本發(fā)明涉及飼料添加劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種三文魚飼料添加劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：三文魚屬于硬骨魚綱，鮭形目。鮭亞目，鮭科的種類，被譽(yù)為“魚中至尊”“水中珍品”，屬于冷水性的高度洄游魚類。其肉質(zhì)鮮美，口感頗佳，肉色紅色或鮮橘紅色，富含深海魚油(不飽和脂肪酸Omega-3)、腦黃金(DHA)、二甲氨基乙醇(DMAE)等主要成分，能降低血液里的膽固醇含量，有效防治心、腦血管疾病及減輕因風(fēng)濕、牛皮癬等疾病帶來的痛苦，還可預(yù)防慢性疾病、糖尿病和某些類似的疾病，是有益健康的魚肉食品之一。三文魚味美肉嫩，營養(yǎng)價值高，已成為人們最好的水產(chǎn)品之一。爛鰭病是三文魚最常見的疾病。病魚先是背鰭、尾鰭或胸鰭外緣的上皮增生變白，逐漸向基部擴(kuò)展，最后崩潰、鰭條露出。目前市面上銷售的飼料都是一般的三文魚飼料，沒有治療三文魚的爛鰭病的飼料，更沒有增強(qiáng)其免疫力的飼料。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種三文魚飼料添加劑及制備方法，能提高三文魚的免疫力，同時有效治療爛鰭病。食用本發(fā)明添加劑后的三文魚抗病力強(qiáng)，生長速度快、肉質(zhì)營養(yǎng)豐富，極大增加了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，具有配方簡單、科學(xué)、合理，純天然綠色無殘留，實用性強(qiáng)，無毒副作用，效果顯著的優(yōu)點。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種三文魚飼料添加劑，所述添加劑包括以下組分：小球藻、豆油、梔子、茭白、莧菜、苦瓜、柳橙、連翹、金銀花、砂仁花、甘草、青葉丹、狗蟻草、黃連蜜和油菜花粉。所述添加劑中各原料的重量份數(shù)為：小球藻11-23份、豆油4-9份、梔子8-18份、茭白12-23份、莧菜15-26份、苦瓜13-24份、柳橙15-28份、連翹4-15份、金銀花5-14份、砂仁花0.4-1.1份、甘草6-11份、青葉丹0.4-1.3份、狗蟻草0.5-1.2份、黃連蜜17-28份和油菜花粉10-23份。所述添加劑中各原料的重量份數(shù)為：小球藻14-20份、豆油5-8份、梔子10-15份、茭白15-20份、莧菜18-23份、苦瓜16-21份、柳橙18-24份、連翹6-11份、金銀花7-12份、砂仁花0.4-1.0份、甘草6-10份、青葉丹0.4-0.9份、狗蟻草0.5-1.0份、黃連蜜20-24份和油菜花粉14-20份。所述添加劑中各原料的重量份數(shù)為：小球藻20份、豆油7份、梔子10份、茭白20份、莧菜21份、苦瓜18份、柳橙24份、連翹6份、金銀花12份、砂仁花1.0份、甘草9份、青葉丹0.4份、狗蟻草0.7份、黃連蜜24份和油菜花粉14份。所述添加劑中各原料的重量份數(shù)為：小球藻17份、豆油5份、梔子15份、茭白15份、莧菜18份、苦瓜21份、柳橙22份、連翹11份、金銀花7份、砂仁花0.4份、甘草10份、青葉丹0.9份、狗蟻草0.5份、黃連蜜22份和油菜花粉20份。所述添加劑中各原料的重量份數(shù)為：小球藻14份、豆油8份、梔子13份、茭白18份、莧菜23份、苦瓜16份、柳橙18份、連翹8份、金銀花10份、砂仁花0.7份、甘草6份、青葉丹0.8份、狗蟻草1.0份、黃連蜜20份和油菜花粉17份。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供一種三文魚飼料添加劑的制備方法，其制備方法包括以下步驟：(1)將茭白、苦瓜和柳橙投入粉碎機(jī)粉碎，按所述質(zhì)量份數(shù)取小球藻、粉碎后的茭白、苦瓜和柳橙,混合均勻后得混合物一；(2)按所述質(zhì)量份數(shù)比例取梔子、莧菜、連翹、砂仁花、甘草、青葉丹、狗蟻草和金銀花混合，加入相對于混合物10～12倍的醇體積濃度為90％～95％的乙醇，加熱至沸騰回流3～5小時，過濾，收集濾液，隨后在真空度0.05～0.08Mpa下減壓濃縮至40～50℃時相對密度為1.00～1.04的膏體，噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度160～175℃、出風(fēng)溫度80～85℃，隨后粉碎成粉末，制成干膏粉；(3)取所述質(zhì)量份豆油、黃連蜜、油菜花粉，與步驟(1)得到的混合物一，步驟(2)得到的干膏粉混合均勻得到三文魚飼料添加劑。本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：其成分為兼有藥用和食用雙重作用，可提高三文魚的免疫力，同時有效治療及預(yù)防三文魚爛鰭病。食用本發(fā)明添加劑后的三文魚抗病力強(qiáng)，生長速度快、肉質(zhì)營養(yǎng)豐富，極大增加了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，具有配方簡單、科學(xué)、合理，純天然綠色無殘留，實用性強(qiáng)，無毒副作用，效果顯著的優(yōu)點。具體實施方式本發(fā)明提供了一種三文魚飼料添加劑及制備方法，包括原料有：小球藻、豆油、梔子、茭白、莧菜、苦瓜、柳橙、連翹、金銀花、砂仁花、甘草、青葉丹、狗蟻草、黃連蜜和油菜花粉。小球藻：為小球藻科植物蛋白核小球藻及小球藻的藻體。