本發(fā)明涉及微生物及生物技術領域，尤其涉及一種利用表達GM-CSF的腺病毒提高新城疫滅活疫苗免疫效果的方法及試劑盒。

背景技術：

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起雞、火雞、鴿等禽類的一種急性、高度接觸傳染性疫病，主要通過引起禽類敗血癥而導致其死亡，是危害養(yǎng)禽養(yǎng)雞業(yè)的三大傳染病之一，多年來此疫病已在亞洲很多國家與地區(qū)造成了巨大的危害。目前應對新城疫最有效的方式就是注射新城疫滅活疫苗，可有效預防禽類新城疫疫病的發(fā)生和傳播。

免疫佐劑又稱非特異性免疫增生劑，是一種本身不具抗原性，但同抗原一起或預先注射到機體內能有效增強免疫原性或改變免疫反應類型的非特異性免疫增強劑。免疫佐劑種類很多，常用的佐劑可分為4類：無機佐劑，如氫氧化鋁、磷酸鈣、明礬等；有機佐劑，微生物及其產物如分枝桿菌(結核桿菌、卡介苗)、短小桿菌、大腸桿菌、百日咳桿菌、內毒素、細菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸(雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、異丙肌苷、脂質體、表面活性劑等；油劑，如弗氏佐劑(Freund adjuvant)、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等。弗氏佐劑目前在實驗動物中最常用，又可分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種，不完全佐劑可用于免疫注射，完全佐劑的免疫強度大于不完全佐劑，主要用于動物實驗，不適宜于人類使用，而且動物多次注射后也常會發(fā)生佐劑病。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophagecolony stimulating factor，GM-CSF)是一種多功能生長因子，研究表明，GM-CSF可以刺激造血祖細胞增殖、分化和成熟并從骨髓向外周轉移，可以誘導多種細胞分化、增殖。集落細胞刺激因子也常被用作免疫佐劑，其免疫增強效果已被很多研究證實，其作為新城疫滅活疫苗的免疫佐劑使用時，接種到家禽體內能夠增加抗原的體積，易被抗原提呈細胞(APC)攝取，延長抗原在體內的存留期，增加與免疫細胞接觸的機遇，有利于刺激免疫細胞的增殖。

然而，通常將GM-CSF作為免疫佐劑使用時，會采用真核或原核表達系統(tǒng)作為遞呈載體，其缺陷是往往會因為GM-CSF的半衰期短而無法很好的發(fā)揮免疫佐劑的作用，極大地影響了其免疫增強效果。本發(fā)明經過多次嘗試，最終選擇了腺病毒作為GM-CSF的遞呈載體，充分利用腺病毒穩(wěn)定性好、可長時間保存感染力的優(yōu)勢，克服了GM-CSF半衰期短的弊端，提升 GM-CSF的免疫增強效果，進一步提高了GM-CSF作為免疫佐劑增強新城疫滅活疫苗免疫活性的使用有效率。本發(fā)明所提供的這種通過改善免疫佐劑遞呈載體進而提高該佐劑對新城疫滅活疫苗免疫增強效果的方法目前還未有人報道。本發(fā)明的方法及其試劑盒可廣泛適用于禽類免疫產業(yè)，本發(fā)明技術的推廣應用將會具有良好的市場前景并產生可觀的經濟及社會效益。

技術實現(xiàn)要素：

解決的技術問題

本發(fā)明需要解決的問題是：本發(fā)明的目的是克服將GM-CSF作為免疫佐劑使用時，采用真核或原核表達系統(tǒng)作為遞呈載體所導致的因為GM-CSF的半衰期短而無法很好發(fā)揮免疫佐劑的作用，并極大影響其免疫增強效果的技術問題。

技術方案

本發(fā)明旨在提供一種利用表達GM-CSF的腺病毒提高新城疫滅活疫苗免疫效果的方法，以解決目前存在的將GM-CSF作為免疫佐劑使用時，采用真核或原核表達系統(tǒng)作為遞呈載體所導致的因為GM-CSF的半衰期短而無法很好發(fā)揮免疫佐劑的作用，并極大影響其免疫增強效果的技術難題。

本發(fā)明提高新城疫滅活疫苗免疫效果的方法，包括以下步驟：

(1)將表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒和新城疫滅活疫苗混勻得到疫苗免疫佐劑混合物；

(2)利用上述疫苗免疫佐劑混合物對禽類進行免疫接種。

作為一種優(yōu)選方案，該方法中所述的表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒為表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的人五型重組腺病毒。

