₂₈BrO₃:419.1222；found 419.1226.

實(shí)施例3 Atropurpuran的O-(四氫吡咯基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于18mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和吡咯烷(1420mg，20mmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的棕色固體(125mg,61％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),5.15(s,1H),4.61(d,J＝10.5Hz,2H),4.45(s,1H),3.83(s,1H),3.53(s,2H),2.94(s,1H),2.62(s,2H),2.46(s,4H),2.20(s,1H),2.08(d,J＝6.0Hz,2H),2.00–1.91(m,3H),1.75(d,J＝2.1Hz,2H),1.69(s,2H),1.62(d,J＝5.5Hz,5H),1.30(s,2H),0.91(s,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.65(s),203.36(s),151.04(s),125.36(s),111.76(s),78.83(s),67.20(s),57.97(s),54.33(d,J＝17.1Hz),47.82(s),41.00(s),34.67(s),32.79(s),29.45(s),29.22(s),26.61(s),25.14(s),24.43(s),22.40(s),20.84(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₂₆H₃₆NO₃:410.2695；found:410.2699。

實(shí)施例4 Atropurpuran的O-(1H-四氮唑基)乙基衍生物的合成

將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和1H-四氮唑(1401mg，20mmol)，混合物加熱回流4h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。因?yàn)榛プ儺悩?gòu)作用，在反應(yīng)條件下會(huì)生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑基兩種取代產(chǎn)物。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:0.8，v/v)，收集黃色集中洗脫帶，再將洗脫帶濃縮，用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:0.4，v/v)，依次收集兩個(gè)淡黃色的洗脫帶，濃縮前1個(gè)洗脫帶即得到化合物IV的黃色粉末(83.6mg,41％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.51(s,1H),9.74(s,1H),5.05(s,1H),4.61–4.48(m,3H),4.19(s,1H),4.12(s,1H),3.80(s,2H),3.75(s,1H),2.86(s,1H),2.08(s,1H),1.97(d,J＝2.9Hz,2H),1.90–1.81(m,3H),1.69–1.57(m,4H),1.54(s,1H),1.25(s,2H),0.80(s,3H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.46(s),203.17(s),150.83(s),144.83(s),125.18(s),111.56(s),78.65(s),66.57(s),57.79(s),47.63(s),46.37(s),40.80(s),34.49(s),32.59(s),29.27(s),29.02(s),26.43(s),24.24(s),22.21(s),20.67(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₂₃H₂₉N₄O₃:409.2240；found:409.2244。

實(shí)施例5 組合物抗紅細(xì)胞低下性貧血實(shí)驗(yàn)

一、組合物對(duì)失血小鼠的治療作用

ICR小鼠30只，♀♂各半，均分成5組(n＝10)。除生理鹽水組外，其它組每只小鼠從眼眶靜脈放血0.5ml，24h后再取血測(cè)全部各組指標(biāo)，然后連續(xù)灌胃給藥1周且給藥之后每天放血0.5ml，末次給藥1h后，從眼眶靜脈叢取血用F-800全血小板分析儀進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(10¹²/L)。

組合物的制備：將研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的35mg化合物III的粉末和研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的65mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時(shí)用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

表1 組合物對(duì)因失血所致紅細(xì)胞減少的治療作用

與模型組比較：*p<0.05

結(jié)果表明，放血小鼠經(jīng)服用組合物治療7天后，與模型組比較，其紅細(xì)胞顯著高于模型組，接近生理鹽水組。而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。

二、組合物對(duì)環(huán)磷酰胺致紅細(xì)胞減少的治療作用

對(duì)小鼠骨髓造血功能損傷的防治作用ICR小鼠50只，♀♂兼用，均分成5組(n＝10)，即生理鹽水組、造模組、組合物1.2mg/kg組、化合物III 1.2mg/kg組和化合物IV 1.2mg/kg組，口服給藥，每天1次。第0、5、10日除生理鹽水組外，其它各組小鼠分別腹腔注射環(huán)磷酸胺80mg/kg，然后繼續(xù)給藥3天。于末次給藥后1h，從眼眶靜脈叢取血，測(cè)紅細(xì)胞數(shù)(10¹²/L)。

表2 組合物對(duì)環(huán)磷酰胺所致紅細(xì)胞的影響

與模型組比較：**p<0.01

結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，環(huán)磷酸胺能使小鼠骨髓損傷，造成外周血細(xì)胞下降，組合物組與模型組比較，可明顯對(duì)抗環(huán)磷酸胺所致小鼠紅細(xì)胞下降。而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。

三、組合物對(duì)苯所致紅細(xì)胞減少的治療作用

對(duì)再生障礙性貧血小鼠的影響：昆明種小鼠50只，♀♂兼用，均分成5組(n＝10)，除生理鹽水組外，其它組小鼠皮下注射苯0.5ml/kg，連續(xù)12天，造模的當(dāng)日，同時(shí)口服給藥，每天1次，共18天，末次給藥后1h，眼眶靜脈叢取血，測(cè)紅細(xì)胞。

表3 組合物對(duì)苯所致紅細(xì)胞減少的治療作用

與模型組比較：**p<0.01

結(jié)果表明，組合物組與模型組比較，可明顯對(duì)抗苯所致再生障礙性貧血小鼠紅細(xì)胞的下降。而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。

結(jié)論：組合物能夠顯著升高紅細(xì)胞，可以用來(lái)制備治療貧血的藥物。而化合物III和化合物IV不能夠顯著升高紅細(xì)胞，不能用來(lái)制備治療貧血的藥物。

實(shí)施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。

實(shí)施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。