蛋白質(zhì)含量高達(dá)60％以上，還含有一些特殊成分，如酸性多糖和小球藻生長因子(CGF)，它可激活具有免疫功能的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。豆油：提供能量。梔子：別名黃梔子、黃果樹、山梔子、紅枝子。本品為茜草科植物梔子的干燥成熟果實?？?，寒。心、肺、三焦經(jīng)。果實：瀉火除煩，清熱利尿，涼血解毒。用于熱病心煩，黃疸尿赤，血淋澀痛，血熱吐衄，目赤腫痛，火毒瘡瘍；外治扭挫傷痛。此處用果實。茭白：別名出隧、蘧蔬，綠節(jié)，菰菜、茭首，菰首，菰筍、菰手、茭筍，茭粑，茭瓜、茭耳菜。為禾本科植物菰的花莖經(jīng)茭白黑粉的刺激而形成的紡錘形肥大的菌癭。入肝、脾二經(jīng)。解熱毒，除煩渴，利二便。莧菜：別名雁來紅、老少年、老來少、三色莧，莧科、莧屬一年生草本，莖粗壯，綠色或紅色，常分枝，幼時有毛或無毛。莧菜菜身軟滑而菜味濃，入口甘香，有潤腸胃清熱功效?？喙希何犊?、性寒，歸心、脾、胃經(jīng)。清熱利濕，解毒明目。柳橙：又名：印子柑，拉丁文名：Citrussinensis(L.)Osbeckcv.LiuCheng蕓香科、柑橘屬植物，原產(chǎn)于廣東新會及廣州近郊，主產(chǎn)廣東、廣西、福建和臺灣，四川、重慶、浙江等省(市)也有栽培。含有豐富的維生素C還有蘋果酸，檸檬酸的物質(zhì)。可以清熱排毒，也可以清痰降氣。連翹：別名連殼、黃花條、黃鏈條花、黃奇丹、青翹、落翹。本品為木犀科植物連翹的干燥果實。秋季果實初熟尚帶綠色時采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干，習(xí)稱“青翹”；果實熟透時采收,曬干，除去雜質(zhì)，習(xí)稱“老翹”。苦，微寒。歸肺、心、小腸經(jīng)。清熱解毒，消腫散結(jié)。金銀花：別名銀花、雙花、二花、二寶花。本品為忍冬科植物忍冬、紅腺忍冬、山銀花(毛萼忍冬)或毛花柱忍冬的干燥花蕾或帶初開的花。夏初花開放前采收，干燥。甘，寒。歸肺、心、胃經(jīng)。清熱解毒，涼散風(fēng)熱。砂仁花：為姜科植物陽春砂、綠殼砂或海南砂的干燥花。味辛，性溫。歸脾、胃、腎經(jīng)。化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎。用于脾胃氣滯、脘腹脹滿，嘔惡。甘草：甘，平。歸心、肺、脾、胃經(jīng)。補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥。用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性。青葉丹：別名思茅獐牙菜。為龍膽科植物粵北獐牙菜的全草。夏、秋采集。曬干。性寒，味苦。清熱解毒，舒肝健胃，消炎殺菌。治急性黃疸型肝炎，咽喉炎，扁桃體炎，膀胱炎，尿道炎，流感，感冒，瘧疾。狗蟻草：別名鏈夾豆、練夾豆、小號野花生、山花生。豆科狗蟻草，以全草、根、葉入藥。味甘、苦，性平?；钛ńj(luò)，清熱化濕，駁骨消腫，去腐生肌。黃連蜜：采自我國中草藥自然保護(hù)區(qū)中黃連的花蜜，它繼承了蜂蜜的特點及黃連的藥性，因此不僅有天然蜂蜜的保健營養(yǎng)價值，尤其具有這種名貴中藥的醫(yī)療效果。黃連蜜色澤微黃，香味特別，甜中微苦，甜而不膩，真可謂良藥并不苦口，療效卻依然?；谔赜星鍩犰顫?、瀉火解毒、抗菌消炎之功效和鎮(zhèn)靜、降溫、去火的效果油菜花粉：是濃縮的"完全營養(yǎng)庫",含有豐富的各類維生素，微量元素se、fe、mo、mn等和常量元素mg、ca等等。以下采用實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。實施例1添加劑1一種三文魚飼料添加劑，其中添加劑包括：小球藻20g、豆油7g、梔子10g、茭白20g、莧菜21g、苦瓜18g、柳橙24g、連翹6g、金銀花12g、砂仁花1.0g、甘草9g、青葉丹0.4g、狗蟻草0.7g、黃連蜜24g和油菜花粉14g。添加劑的制備方法包括以下步驟：(1)將茭白、苦瓜和柳橙投入粉碎機(jī)粉碎，按所述質(zhì)量份數(shù)取小球藻、粉碎后的茭白、苦瓜和柳橙,混合均勻后得混合物一；(2)按所述質(zhì)量份數(shù)比例取梔子、莧菜、連翹、砂仁花、甘草、青葉丹、狗蟻草和金銀花混合，加入相對于混合物12倍的醇體積濃度為90％的乙醇，加熱至沸騰回流5小時，過濾，收集濾液，隨后在真空度0.05Mpa下減壓濃縮至50℃時相對密度為1.04的膏體，噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度160℃、出風(fēng)溫度80℃，隨后粉碎成粉末，制成干膏粉；(4)取所述質(zhì)量份豆油、黃連蜜、油菜花粉，與步驟(1)得到的混合物一，步驟(2)得到的干膏粉混合均勻得到三文魚飼料添加劑。實施例2添加劑2一種三文魚飼料添加劑，其中添加劑包括：小球藻17g、豆油5g、梔子15g、茭白15g、莧菜18g、苦瓜21g、柳橙22g、連翹11g、金銀花7g、砂仁花0.4g、甘草10g、青葉丹0.9g、狗蟻草0.5g、黃連蜜22g和油菜花粉20g。添加劑的制備方法包括以下步驟：(1)將所述質(zhì)量份數(shù)的茭白、苦瓜和柳橙投入粉碎機(jī)粉碎，按所述質(zhì)量份數(shù)取小球藻，與粉碎后的茭白、苦瓜和柳橙,混合均勻后得混合物一；(2)按所述質(zhì)量份數(shù)比例取梔子、莧菜、連翹、砂仁花、甘草、青葉丹、狗蟻草和金銀花混合，加入相對于混合物10倍的醇體積濃度為95％的乙醇，加熱至沸騰回流3小時，過濾，收集濾液，隨后在真空度0.08Mpa下減壓濃縮至40℃時相對密度為1.00的膏體，噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度175℃、出風(fēng)溫度85℃，隨后粉碎成粉末，制成干膏粉；(3)取所述質(zhì)量份豆油、黃連蜜、油菜花粉，與步驟(1)得到的混合物一，步驟(2)得到的干膏粉混合均勻得到三文魚飼料添加劑。