進一步地，利用上述方法對禽類進行免疫接種時采用胸部肌肉注射方式。

此外，本發(fā)明還提供了一種用于提高新城疫滅活疫苗免疫效果的免疫佐劑，該免疫佐劑是表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒。

作為一種優(yōu)選方案，該免疫佐劑是表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的人五型重組腺病毒。

此外，本發(fā)明還提供了一種根據上述提高新城疫滅活疫苗免疫效果的方法制成的試劑盒，該試劑盒中包括表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的重組腺病毒和新城疫滅活疫苗。

作為一種優(yōu)選方案，該試劑盒中包括表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的人五型重組腺 病毒和新城疫滅活疫苗。

進一步地，本發(fā)明試劑盒可廣泛應用于禽類養(yǎng)殖業(yè)中。

有益效果

本發(fā)明所提供的這種通過改善免疫佐劑遞呈載體進而提高該佐劑對新城疫滅活疫苗免疫增強效果的方法克服了現(xiàn)有技術存在的嚴重缺陷，并為改善免疫佐劑的免疫增強作用提供了簡便易行的技術方案。本發(fā)明經過多次嘗試，最終選擇了腺病毒作為GM-CSF的遞呈載體，充分利用腺病毒穩(wěn)定性好、可長時間保存感染力的優(yōu)勢，克服了GM-CSF半衰期短的弊端，提升GM-CSF的免疫增強效果，進一步提高了GM-CSF作為免疫佐劑增強新城疫滅活疫苗免疫活性的使用有效率。本發(fā)明的方法及其試劑盒可廣泛適用于禽類免疫產業(yè)，本發(fā)明技術的推廣應用將會具有良好的市場前景并產生可觀的經濟及社會效益。

附圖說明

圖1為免疫后新城疫抗體變化。在7、14、21和28天采血分離血清，用血凝抑制試驗(HI)檢測抗體滴度，用HI的log2值來比較抗體差異，當p≤0.05，差異顯著(*)。

圖2為加強免疫后免疫相關分子表達變化。以28s做內參，所有組和無攻毒對照組比較，當p≤0.05，差異顯著(*)。

圖3為攻毒后臨床癥狀評價和存活率統(tǒng)計。Daily clinical index：臨床得分指數(shù)；percent survival：存活率；Days post infection(DPI)：感染后天數(shù)。

圖4為組織和眼觀病理變化觀察。A：前胃顯微鏡病變(H.E染色，10×40)；B：肺顯微鏡病變(他染色，10×40)；C：十二指腸病變觀察。

圖5為組織病毒載量檢測。在感染后5d采集感染雞的心臟(heart)、肺臟(lung)、胃(stomach)、十二指腸(Duodenum)和法氏囊(Bursa fabricii)，用實時定量PCR檢測病毒滴度，當p≤0.05，差異顯著(*)。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)形式。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

實施例1

本發(fā)明利用表達雞GM-CSF的腺病毒和雞新城疫病毒滅活疫苗共同免疫，能夠顯著提升新城疫滅活疫苗的體液、細胞免疫水平，增強對新城疫強毒(F48E9)感染的免疫保護效果。

1.實驗材料

病毒：野生型人五型腺病毒(wAd)，表達GM-CSF的重組腺病毒(rAd-GM-CSF)，新城疫滅活疫苗(InV)。

實驗動物：雛雞126只。

2.試驗方法

2.1動物免疫與攻毒試驗

將試驗雞平均分成6組，每組21只，分別按照表1所示設計方案進行處理，在7日齡進行初免，21日齡進行二免。免疫采用胸部肌肉注射，和腺病毒同時免疫的組，預先將腺病毒和滅活疫苗混勻。

表1動物試驗設計方案

二免后2周用0.1ml含有108TCID50的新城疫強毒F48E9毒株進行攻毒，評價免疫保護效果。

2.2抗體檢測

在0、14、21、28和35d收集血清抗體，用OIE推薦的方法進行血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)，檢測血清新城疫抗體滴度。

采集健康公雞紅細胞，配制1％的紅細胞，生理鹽水作為稀釋液，稀釋4單位抗原(以新城疫病毒la Sota毒株作為標準抗原)，用HI的log2值來評價血清抗體滴度。

2.3細胞免疫相關分子檢測

用脾細胞IFN-а、IFN-β、IFN-γ，和IL-4的表達量來評價細胞免疫效果。在第22d(免疫后24h)，處死5只雞，采集脾臟，提取RNA檢測IFN-а、IFN-β、IFN-γ，和IL-4的表達。用相對定量的方法評價幾種免疫相關因子的表達量的變化，每份樣品做3個重復，選用28s作為內參(ΔCt＝Ct目標–Ct內參)，然后和非免組比較(2-ΔΔCT，ΔΔCT＝ΔCt處理組-ΔCt對照組)，通過升高或降低的倍數(shù)來衡量滿意效果。

