本發(fā)明涉及生物制劑領(lǐng)域，特別是涉及一種穩(wěn)定的、不含白蛋白的重組凝血因子Ⅷ凍干制劑。
背景技術(shù)：
：凝血因子Ⅷ(rFⅧ)是血液凝固過(guò)程中導(dǎo)致凝血的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的輔助因子。通常凝血因子可以從人血漿中獲得。通過(guò)重組DNA技術(shù)的方法制備凝血因子，可以避免與血液制品有關(guān)的可能污染，并使凝血因子Ⅷ的來(lái)源不再單一，可有效避免由于使用自愿捐獻(xiàn)血漿作為原料而導(dǎo)致的供應(yīng)能力限制。采用重組DNA技術(shù)制備的凝血因子Ⅷ凍干制劑，可以針對(duì)急性出血的治療性給藥，也可以作為預(yù)防內(nèi)控性出血的經(jīng)常性間隔給藥。重組DNA技術(shù)制備的凝血因子Ⅷ容易降解、聚集并失活，在貯存期間較為不穩(wěn)定，為了改善其穩(wěn)定性，通常需要在制劑處方中加入人血清白蛋白作為穩(wěn)定劑。由于rFⅧ制品的優(yōu)勢(shì)之一是它不是提取自人血漿，因此可避免由人血漿原因引起的可能污染，但人血清白蛋白的添加使不含任何人血原料的重組技術(shù)方式制備的優(yōu)勢(shì)喪失了。近年來(lái)，關(guān)于不含白蛋白的重組凝血因子Ⅷ的制劑處方研究已有描述。通常通過(guò)使用氨基酸(如甘氨酸、賴(lài)氨酸)和高濃度的糖(如甘露糖醇、蔗糖、麥芽糖)替代白蛋白以保證凝血因子Ⅷ制劑的等滲性和穩(wěn)定性。例如美國(guó)專(zhuān)利No.5399670描述了增加凝血因子Ⅷ凍干制劑溶解度的方法，需要在凍干前在制劑溶液中加入精氨酸。美國(guó)專(zhuān)利No.4440679和No.4623717描述了加入至少30％的糖與氨基酸，可以保證凝血因子Ⅷ液體制劑在60℃貯存10個(gè)小時(shí)的穩(wěn)定性。美國(guó)專(zhuān)利No.5565427中公開(kāi)的一種不含白蛋白的凝血因子Ⅷ制劑，該制劑處方中包括賦形劑(如氯化鈉和蔗糖)、氨基酸(如精氨酸和甘氨酸)、表面活性劑(如聚山梨酯80或聚山梨酯20)。該專(zhuān)利披露了溶液中穩(wěn)定性不超過(guò)16小時(shí)的溶液1(包含0.75％蔗糖、0.4M甘氨酸、0.15M氯化鈉)和溶液2(包含0.01M檸檬酸鈉、0.08M甘氨酸、0.016M賴(lài)氨酸、0.0025M氯化鈉、0.4M氯化鈉)。美國(guó)專(zhuān)利No.5763401公開(kāi)了一種不含白蛋白的治療用凝血因子Ⅷ制劑，該制劑處方中包括15-60mM蔗糖、最多50mM氯化鈉、最多5mM氯化鈣、65-400mM甘氨酸、最多50mM組氨酸。優(yōu)選的兩種特定制劑處方為：處方1包含：150mM氯化鈉、2.5mM氯化鈣、165mM甘露醇；處方2包含：1％蔗糖、30mM氯化鈉、2.5mM氯化鈣、20mM組氨酸、290mM甘氨酸。美國(guó)專(zhuān)利No.5733873公開(kāi)了一種含表面活性劑的凝血因子制劑，該專(zhuān)利公開(kāi)的制劑中各賦形劑的范圍為：至少0.01mg/ml的聚山梨酯20或80、至少0.1M氯化鈉、至少0.5mM鈣鹽、至少1mM組氨酸。公開(kāi)的實(shí)施例的處方為：處方1包含：組氨酸(14.7mM，50mM，65mM)、氯化鈉(0.31M，0.6M)、氯化鈣(4mM)、聚山梨酯80(0.001％，0.02％，0.025％)、PEG(0，0.1％)、蔗糖(0，19.9mM)；處方2包含：20mg/ml甘露醇、2.67mg/ml組氨酸、18mg/ml氯化鈉、3.7mM氯化鈣、0.23mg/ml聚山梨酯80。專(zhuān)利WO96/22107公開(kāi)了含有海藻糖的制劑，該制劑的第一種配方包括：0.1M氯化鈉、15mM氯化鈣、15mM組氨酸、1.27M海藻糖；第二種配方包括：0.011％氯化鈣、0.12％組氨酸、0.002％Tris、0.002％聚山梨酯80、0.004％PEG3350、7.5％海藻糖、0.13％或1.03％氯化鈉。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種重組凝血因子Ⅷ凍干制劑，它不含白蛋白，在水中復(fù)溶快，且穩(wěn)定性高。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的重組凝血因子Ⅷ凍干制劑，用水復(fù)溶后，包含有：重組凝血因子Ⅷ、緩沖液、純度穩(wěn)定劑、活性穩(wěn)定劑、增溶劑、表面活性劑。各組分的較佳濃度為：重組凝血因子Ⅷ50-1500IU/mL，緩沖液5-50mM，純度穩(wěn)定劑5-100mM，活性穩(wěn)定劑1-5mM，增溶劑150-350mM，表面活性劑0.005-0.05wt％。所述緩沖液優(yōu)選組氨酸緩沖液，濃度優(yōu)選為10mM。所述純度穩(wěn)定劑優(yōu)選蔗糖或海藻糖，濃度優(yōu)選為10mM。所述活性穩(wěn)定劑優(yōu)選二價(jià)鈣鹽，例如氯化鈣、葡萄糖酸鈣、葡萄糖二酸鈣等，濃度優(yōu)選為2.5mM～5mM。