實施例3添加劑3一種三文魚飼料添加劑，其中添加劑包括：小球藻14g、豆油8g、梔子13g、茭白18g、莧菜23g、苦瓜16g、柳橙18g、連翹8g、金銀花10g、砂仁花0.7g、甘草6g、青葉丹0.8g、狗蟻草1.0g、黃連蜜20g和油菜花粉17g。添加劑的制備方法包括以下步驟：(1)將所述質(zhì)量份數(shù)的茭白、苦瓜和柳橙投入粉碎機(jī)粉碎，按所述質(zhì)量份數(shù)取小球藻，與粉碎后的茭白、苦瓜和柳橙,混合均勻后得混合物一；(2)按所述質(zhì)量份數(shù)比例取梔子、莧菜、連翹、砂仁花、甘草、青葉丹、狗蟻草和金銀花混合，加入相對于混合物11倍的醇體積濃度為95％的乙醇，加熱至沸騰回流4小時，過濾，收集濾液，隨后在真空度0.06Mpa下減壓濃縮至50℃時相對密度為1.02的膏體，噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度170℃、出風(fēng)溫度85℃，隨后粉碎成粉末，制成干膏粉；(3)取所述質(zhì)量份豆油、黃連蜜、油菜花粉，與步驟(1)得到的混合物一，步驟(2)得到的干膏粉混合均勻得到三文魚飼料添加劑。安全性試驗1、急性毒性試驗(1)試驗動物、飼料及飼養(yǎng)清潔級昆明種小白鼠，體重18-22g，20只，雌雄各半。由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。全價營養(yǎng)生長飼料由廣州大臺農(nóng)飼料有限公司提供。黑龍江省疾病控制中心Ⅱ級動物房，人工晝夜節(jié)律，溫度：24±2℃，濕度：45±5％。(2)試驗及試劑羧甲基纖維素(分析純)，用蒸餾水配制成0.5％懸浮液待用。(3)試驗方法試驗方法選用最大耐受量法。取20只體重為18-22g健康的清潔級昆明種小白鼠，雌雄各10只。試驗前禁食16h(隔夜)，不禁水。取5g本發(fā)明實施例1中的添加劑1，用0.4％羧甲基纖維素稀釋至18mL。分上、下午間隔4h二次經(jīng)口灌胃，第二次灌胃后2h進(jìn)食，總灌胃劑量為10g·(kg·bw)-1。連續(xù)觀察14d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。2、致突變性試驗2.1試驗菌株TA97、TA98、TA100、TA102四株鼠傷寒沙門氏菌。由黑龍江省疾病控制中心提供。2.2試驗動物及試劑(1)Ames試驗：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配制：牛肉膏2.4g，蛋白胨5.0g，氯化鈉2.4g，磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)1.2g，蒸餾水500mL。加熱溶解將上述試劑，調(diào)pH至7.4，分裝、滅菌(0.103MPa，20min)，普通冰箱保存?zhèn)溆?不超過半年)。磷酸鹽貯備液配制：磷酸氫鈉氨(NaNH4HPO4·4H2O)17.4g，檸檬酸(C6H8O7·H2O)10.0g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)50.0g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.0g。硫酸鎂待其他試劑完全溶解后再緩緩放入，使其繼續(xù)溶解(否則會析出沉淀)。1.5％瓊脂培養(yǎng)基配制：瓊脂Agar6.0g，滴入蒸餾水至400mL，上述試劑融化后0.102MPa滅菌25min。底層培養(yǎng)基配制：滅菌瓊脂培養(yǎng)基(80℃)400mL，磷酸鹽貯備液7mL，40％葡萄糖溶液20mL，在容器中依次加入上述試劑，充分混勻，待溫度降至80℃左右時倒平皿，每皿25mL，37℃培養(yǎng)過夜的同時除去水分，然后檢查有無污染。頂層瓊脂配制：瓊脂3.0g，氯化鈉2.5g，滴入蒸餾水至500Ml。0.5mmol/L組氨酸-生物素溶液配制：D-生物素D-Biotin(分子量244)30.4mg，L-組氨酸L-Histidine(分子量155)19.3mg，滴入蒸餾水至250mL10％S-9混合液的配制：磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH7.4)6mL，氯化鉀溶液(1.65mol/L)0.2mL，氯化鎂溶液(0.4mol/L)0.2mL，葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液(0.05mol/L)1.0mL，輔酶-Ⅱ溶液(0.0025mol/L)1.5mL，肝S-9液1.0mL混勻，臨用時配制，置水浴中待用。肝S-9液由黑龍江省疾病控制中心提供。標(biāo)準(zhǔn)誘變劑分別為敵克松、疊氮鈉、2-乙酰氨基芴、1、8-二羥蒽醌，由黑龍江省疾病控制中心提供。(2)微核試驗50只清潔級昆明種小白鼠，體重25-30g，雌雄各半。由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。全價營養(yǎng)生長飼料由廣州大臺農(nóng)飼料有限公司提供。人工晝夜節(jié)律，溫度：24±2℃，濕度：45±5％。小牛血清：小牛血清慮菌后放入恒溫水浴中，56℃滅活1h。