2.4攻毒保護效果檢測

2.4.1臨床癥狀觀察

用打分的方式評價雞的臨床表現(xiàn)(正常0，沉郁1，癱瘓2，死亡3)。感染后觀察14天，記錄打分結果，用得分平均值評價感染雞的發(fā)病情況，同時記錄死亡率。

2.4.2組織病理學觀察

在感染后第5d，處死3只雞，取肺臟和腺胃制作病理切片，觀察新城疫感染造成的組織病理變化差異。

2.4.3組織病毒含量檢測

在感染后第5d，處死5只雞，用實時定量PCR檢測心、肺、胃、十二指腸和法氏囊中的病毒載量，引物針對NDV的M基因，序列如表2所示。

表2實時定量檢測所用的引物

檢測使用Vazyme(Cat.No Q111-02，Vazyme Biotech co.，ltd)的SYBR Green定量檢測試劑盒，儀器使用西安天隆四通道實時定量PCR儀。

2.4.4排毒檢測

在感染后3、5、7d采集氣管和泄殖腔棉拭子，放置在含抗生素的1毫升PBS中，經處理后接種SPF雞胚蛋，通過血凝試驗檢測雞胚尿液中病毒含量，分析排毒情況。

3.試驗結果

3.1新城疫抗體滴度

如圖1所示，二免后同時免疫滅活疫苗和表達GM-CSF重組腺病毒的組(InV+GM)，獲得了最高的抗體滴度，平均效價約為12(log2)；只免疫滅活疫苗的組(InV)抗體效價約為10(log2)，差異顯著，其它組抗體效價約為6(log2)。上述結果表明同時免疫表達GM-CSF的腺病毒能夠顯著提高免疫雞的抗體水平。

3.2脾細胞免疫相關因子表達量

如圖2所示，二免后24h，InV+GM組的雞脾細胞IFN-а、IFN-β、IFN-γ，和IL-4的表達量顯著高于其它組，與InV組相比較差異顯著(p<0.05)。表明同時免疫表達GM-CSF的腺病毒能夠顯著提高免疫相關分子的轉錄水平。

3.3臨床癥狀評價和存活率

InV+GM組臨床得分約為0.5，而InV組臨床得分約為1.5。

接種了wAd的組，雞在感染后第7d全部死亡；非免疫攻毒對照的組(CC)，雞在感染后第8d全部死亡；接種了表達集落細胞刺激因子，但沒有接種新城疫滅活疫苗的組(rAd-GM)在感染后第10d全部死亡。

如圖3所示，InV組存活率為46％(7/15)，InV+GM組的存活率為86％(13/15)。表明同時免疫表達GM-CSF的腺病毒能夠降低強毒感染造成的發(fā)病嚴重程度和死亡率。

3.4眼觀及組織病理變化

如圖4所示，在感染后第5d，剖檢3只雞，評價病變情況，發(fā)現(xiàn)CC、wAd和rAd-GM組的雞在多個組織器官上都可以看到明顯的出血。InV組可以在腸道漿膜面見到輕微的出血，而InV+GM組則見不到出血現(xiàn)象。

組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，對照組CC、wAd和rAd-GM肺臟和腺胃可見明顯的出血和炎性細胞的浸潤；InV組可見腺胃管輕度水腫和肺臟的出血，而免InV+GM組的雞在腺胃管上可見更加輕微的水腫，肺臟則可見病理變化。表明同時免疫表達GM-CSF的腺病毒能夠減低強毒感染造成的眼觀組織病理變化和顯微組織病理變化。

3.5組織病毒含量和排毒

如圖5所示，對照組組織病毒含量約為103.5～104.2拷貝/100ul，InV組的雞組織病毒含量約為102.6～102.9拷貝/100ul，InV+GM組的雞組織病毒含量約為102.1～102.4拷貝/100ul。表明同時免疫表達GM-CSF的腺病毒能夠顯著降低組織病毒載量。

從表3感染后排毒雞的數(shù)量中可以看出，排毒檢測發(fā)現(xiàn)對照組在感染后3、5和7d都存在嚴重的排毒現(xiàn)象，而InV組在感染后3、5和7d的排毒率分別為40％、20％和20％；InV+GM組排毒率分別為0％、20％和0％。表明同時免疫表達GM-CSF的腺病毒能夠顯著降低排毒率。

表3感染后排毒雞的數(shù)量

注*感染后天數(shù)

。