本發(fā)明屬于疫苗制備領域，具體涉及一種雞包涵體肝炎滅活疫苗及其制備方法。
背景技術：
：雞包涵體肝炎特征為病雞死亡突然增多，嚴重貧血、黃疸，肝腫大，有出血和壞死灶，心包積液。本病多發(fā)于4-10周齡的雞，5周齡雞最易感，產(chǎn)蛋雞則很少發(fā)病，肉雞多發(fā)。該病的致病原屬于禽腺病毒I群，有12個血清型，1951年美國首次報道該病，隨著我國雞養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，近年來該病在我國肉雞養(yǎng)殖區(qū)呈局部流行趨勢，通過對萬方和維普數(shù)據(jù)庫搜索，近2年該病以血清4型流行為主。該病目前無疫苗預防，肉雞臨床發(fā)生包涵體肝炎時常見的抗病毒和抗菌治療效果不佳，治愈率低于40％，耐過雞發(fā)育受阻，與正常肉雞比較，料肉比高7-13％，出欄時間延長7-12天，發(fā)育不整齊，嚴重影響經(jīng)濟效益。技術實現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有雞包涵體肝炎無法用疫苗預防的問題，本發(fā)明提出一種雞包涵體肝炎病毒，該病毒與轉移因子制備成疫苗能夠有效防控該病毒引起的疾病。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：一種雞包涵體肝炎病毒，所述病毒為禽腺病毒I群血清4型病毒，命名為SDJ15-8，其保藏號為CCTCCNO:V201636，保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由本公司于2014年3月從山東濟南市章丘市辛寨鎮(zhèn)大高村肉雞養(yǎng)殖場發(fā)雞包涵體肝炎的27日齡AA肉雞肝臟中分離鑒定，命名為SDJ15-8，基因序列在Genbank注冊號為KU589231。雞包涵體肝炎病毒株第7代含毒SPF雞胚尿囊液(E7)，能被雞包涵體肝炎病毒血清4型抗體中和。雞包涵體肝炎病毒在制備雞包涵體肝炎滅活疫苗中的應用。本發(fā)明的另一個目的是提供一種雞包涵體肝炎滅活疫苗，包括抗原和轉移因子佐劑，所述抗原為滅活的權利要求1所述的雞包涵體肝炎病毒。進一步，所述雞包涵體肝炎病毒是被甲醛滅活的。本發(fā)明的在一個目的是提供一種雞包涵體肝炎滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：1)接種：將權利要求1所述的雞包涵體肝炎病毒用滅菌生理鹽水稀釋后經(jīng)卵黃囊接種于SPF雞胚，37℃進行靜置孵化，收集48～120小時內(nèi)死亡的雞胚，收獲尿囊液和胚體，其中胚體搗碎用生理鹽水稀釋得到胚體液；2)滅活：將檢驗合格的尿囊液與胚體液均按體積2:1混勻得到混合雞胚液，用滅活劑進行滅活處理，并對滅活后的進行檢驗；3)疫苗制備：將步驟2)檢驗合格的滅活混合雞胚液與轉移因子進行混合，再加入滅菌生理鹽水即可。進一步，步驟2)中所述滅活劑為甲醛，向混合雞胚液加入甲醛至其甲醛總濃度為0.2wt％,密閉后置37℃滅活24小時,離心，棄去沉淀物，收集上清液。進一步，還包括分裝：定量分裝，加蓋密封，2～8℃保存。種毒免疫原性檢驗1、雞包涵體肝炎滅活疫苗制備E7含毒尿囊液96.0ml，加入終濃度為0.2％的甲醛，37℃滅活24小時，期間振搖4～6次。2、雞包涵體肝炎滅活疫苗無菌檢驗按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢驗，應無菌生長。3、雞包涵體肝炎滅活疫苗安全檢驗疫苗皮下或肌肉注射4～5周齡SPF雞10只，2.0ml/每只。飼養(yǎng)觀察14日，應不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。4、免疫接種5日齡白羽肉雞雛20只，分為2組，每組10只。第一組頸背部皮下注射雞包涵體肝炎滅活疫苗0.3ml；第二組為對照組，不做任何處理，兩組雞雛隔離飼養(yǎng)。在第一組免疫后15日，上述2組雞雛用100LD50的雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株攻毒，觀察10日，統(tǒng)計各組雞雛發(fā)病死亡情況(雞發(fā)病標準參照《獸醫(yī)傳染病學》，第五版中369頁的【臨診癥狀及病理變化】)。6、結果第一組雞雛在攻毒后6天有2只表現(xiàn)出臨床發(fā)病癥狀，其余8只健活，整組雞雛無死亡；第二組雞雛在攻毒后2-3天表現(xiàn)出臨床發(fā)病癥狀，死亡7只。