滅活后將其儲存于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＜匪_(Giemsa)染液：稱取Giemsa3.8g，加入375ml甲醇(分析純)研磨，待完全溶解后，再加入125ml甘油。置于37℃恒溫箱48h震搖數(shù)次。過濾，靜置兩周后用。吉姆薩(Giemsa)應(yīng)用液：取一份Giemsa染液與6份磷酸鹽緩沖液混合而成。臨用時配制。1/15moL/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)配制：磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.50g，磷酸二氫鈉(Na2HPO4·12H2O)11.78g，滴入蒸餾水至1000mL，全部試劑除注明外，均為分析純，試驗用水為蒸餾水。(3)精子畸形試驗50只清潔級昆明種雄性小白鼠，體重25-35g。由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。全價營養(yǎng)生長飼料由廣州大臺農(nóng)飼料有限公司提供。人工晝夜節(jié)律，溫度：24±2℃，濕度：45±5％。甲醇。1％～2％伊紅染色液：稱取伊紅1～2g，溶于100mL蒸餾水備用。全部試劑除標(biāo)明外，均為分析純，試驗用水為蒸餾水。2.3試驗方法2.3.1Ames試驗(1)原理：鼠傷寒沙門氏菌的突變型(即組氨酸缺陷型)菌株在有組氨酸條件下的培養(yǎng)基上可以正常生長，在無組氨酸存在的培養(yǎng)基上不能生長。但若有致突變物存在于無組氨酸的培養(yǎng)基中時，則沙門氏菌突變型可回復(fù)突變?yōu)橐吧?表現(xiàn)型)，因而可以生長于無組氨酸的培養(yǎng)基上，所以可根據(jù)菌落形成數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)來判斷受試物致突性的強(qiáng)弱。一些特殊的受試物需要經(jīng)過代謝活化系統(tǒng)處理后才能使沙門氏菌突變型回復(fù)突變?yōu)橐吧停x活化系統(tǒng)采用S-9混合液(制備方法：利用多氯聯(lián)苯(Polychlorinatedbiphenyl,PCB)誘導(dǎo)大鼠肝勻漿(S-9))。(2)試驗菌株：采用TA97、TA98、TA100、TA102四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株，TA97和TA98可以檢測各種移碼型誘變劑；TA100可檢測引起堿基對置換的誘變劑；TA102能檢測出其他測試菌株不能檢出或極少檢出的某些誘變劑。(3)5個本發(fā)明實施例1中的添加劑1劑量分別為5000、1000、200、40和8μg/皿.(4)增菌培訓(xùn)取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5ml,加入無菌小三角瓶或無菌試管中，將冷凍保存的菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩(100次/min)培養(yǎng)10h至對數(shù)增長期，每毫升活菌數(shù)多于1×109～2×109個，用黑紙包裹培養(yǎng)瓶，以防細(xì)菌被光線照射。(5)準(zhǔn)備數(shù)個底層培養(yǎng)基平皿。(6)將頂層培養(yǎng)基融化并分裝于無菌小試管，每管2ml，保溫于45℃水浴鍋中。(7)將0.1ml的測試菌株新鮮增菌液依次加入保溫的頂層培養(yǎng)基中，混勻；然后滴入0.1ml受試物(活化時另加入0.5ml10％S-9混合液)，再混勻，快速倒在底層培養(yǎng)基上，并使其在底層上均勻分布，平放固化，無菌箱中(37℃)培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。(8)另做溶劑對照(即陰性對照，蒸餾水0.1ml/皿)和陽性對照(分別采用疊氮鈉1.5μg/皿、敵克松50μg/皿、2-乙酰氨基芴10μg/皿、1,8-二羥蒽醌50μg/皿)。溶劑對照加滅菌蒸餾水；陽性對照不加受試物，只加標(biāo)準(zhǔn)誘變劑；其他方法同上。重復(fù)兩次。2.3.2微核試驗表1微核試驗設(shè)計(n＝10)劑量組劑量(g·(kg·bw·d)-1)陰性組0.5％羧甲基纖維素低劑量組0.5中劑量組5高劑量組9陽性組0.04按30h給受試物法給藥，陽性對照組用環(huán)磷酸胺一次腹腔注射0.04g·(kg·bw)-1，其余各組灌胃，2次給藥間隔24h，第2次給藥后6h處死動物。制片：在第2次給藥6h后將小鼠脫頸椎處死，取小鼠脊椎，剔去肌肉，剪開一端的骨椎，用尖嘴鉗擠出骨髓滴到小牛血清(0.05mL，置于載玻片上)中。推片：混勻后，推片若干張，靜置干燥。固定：用甲醇溶液將干燥的涂片固定5～10min，取出晾干。當(dāng)日不染色的涂片亦應(yīng)固定后保存。染色：用1:10的吉姆薩-磷酸緩沖液(pH為6.4)染色固定好的涂片15～30min。用蒸餾水沖洗，干燥后待檢。每只小白鼠計數(shù)1000個PCE(Poiychromaticerythrocytes，PCE)，微核率以‰表示；另外，在計數(shù)PCE時，同時計數(shù)RBC(Redbloodcellcount，RBC)數(shù)，計算PCE/RBC值。2.3.3精子畸形試驗表2精子畸形試驗設(shè)計(n＝10)劑量組劑量(g·(kg·bw·d)-1)陰性組0.5％羧甲基纖維素低劑量組0.5中劑量組5高劑量組10陽性組0.04每日染毒一次，連續(xù)5d，每天記錄體重、進(jìn)食量和攝入添加劑量。