所述增溶劑優(yōu)選氯化鈉，濃度優(yōu)選為300mM。所述表面活性劑優(yōu)選聚山梨酯80，濃度優(yōu)選為0.01wt％。較佳的，該凍干制劑用水復(fù)溶后，還包括有賦形劑(優(yōu)選甘露醇)，賦形劑的濃度一般不超過(guò)150mM(優(yōu)選110mM)。所述凍干制劑中的水分含量為1-3wt％。在凍干過(guò)程中pH一般保持在6～8，優(yōu)選6.5～7。本發(fā)明的重組凝血因子Ⅷ凍干制劑，不含白蛋白，在水中可迅速?gòu)?fù)溶(30秒鐘內(nèi))，且相比現(xiàn)有的重組凝血因子Ⅷ凍干制劑穩(wěn)定性更高，在室溫下以液體狀態(tài)可保持至少達(dá)24小時(shí)的穩(wěn)定。附圖說(shuō)明圖1是本實(shí)施例的重組凝血因子Ⅷ復(fù)溶液體制劑純度穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果圖。圖2是本實(shí)施例的重組凝血因子Ⅷ復(fù)溶液體制劑活性穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例中所用輔料，如果沒(méi)有特別說(shuō)明，均為市售藥用級(jí)別。實(shí)施例1本實(shí)施例的重組凝血因子Ⅷ的液體制劑的配方如下表1所示：表1實(shí)施例1的重組凝血因子Ⅷ液體制劑配方組分用量重組凝血因子Ⅷ1000IU/mL組氨酸緩沖液10mM蔗糖30mM氯化鈉300mM氯化鈣5mM甘露醇110mM聚山梨酯800.01wt％上述配方的重組凝血因子Ⅷ的凍干制劑的制備方法為：采用陰離子交換層析方法純化，基于重組凝血因子與使用的緩沖介質(zhì)中的帶電離子的相互競(jìng)爭(zhēng)作用，來(lái)獲得重組凝血因子Ⅷ的原液。原液中重組凝血因子Ⅷ的濃度應(yīng)在1000IU/mL以上。根據(jù)原液的體積計(jì)算所需的各類(lèi)輔料的用量(參見(jiàn)表1)，并加入原液中。調(diào)整溶液中所有組分的濃度，獲得半成品。將半成品無(wú)菌分裝入西林瓶中，半加膠塞后進(jìn)行冷凍干燥，獲得重組凝血因子Ⅷ的凍干制劑成品。本實(shí)施例采用冷凍干燥機(jī)對(duì)重組凝血因子Ⅷ液體制劑進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥步驟包括：(1)將凍干機(jī)凍干室溫度降至至少-45℃，保持2小時(shí)；(2)將凍干室的溫度上升至-15℃～-35℃(優(yōu)選-25℃)，保持1～3小時(shí)；(3)將凍干室溫度降低至至少-45℃，保持2小時(shí)。在此凍結(jié)過(guò)程中，溫度升降的速率優(yōu)選為每分鐘0.5℃～1.0℃。(4)凍干機(jī)壓力降低至約0.1mBar后，將溫度上升至-32℃～-35℃之間，進(jìn)行一次干燥，該步驟最多約50小時(shí)；(5)一次干燥后，將溫度上升至25℃，保持15小時(shí)，溫度上升速率優(yōu)選為0.2℃/分鐘。實(shí)施例2本實(shí)施例的重組凝血因子Ⅷ的液體制劑的配方如下表2所示：表2實(shí)施例2的重組凝血因子Ⅷ液體制劑的配方組分用量重組凝血因子Ⅷ1000IU/mL組氨酸緩沖液10mM蔗糖10mM氯化鈉300mM氯化鈣2.5mM聚山梨酯800.01wt％重組凝血因子Ⅷ的凍干制劑的制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3本實(shí)施例的重組凝血因子Ⅷ的液體制劑的配方如下表3所示：表3實(shí)施例3的重組凝血因子Ⅷ液體制劑的配方組分用量重組凝血因子Ⅷ1000IU/mL組氨酸緩沖液10mM海藻糖10mM氯化鈉300mM氯化鈣2.5mM聚山梨酯800.01wt％重組凝血因子Ⅷ的凍干制劑的制備方法同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)例4對(duì)上述實(shí)施例1-3制備的重組凝血因子Ⅷ凍干制劑的水分含量、在水中的復(fù)溶時(shí)間以及復(fù)溶后的純度穩(wěn)定性和活性穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。其中，凍干制劑的水分含量由庫(kù)倫法用MettlerToledoC30D型卡爾費(fèi)休水分儀測(cè)得；復(fù)溶后的純度是使用凝膠過(guò)濾層析色譜儀來(lái)檢測(cè)30天內(nèi)的重組凝血因子Ⅷ主峰的純度；活性穩(wěn)定性是由發(fā)色底物法考察30天內(nèi)重組凝血因子Ⅷ的活性。結(jié)果如表4及圖1、2所示。表4實(shí)施例1-3的重組凝血因子Ⅷ凍干制劑的水分含量及在水中復(fù)溶時(shí)間實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3水分含量(wt％)1.81.11.3復(fù)溶時(shí)間(秒)111612當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3