結果說明雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株免疫原性良好。本發(fā)明制備的雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗在使用時對肉雞雛和肉種雞基本無應激導致的采食下降和精神萎靡等副反應，與蜂膠、油佐劑疫苗比較具有更好的安全性。用于預防血清4型的雞包涵體肝炎病毒有效率90％以上，預防保護期長達3個月。無母源抗體的商品肉雞在5-8日齡時頸部皮下注射免疫0.3-0.5ml，可從16-18日齡開始保護至出欄上市；肉種雞在5-8日齡進行基礎免疫，在開產(chǎn)前15日進行加強免疫0.8-1.0ml，所產(chǎn)種蛋孵化的雞雛具有雞包涵體肝炎病毒血清4型母源抗體，保護期至少15日，結合肉雞在5-8日齡時免疫，可使商品肉雞在整個生長周期內(nèi)(45天左右)獲得對雞包涵體肝炎病毒血清4型的堅強保護。疫苗中作為免疫佐劑的轉移因子有非特異性增強機體免疫功能，使肉雞發(fā)育整齊、抗病力強，大腸桿菌等細菌性疾病感染率明顯下降，提高養(yǎng)殖收益和減少抗生素用量，是生產(chǎn)綠色食品的好幫手。具體實施方式實施例11、抗原制備1.1接種將種毒用滅菌生理鹽水作15000倍稀釋，經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，用蠟封孔，于37℃靜置孵化。1.2孵育和觀察棄去48小時前死亡的雞胚，以后每隔6小時照蛋1次，收集48～120小時內(nèi)死亡的雞胚，于2～8℃冷藏12～24小時。1.3收獲雞胚用碘酊消毒蛋殼表面氣室部，無菌操作除去氣室部蛋殼，收獲尿囊液和胚體。其中，尿囊液置于滅菌的500ml玻璃瓶內(nèi)，裝量為450ml/瓶，標記為雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E8，置-20℃及以下溫度保存；胚體用組織搗碎機搗碎，按質(zhì)量體積比用生理鹽水1:1稀釋，于4℃和-20℃反復凍融2次，于4℃條件下12000rpm離心30分鐘，收集上清，過濾除菌，分裝，標記為雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株胚毒。將雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E8和雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株胚毒以瓶為單位，按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄檢驗，應無細菌生長。將無菌檢驗合格的雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E8和胚毒按體積2:1混合、搖勻，即為抗原?？乖訖z測雞包涵體肝炎病毒含量為10-6.75ELD50/0.1ml。2抗原滅活將抗原加入終濃度為0.2wt％甲醛溶液(含36～40wt％甲醛)，密閉后置37℃滅活24小時(其間4～6小時振搖1次，每次3分鐘)后，經(jīng)4000轉/分鐘離心20分鐘，棄去沉淀物，收集上清液，4℃保存。3抗原滅活檢驗3.1無菌檢驗無菌操作取3.2中上清液，按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢驗，應無細菌生長。3.2滅活檢驗無菌操作取3.2中無菌檢驗合格上清液，經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1ml，用蠟封孔，37℃靜置孵化，觀察至168小時，SPF雞胚應全部健活，胚體無雞包涵體肝炎感染導致的典型病變。4疫苗的制備4.1疫苗1取滅活檢驗合格的抗原200ml，加入轉移因子(多肽含量16.4mg/ml)并補充注射用水，使多肽終濃度為1mg/ml、抗原含量為10-5.0ELD50/0.1ml，分裝，-4℃保存。4.2疫苗2取滅活檢驗合格的抗原200ml，加入轉移因子(多肽含量16.4mg/ml)并補充注射用水，使多肽終濃度為2mg/ml、抗原含量為10-5.0ELD50/0.1ml，分裝，-4℃保存。4.3疫苗3取滅活檢驗合格的抗原200ml，加入轉移因子(多肽含量16.4mg/ml)并補充注射用水，使多肽終濃度為1mg/ml、抗原含量為10-6.0ELD50/0.1ml，分裝，-4℃保存。