陽性對照組采用0.04g·(kg·bw·d)-1環(huán)磷酰胺進(jìn)行腹腔注射，本發(fā)明實施例1添加劑1的給藥方式為灌胃。試驗結(jié)束時要求每組至少有5只存活動物。精子采樣與鏡檢：于首次給受試物后第5周(35d)將小鼠用頸椎脫臼法處死，打開腹腔，摘取兩側(cè)附睪，放入小平皿中(盛有約2ml生理鹽水)。將附睪以眼科剪剪碎(不能太碎)。將組織碎片用四層擦紙濾去。濾液離心5min(1000～1500r/min)。留存約0.5ml液體，其余上清液棄除，將其與沉淀物搖勻后，在潔凈的載玻片上滴1滴進(jìn)行涂片(一般每只小鼠做4～5張涂片)。涂片在空氣中干燥后，采用甲醇溶液固定5min。用2％伊紅溶液在其自然干燥后染色1h，用水輕沖，干燥待檢。在低倍鏡下找到精子重疊較少、背景清晰的部分，用高倍鏡順序檢查精子，并計數(shù)。凡不完整，輪廓不清，或重疊，或明顯屬人為剪碎者均不計算。一個精子只計其中較為明顯的一種畸形。精子的畸形主要表現(xiàn)在頭部，其次在尾部，畸形類型有香蕉形、無定形、無鉤、胖頭、雙頭、雙尾、尾折疊等。記錄異常的精子數(shù)和異常類型，并計算畸形類型的精子構(gòu)成比。每鼠計1000個完整精子，畸形率以‰表示。精子畸形率(‰)＝精子畸形總數(shù)/檢查精子總數(shù)×10003、慢性和亞慢性試驗3.1試驗動物、飼料及飼養(yǎng)3.1.1大鼠30d喂養(yǎng)試驗清潔級Wistar大白鼠，體重150-180g，80只，雌雄各半。由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。全價營養(yǎng)生長飼料由北京澳協(xié)力飼料有限公司提供。Ⅱ級動物房，人工晝夜節(jié)律，溫度：24±2℃，濕度：45±5％。3.1.2蛋雞56d喂養(yǎng)試驗29周齡海賽蛋雞240只，由哈爾濱益農(nóng)禽業(yè)提供?；A(chǔ)飼糧由哈爾濱華達(dá)飼料廠提供。蛋雞飼養(yǎng)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗實習(xí)基地蛋雞舍。3.2試驗試劑普通化學(xué)試劑：甲醛、石蠟、乙醇、二甲苯、蘇木精、伊紅、丙酮、磷酸鹽緩沖液等。生化指標(biāo)測定試劑盒：谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxalacetictransaminease，GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvictransaminase，GPT)、尿素氮(Ureanitrogen，BUN)、肌酐(Creatinine，CRE)、膽固醇(Cholesterol，CHO)、血糖(Glucose，GLU)、TG、白蛋白(Albumin，ALB)、總蛋白(Totalprotein，TP)測試試劑盒均購自中生北控(生產(chǎn)批號：100731)血細(xì)胞分析儀測試試劑：染色劑(STROMATOLYSER-4DSFFS-800A)、血蛋白檢測試劑(SULFOLYSERSLS-210A1015)、嗜堿性粒細(xì)胞和白細(xì)胞檢測試劑(STROMATOLYSER-FBR1039)、稀釋液(PK-30LG2109)。全部試劑均為分析純，試驗用水為蒸餾水。3.3試驗方法3.4.1大鼠30d喂養(yǎng)試驗表3大鼠30d喂養(yǎng)試驗設(shè)計(n＝20)組別處理對照組全價飼料低劑量組全價飼料+0.4％本發(fā)明實施例1添加劑1中劑量組全價飼料+2％本發(fā)明實施例1添加劑1高劑量組全價飼料+10％本發(fā)明實施例1添加劑1動物購入隔離喂養(yǎng)1周后供試驗用，每組雌雄各半。試驗動物自由采食、自由飲水。(1)血液指標(biāo)：一般性指標(biāo)：觀察大鼠的采食、飲水、發(fā)病及死亡等情況，每日早晚兩次，體重和飼料每周各稱一次，并計算平均增重、采食量、始重、末重及飼料利用率。血液學(xué)指標(biāo)：30d喂養(yǎng)結(jié)束后，采血液樣品，測定紅細(xì)胞(Redbloodcellcount，RBC)、白細(xì)胞(Whitebloodcellcount，WBC)、血紅蛋白(Hemoglobin，HGB)、淋巴細(xì)胞數(shù)(Lymphocyte，LYM)及白細(xì)胞分類。生化指標(biāo)：30d喂養(yǎng)結(jié)束后，采集大鼠血液樣品離心取血清，測定GOT、GPT、BUN、CRE、CHO、GLU、TG、ALB、TP。(2)病理學(xué)檢查：尸檢：觀察并記錄各系統(tǒng)器官、組織的肉眼變化，典型病變拍照。臟器系數(shù)：心臟、肝臟、腎臟、脾臟、睪丸或卵巢等組織及體重稱重，并計算臟器系數(shù)。組織學(xué)檢查：在上述解剖試驗動物以肉眼觀察變化的同時，取心臟、腎臟、脾臟、肝臟、胃、睪丸或卵巢等臟器組織1～2塊，以甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE(HEmatine，HE)染色，顯微鏡下觀察并記錄組織學(xué)變化。3.4.2蛋雞56d喂養(yǎng)試驗表4蛋雞56d喂養(yǎng)試驗設(shè)計(n＝60)組別處理對照組基礎(chǔ)飼糧低劑量組基礎(chǔ)飼糧+0.4％本發(fā)明實施例1添加劑1中劑量組基礎(chǔ)飼糧+2％本發(fā)明實施例1添加劑1高劑量組基礎(chǔ)飼糧+10％本發(fā)明實施例1添加劑1動物購入后在本試驗條件下適應(yīng)7天后再開始試驗。試驗動物自由采食、自由飲水。(1)血液指標(biāo)：一般性指標(biāo)：觀察蛋雞的采食、飲水、發(fā)病及死亡等情況，每日早晚兩次，對蛋重和飼料每天各稱一次，并計算料蛋比、產(chǎn)蛋率。血液學(xué)指標(biāo)：在56天喂養(yǎng)結(jié)束后，對蛋雞進(jìn)行采血測定RBC、WBC、HGB、LYM。生化指標(biāo)：在56天喂養(yǎng)結(jié)束后，對蛋雞進(jìn)行采集血液離心取血清測定GOT、GPT、BUN、CRE、CHO、GLU、TG、ALB、TP。(2)病理學(xué)檢查：尸檢：肉眼觀察并記錄各系統(tǒng)器官、組織的變化，典型病變拍照。臟器系數(shù)：稱心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胰腺、腺胃、肌胃等組織重及體重。組織學(xué)檢查：在上述解剖試驗動物以肉眼觀察變化的同時，取肝臟、脾臟、腎臟、腺胃等臟器組織1～2塊以甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察并記錄組織學(xué)變化。3.4數(shù)據(jù)處理結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。急性毒性試驗、大白鼠30d喂養(yǎng)試驗和蛋雞56d喂養(yǎng)試驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差(one-wayANOVA)分析；Ames試驗結(jié)果和小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗結(jié)果均進(jìn)行卡方檢驗；小鼠精子畸形試驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和Duncan′s法多重比較。P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。4、結(jié)果與分析4.1急性毒性表5急性毒性由表5可見，試驗結(jié)束后，所有小鼠在試驗期間全部無異常，飲水、采食及糞便均正常，全部存活；兩種性別小鼠的體重增重未見顯著差異(P>0.05)。在試驗結(jié)束后將全部小鼠脫頸處死，解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、胃、腎、胸腺等臟器均未出現(xiàn)異常病理變化。結(jié)果表明，本發(fā)明實施例1添加劑1的LD50>10mg·(kg·bw)-1，屬于實際無毒類物質(zhì)。4.2致突變性4.2.1Ames試驗由表6、7、8、9可見，與陰性對照組相比，在加與不加S-9情況下兩次Ames試驗陽性對照組回復(fù)突變菌落數(shù)極顯著增高(P<0.01)，本發(fā)明實施例1添加劑1各劑量組回復(fù)突變菌落數(shù)無顯著差異(P>0.05)，無劑量反應(yīng)關(guān)系，即此劑量下本發(fā)明實施例1添加劑1對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陰性。表6本發(fā)明實施例1添加劑1對回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第一次試驗，-S9)注：同列中*表示差異極顯著(P<0.01)。表7、8、9同表7本發(fā)明實施例1添加劑1對回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第一次試驗，+S9)表8本發(fā)明實施例1添加劑1對回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第二次試驗，-S9)表9本發(fā)明實施例1添加劑1對回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第二次試驗，+S9)4.2.2小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗表10小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(n＝10)注：同列中肩標(biāo)*者表示差異極顯著(P<0.01)由表10可見，與陰性對照組相比，陽性對照組微核率極顯著提高(P<0.01)，雌、雄小鼠本發(fā)明實施例1添加劑1各組微核率均無顯著差異(P>0.05)，說明在此劑量下本發(fā)明實施例1添加劑1對小鼠骨髓細(xì)胞微核率無顯著影響，即本試驗結(jié)果為陰性。此外，除陽性對照組外，本發(fā)明實施例1添加劑1各組與陰性對照組相比PCE/RBC無顯著差異(P>0.05)，說明此劑量下本發(fā)明實施例1添加劑1對試驗動物未見細(xì)胞毒性作用。4.2.3小鼠精子畸形試驗由表11可見，各組小鼠均有一定數(shù)量的畸形精子出現(xiàn)，與陰性對照組相比，陽性對照組精子畸形率極顯著提高(P<0.01)，本發(fā)明實施例1添加劑1各組差異均不顯著(P>0.05)，無劑量反應(yīng)關(guān)系，說明在此劑量下本發(fā)明實施例1添加劑1對小鼠精子畸形發(fā)生率沒有影響。表11小鼠精子畸形試驗(n＝10)注：同列中肩標(biāo)*者表示差異極顯著(P<0.01)4.3慢性和亞慢性4.3.1大鼠30d喂養(yǎng)試驗4.3.1.1一般性指標(biāo)表12大鼠30d喂養(yǎng)試驗體重增重、進(jìn)食量、食物利用率(n＝10)由表12可見，本發(fā)明實施例1添加劑1喂飼大鼠30d后體重增重、總進(jìn)食量以及食物利用率與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。