4.4疫苗4取滅活檢驗合格的抗原200ml，加入轉移因子(多肽含量16.4mg/ml)并補充注射用水，使多肽終濃度為2mg/ml、抗原含量為10-6.0ELD50/0.1ml，分裝，-4℃保存。4.5疫苗5取滅活檢驗合格的抗原200ml，加入轉移因子(多肽含量16.4mg/ml)，使多肽終濃度為1mg/ml，分裝，-4℃保存。4.6疫苗6取滅活檢驗合格的抗原200ml，加入轉移因子(多肽含量16.4mg/ml)，使多肽終濃度為2mg/ml，分裝，-4℃保存。5疫苗檢驗5.1無菌檢驗取4中的疫苗1-6，按按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢驗，均無細菌生長。5.2安全性檢驗取4中的疫苗1-6，分別皮下或肌肉注射4～5周齡SPF雞10只，2.0ml/只。隔離飼養(yǎng)，觀察14日，未出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。實施例21、5日齡雛雞試驗1.1方法5日齡AA肉雞雛140只，分為7組，每組20只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射雞包涵體肝炎轉移因子佐劑滅活疫苗1-6，0.3ml/只，7組為對照組，不做任何處理。在免疫后15天，對1-7組所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組雞雛發(fā)病及死亡情況。1.2結果當疫苗滅活前抗原的病毒含量≥10-6.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml時，可100％保護雞雛，具體結果見表1。表1各組雞雛發(fā)病率與保護率分組1234567發(fā)病率％1555000100死亡率％00000080保護率％859595100100100028日齡雛雞試驗2.1方法8日齡AA肉雞雛140只，分為7組，每組20只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射雞包涵體肝炎轉移因子佐劑滅活疫苗1-6，0.5ml/只，7組為對照組，不做任何處理。在免疫后15天，對1-7組所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組雞雛發(fā)病及死亡情況。2.2結果當疫苗滅活前抗原的病毒含量≥10-5.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml時，可100％保護雞雛，結果見表2。表2各組雞雛發(fā)病率與保護率分組1234567發(fā)病率％1000000100死亡率％00000070保護率％9010010010010010003討論對5日齡和8日齡雞雛的預防保護試驗表明：雞包涵體肝炎病毒轉移因子佐劑滅活疫苗的預防保護率與免疫接種劑量、抗原滅活前的病毒含量和轉移因子含量有關。在抗原滅活前的病毒含量相同條件下，轉移因子含量增加對提高疫苗保護率有明顯作用。疫苗以抗原含量≥10-6.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml(疫苗4)為佳，可100％保護強毒攻擊。雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗分裝按4.4制備疫苗，即為雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗，分裝，裝量250ml/瓶，于2-8℃保存。無菌檢驗和安全性檢驗合格。實施例3雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗免疫不同日齡雞雛后產(chǎn)生保護性抗體最早時間試驗15日齡雛雞試驗1.1方法5日齡AA肉雞雛120只，分為12組，每組10只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射免疫雞包涵體肝炎病毒血清4型轉移因子佐劑滅活疫苗0.3ml/只，7-12組為對照組，不做任何處理。在免疫后8、9、10、11、12、13天時，分別對1和7組、2和8組、3和9組、4和10組、5和11組、6和12組的所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各組接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組雞雛發(fā)病及死亡情況。