4.3.1.2血液學(xué)指標(biāo)表13大鼠30d喂養(yǎng)試驗血液學(xué)指標(biāo)(1)(n＝10)表14大鼠30d喂養(yǎng)試驗血液學(xué)指標(biāo)(2)(n＝10)由表13和14可見，與對照組相比，本發(fā)明實施例1添加劑1飼喂大鼠30d后雌雄大鼠的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白以及白細(xì)胞分類計數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。4.3.1.3血液生化指標(biāo)表15大鼠30d喂養(yǎng)試驗血液生化指標(biāo)(1)(n＝10)表16大鼠30d喂養(yǎng)試驗血液生化指標(biāo)(2)(n＝10)由表15和16可見，與對照組相比，本發(fā)明實施例1添加劑1飼喂大鼠30d后雌雄大鼠的9項血液生化指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)。4.3.1.4病理學(xué)檢查(1)大體觀察試驗結(jié)束后解剖各組大鼠進(jìn)行肉眼尸檢。各組大鼠氣管、心臟、胸主動脈、肝、腎、腎上腺、脾、胃、盲腸、結(jié)腸、直腸、胰腺、部分腸系膜淋巴結(jié)、乳腺、十二指腸、空腸、前列腺、睪丸、附睪精囊或卵巢、子宮、陰道、坐骨神經(jīng)、膀胱、皮膚等組織均未見明顯異常。表17大鼠30d喂養(yǎng)試驗臟器體重比(1)(n＝10)表18大鼠30d喂養(yǎng)試驗臟器體重比(2)(n＝10)由表17、18可見，本發(fā)明實施例1添加劑1飼喂大鼠30d后與對照組雌雄大鼠的臟器體重比相比差異均不顯著(P>0.05)。(2)臟器組織病理檢查試驗結(jié)束后對所有大鼠心臟、肝臟、脾、腎、胃、睪丸或卵巢進(jìn)行HE染色。顯微鏡下觀察，各劑量組與對照組相比未見任何明顯異常4.3.2蛋雞56d喂養(yǎng)試驗4.3.2.1一般性指標(biāo)由表19可見，與對照組相比，蛋雞經(jīng)56d本發(fā)明實施例1添加劑1飼喂后日采食量、平均蛋重差異均不顯著(P>0.05)；平均產(chǎn)蛋率顯著提高，料蛋比顯著降低(P<0.05)，表明適當(dāng)劑量本發(fā)明實施例1添加劑1能夠提高蛋雞的生產(chǎn)性能。表19蛋雞喂養(yǎng)試驗一般性指標(biāo)(n＝60)注：同行中肩上字母不同者表示差異顯著(P<0.05)4.3.2.2血液學(xué)指標(biāo)由表20可見，與對照組相比，蛋雞經(jīng)56d本發(fā)明實施例1添加劑1飼喂后白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞平均體積、平均紅細(xì)胞血色素、紅細(xì)胞平均蛋白濃度、血小板差異均不顯著(P>0.05)。表20蛋雞喂養(yǎng)試驗血液學(xué)指標(biāo)(n＝60)4.3.2.3血液生化指標(biāo)表21蛋雞喂養(yǎng)試驗血液生化指標(biāo)(n＝60)注：同行中肩上標(biāo)注*者表示差異顯著(P<0.05)由表21可見，與對照組相比，高劑量組蛋雞血液BUN水平顯著降低(P<0.05)，其他指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。4.3.2.4病理學(xué)檢查(1)大體觀察試驗結(jié)束后，對各組蛋雞解剖，進(jìn)行肉眼尸檢。各組蛋雞的主要臟器氣管、心臟、肝、腎、腎上腺、脾、胃、盲腸、結(jié)腸、直腸、胰腺、部分腸系膜淋巴結(jié)、十二指腸、卵巢、子宮、皮膚等經(jīng)肉眼觀察，未見明顯異常。表22蛋雞喂養(yǎng)試驗臟器體重比(n＝60)項目對照組低劑量組中劑量組高劑量組心臟體重比3.69±0.514.22±0.562.49±0.133.74±0.59肝臟體重比23.79±4.8826.28±3.3823.51±3.6827.09±6.01腎體重比6.02±1.037.13±0.316.33±0.587.27±0.37脾體重比1.23±1.020.94±0.121.02±0.120.71±0.72法氏囊體重比1.19±0.490.95±0.180.59±0.500.52±0.32腺胃體重比4.19±0.423.91±0.313.40±0.714.24±0.28肌胃體重比16.24±1.1415.93±1.1514.28±2.9817.65±2.18由表22可見，與對照組相比，本發(fā)明實施例1添加劑1各組蛋雞臟器體重差異均不顯著(P>0.05)。(2)臟器組織病理檢查蛋雞肝臟、脾、腎、腺胃經(jīng)HE染色，在顯微鏡下觀察，各劑量組與對照組相比較均未見任何明顯異常綜上實驗結(jié)果:1.本發(fā)明實施例1添加劑1的半數(shù)致死量大于10g·(kg·bw)-1，屬于實際無毒類物質(zhì)。2.本試驗條件下，本發(fā)明實施例1添加劑1沒有致突變性。3.本試驗條件下，本發(fā)明實施例1添加劑1對大鼠和蛋雞沒有慢性和亞慢性毒性，并可提高蛋雞的生產(chǎn)性能。綜上所述，本試驗結(jié)果提示，本試驗條件下，本發(fā)明實施例1添加劑1既沒有急性毒性、致突變性，也沒有慢性或亞慢性毒性，本發(fā)明實施例1添加劑1在適當(dāng)?shù)膭┝肯峦耆梢宰鳛橐环N綠色、天然、安全的功能性飼料添加劑，并應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中。本發(fā)明的實施例2和實施例3的添加劑同樣進(jìn)行了上述試驗，同樣證明本發(fā)明實施例2和實施例3的添加劑既沒有急性毒性、致突變性，也沒有慢性或亞慢性毒性，在適當(dāng)?shù)膭┝肯峦耆梢宰鳛橐环N綠色、天然、安全的功能性飼料添加劑，并應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中。對比試驗：1、試驗用魚選取某三文魚養(yǎng)殖場。挑選外觀正常、體質(zhì)健壯、大小均勻的三文魚800尾。該魚場水溫16-22℃。2、試驗分組及日糧將該800尾三文魚隨機(jī)分為4組，每組200尾，4組分別為添加劑1組、添加劑2組、添加劑3組和對比組。添加劑1組：本發(fā)明的三文魚實施例1添加劑與基礎(chǔ)飼料以5:10000的比例混合均勻。添加劑2組：本發(fā)明的三文魚實施例2添加劑與基礎(chǔ)飼料以5:10000的比例混合均勻。添加劑3組：本發(fā)明的三文魚實施例3添加劑與基礎(chǔ)飼料以5:10000的比例混合均勻。對比組：基礎(chǔ)飼料。3、試驗日常管理將該4組三文魚分別放養(yǎng)3.12m*1.42m*1.5m的水池中，每組一池，4個水池相鄰排列。日投餌3次，分別于8：00,12：00,16：30進(jìn)行，日投餌量為體重的2％。保持池中清水不斷流動。每天清理池底淤物1次，隨時保持水質(zhì)清新。每天仔細(xì)觀察水池內(nèi)三文魚的活動情況，詳細(xì)記錄各水池的實際投喂量，如果魚有死亡，做好記錄，并且定時測定水溫。試驗90天。4、指標(biāo)測定飼養(yǎng)試驗開始時以及結(jié)束時，分別從每個水池隨機(jī)抽取10尾三文魚于清晨7：30稱重1次，計算平均體重。尾絕對增重/g＝試驗魚結(jié)束尾重-試驗魚開始尾重相對增重率/％＝(尾絕對增重/試驗開始尾重)*100％特定生長率/％＝(ln試驗魚結(jié)束平均體重-ln試驗魚開始平均體重)/試驗天數(shù)*100％飼料系數(shù)＝總投餌量/總增重存活率/％＝(試驗結(jié)束魚尾數(shù)/試驗開始魚尾數(shù))*100％5、血細(xì)胞吞噬活力的檢測用無菌生理鹽水沖洗過活化的白色念珠菌斜面，經(jīng)過來活制成1.4*107/ml的菌懸液。將飼喂上述4組90天的三文魚進(jìn)行接種試驗，每組隨機(jī)取20尾三文魚，于三文魚背部進(jìn)行肌肉注射接種0.6ml的菌懸液。1h后用1ml注射器采血并按常規(guī)方法制作血液涂片玻片，染色，檢測100個血細(xì)胞，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。計算公式如下：吞噬百分比(PP)＝100個血細(xì)胞中參吞噬的細(xì)胞數(shù)/100*100％吞噬指數(shù)(PI)＝100個參與吞噬的細(xì)胞內(nèi)的真菌總數(shù)/100實驗結(jié)果如下：表23四組三文魚生長情況分組增重率/％特定生長率/％飼料系數(shù)成活率/％添加劑1組187.4b4.11.62100添加劑2組185.6b4.01.63100添加劑3組185.1b3.981.63100對比組143.8a3.01.8796注：同列字母相同表示無顯著差異(P>0.05)；字母不同，則有顯著差異(P<0.05)。從以上數(shù)據(jù)可以看出本發(fā)明實施例所得添加劑與普通飼料相比，增重效果明顯，生長迅速，成活率高.表24試驗前后血細(xì)胞吞噬活力的檢測注：同行字母相同表示無顯著差異(P>0.05)；字母不同，則有顯著差異(P<0.05)。從以上數(shù)據(jù)可以看出本發(fā)明實施例所得添加劑與普通飼料相比，免疫力得到了極大的提高。6、選取該三文魚養(yǎng)殖場中患有爛鰭病的病魚100尾，為4組，每組25尾。4組分別為添加劑1組：本發(fā)明的三文魚實施例1添加劑與基礎(chǔ)飼料以1:1000的比例混合均勻。添加劑2組：本發(fā)明的三文魚實施例2添加劑與基礎(chǔ)飼料以1:1000的比例混合均勻。添加劑3組：本發(fā)明的三文魚實施例3添加劑與基礎(chǔ)飼料以1:1000的比例混合均勻。對比組：普通添加劑組的對比組。將4組三文魚分別放養(yǎng)在1.0m*1.0m*0.5m的網(wǎng)箱中，試驗期為4天。日常的飼養(yǎng)管理、病害防治等工作按常規(guī)養(yǎng)殖管理的方法。日投餌3次，分別于8：00,12：00,16：30進(jìn)行，日投餌量為體重的2％。保持池中清水不斷流動。每天清理池底淤物1次，隨時保持水質(zhì)清新。每天仔細(xì)觀察水池內(nèi)三文魚的活動情況，詳細(xì)記錄各水池的實際投喂量，如果魚有死亡，做好記錄，并且定時測定水溫。試驗4天。癥狀：背鰭、尾鰭或胸鰭外緣的上皮增生變白，逐漸向基部擴(kuò)展，最后潰爛、鰭條露出。療效判定：痊愈：鰭部潰爛面愈合，發(fā)育正常；有效：鰭部潰爛面潰爛程度減輕；無效：鰭部潰爛面惡化，鰭條露出。實驗結(jié)果：表25將100尾病三文魚飼喂4天后結(jié)果以上實驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明實施例所得添加劑與普通添加劑相比，可以顯著提高三文魚的免疫力及抗病能力，對治療三文魚的病效果相當(dāng)顯著，具有獨特的見效快、療程短、無毒副作用的優(yōu)勢。綜上實驗結(jié)果，本發(fā)明所得三文魚添加劑相對于普通添加劑，能明顯的提高三文魚的免疫力，極大提高了三文魚生長速度，同時可有效治療三文魚爛鰭病，提高了三文魚的經(jīng)濟(jì)價值。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3