1.2結果各攻毒對照組發(fā)病率100％、死亡率＞70％，免疫疫苗組100％保護是在免疫后11天，說明5日齡雞雛免疫疫苗0.3ml/只，完全產(chǎn)生保護性抗體的最早時間是在免疫后11天，具體結果見表3。表3各組雞雛發(fā)病率與保護率28日齡雛雞試驗2.1方法8日齡AA肉雞雛120只，分為12組，每組10只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射免疫雞包涵體肝炎病毒血清4型轉移因子佐劑滅活疫苗0.5ml/只，7-12組為對照組，不做任何處理。在免疫后8、9、10、11、12、13天時，分別對1和7組、2和8組、3和9組、4和10組、5和11組、6和12組的所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各組接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組雞雛發(fā)病及死亡情況。2.2結果各攻毒對照組發(fā)病率100％、死亡率＞60％，免疫疫苗組100％保護是在免疫后10天，說明8日齡雞雛免疫疫苗0.5ml/只，完全產(chǎn)生保護性抗體的最早時間是在免疫后10天，結果見表4。表4各組雞雛發(fā)病率與保護率3討論5日齡和8日齡雞雛分別免疫疫苗0.3ml/只和0.5ml/只，完全產(chǎn)生保護性抗體的最早時間分別是在免疫后11天和10天，最早保護時間的差異可能與疫苗接種劑量有關。實施例4雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗免疫持續(xù)期試驗1方法5日齡AA肉雞雛80只，分為8組，每組10只，1-4組分別經(jīng)肌肉注射免疫雞包涵體肝炎血清4型轉移因子佐劑滅活疫苗0.3ml/只，5-8組為對照組，不做任何處理。在免疫后1、2、3、4個月時，分別對1和5組、2和6組、3和7組、4和8組的所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各組接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組雞雛發(fā)病及死亡情況。2結果攻毒對照組雞雛發(fā)病率100％、死亡率＞60％，疫苗免疫組100％保護的持續(xù)期為3個月，具體結果見表5。表5各組雞雛發(fā)病率與保護率實施例5雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗保存期試驗1方法取于2-8℃保存的雞包涵體肝炎病毒血清4型轉移因子佐劑滅活疫苗，于保存6、8、10、12和15個月時分別接種10只5日齡AA肉雞雛0.3ml/只，同時設10只對照，在接種疫苗后15日分別對免疫組和對照組雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組雞雛發(fā)病及死亡情況。2結果對照組雞雛發(fā)病率均為100％，死亡率＞60％，保存6、8、10、12個月疫苗接種組雛雞100％保護，保存15個月的疫苗接種組有3只雞雛發(fā)病，但未死亡。所以確定疫苗保存期為：2-8℃保存，有效期12個月。實施例6雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗接種肉種雞后母源抗體對子代的保護期肉種雞在5-8日齡時首次免疫雞包涵體肝炎病毒血清4型轉移因子佐劑滅活疫苗0.3-0.5ml/只，在開產(chǎn)前15日再次免疫0.8-1.0ml/只，用該種雞所產(chǎn)種蛋孵化雞雛80只，分為4組，每組20只，對1-4組雞雛在10、15、20和30日齡時分別肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計各組雞雛發(fā)病及死亡情況。結果顯示：1和2組雞雛全部健活，未出現(xiàn)雞包涵體肝炎臨床發(fā)病癥狀；第3組有1只發(fā)病，其余健活，發(fā)病雞雛未死亡；第4組有8只發(fā)病，其余健活，發(fā)病雞雛死亡5只。說明母源抗體可100％保護至少15日。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3