本發(fā)明涉及預(yù)測和檢測紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的生物標(biāo)志物，具體是基于檢測表皮中角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白變化，作為預(yù)測和檢測紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的生物標(biāo)志物的檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

陽光中的紫外線是人的皮膚受到紫外線輻射損傷的主要原因，紫外線輻射對于皮膚會產(chǎn)生多種病理作用，例如皮膚紅腫，脫皮，炎癥，潰爛，以及多種皮膚疾病等，并會產(chǎn)生大量活性氧化物，造成皮下細(xì)胞的DNA損傷，加速皮膚衰老。事實上，人體皮膚衰老90%的原因是由于紫外線照射，而紫外線誘導(dǎo)的最嚴(yán)重的疾病是皮膚癌，已有研究證明，90%以上的皮膚癌是由陽光中的紫外線照射引起的。皮膚癌患者占所有癌癥患者中的40%，全世界每年有300多萬新發(fā)皮膚癌病例，而皮膚癌基金會也指出，五分之一的美國人在一生中的某個階段會得皮膚癌。隨著人類工業(yè)化的進(jìn)展，大氣層中負(fù)責(zé)阻擋紫外線的臭氧層在不斷變薄，有專家曾預(yù)測，臭氧層厚度減少1%，紫外線輻射強(qiáng)度增加2%。因此，對于皮膚紫外線損傷的檢測對于人們提高皮膚的健康水平、防止皮膚癌等重大皮膚疾病的產(chǎn)生，都有著重大的社會經(jīng)濟(jì)意義和臨床價值。

而在我國，由于人口壓力巨大，診斷和就醫(yī)困難，紫外皮膚損傷尚未得到足夠的重視，往往很多皮膚受創(chuàng)患者只有受到特別強(qiáng)的皮損后才會門診就醫(yī)，而使得近年來，我國乃至于全世界紫外創(chuàng)傷導(dǎo)致的皮膚病和皮膚癌患者數(shù)量逐漸增多。因此，有效的皮膚紫外損傷的檢測方法和手段，以及低成本便攜式的紫外損傷檢測設(shè)備，對于皮膚健康的監(jiān)測、皮膚疾病特別是皮膚癌的診斷和治療，意義重大。

現(xiàn)在臨床上皮膚紫外線損傷的診斷以皮膚科醫(yī)生目測為主，對醫(yī)生的經(jīng)驗依賴性強(qiáng)，且只能對較嚴(yán)重的皮膚損傷進(jìn)行評估，無法實現(xiàn)對紫外線造成的積累性皮膚損傷，特別是皮膚癌變的早期診斷?，F(xiàn)有的皮膚損傷檢測儀器，只能通過紫外光在組織傳播過程中的吸收不同，對皮下進(jìn)行反射成像實現(xiàn)一個非常粗略的估計。其原理是:紫外燈照射皮膚，檢測皮膚反射回的光線，由于正常皮膚組織和受損區(qū)域?qū)饩€的吸收系數(shù)不同，將反射或散射回來的光線進(jìn)行成像，從而可以對皮膚內(nèi)黑色素、水分、脂質(zhì)的含量做一個非常粗略的估計。由于激光在組織中的傳播對于散射非常敏感，而且根據(jù)瑞利散射和彌散射原理，光子散射量與波長的四次方成反比，對于紫外光這種超短波長而言，其在皮膚組織的傳播受到散射的干擾已經(jīng)非常顯著，同時紫外光在正常細(xì)胞中的吸收也非常強(qiáng)烈，因此，這種反射成像會受到非常多因素的干擾，準(zhǔn)確率和重復(fù)性都非常低。對于同樣一個人而言，在不同組織，或同樣組織中的不同肌肉狀態(tài)下的測量，可能測得的結(jié)果差異已經(jīng)與紫外受損造成的差異相當(dāng)。因此，這類儀器清晰度、靈敏度差，無法檢測紫外線造成的早期皮膚損傷，對皮膚損傷及進(jìn)一步的皮膚疾病的早期檢測和預(yù)防毫無指導(dǎo)意義，在臨床上幾乎沒有應(yīng)用。特別地，對于皮膚科門診，往往只能使用光實驗對皮膚的紫外敏感性做一個定性評估，其方法是，在一個非見光皮膚區(qū)域，如背部的一塊皮膚上進(jìn)行紫外光照射，然后通過這塊皮膚出現(xiàn)的紅斑面積來評價患者的皮膚紫外敏感性，既不準(zhǔn)確，也無法進(jìn)行損傷的直接檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，皮膚經(jīng)過紫外線照射后，表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和含量會發(fā)生變化，并且這種變化與皮膚損傷成正比關(guān)系；同時X射線沒有能力誘導(dǎo)該變化的發(fā)生。因此，本發(fā)明基于這一全新發(fā)現(xiàn)，突破了現(xiàn)有技術(shù)的難題，找到了一種可以準(zhǔn)確地用于預(yù)測和檢測紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的生物標(biāo)志物。并且基于該生物標(biāo)志物，發(fā)明了新的無創(chuàng)檢測其變化的方法。

本發(fā)明的目的是提出一種基于表皮中表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和含量作為紫外光誘導(dǎo)皮膚損傷的生物標(biāo)志物的檢測方法，包括以下步驟：

(1) 在實驗對象的皮膚受到包含一定劑量紫外光的光源照射后72小時之內(nèi)，檢測表皮中角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)以及含量，其中所述劑量 = 紫外光功率×照射時間；

(2) 按照所述步驟(1)的方法，同樣檢測所述實驗對象未受到含紫外光的光源照射的皮膚中角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)；

(3) 將所述實驗對象經(jīng)過含紫外光的光源照射的皮膚中角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)和未受到含紫外光的光源照射的皮膚中角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)相對比，獲得經(jīng)紫外光照射誘發(fā)皮膚中角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)變化率；

(4) 根據(jù)所述經(jīng)紫外光照射誘發(fā)皮膚中角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)變化率，預(yù)測所述被實驗對象的皮膚健康狀態(tài)。

進(jìn)一步的，所述檢測方法是通過檢測角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的各種性質(zhì)，從而判斷角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)，從而預(yù)測、檢測紫外光誘導(dǎo)的皮膚損傷。

進(jìn)一步的，所述檢測方法是通過檢測角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的自熒光強(qiáng)度，從而判斷角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步的，所述檢測方法是通過檢測角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的光譜，從而判斷角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步的，所述檢測方法是通過檢測角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的拉曼光譜，從而判斷角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步的，所述檢測方法是通過檢測角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的所有光學(xué)性質(zhì)，從而判斷角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步的，所述檢測方法，是通過檢測角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的厚度，結(jié)構(gòu)等物理性質(zhì)，從而判斷角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的含量以及結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明還提供一種基于檢測角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白變化預(yù)測檢測紫外損傷的生物標(biāo)志物的應(yīng)用。

本發(fā)明利用紫外線誘發(fā)的早期角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白含量和結(jié)構(gòu)的變化與后期皮膚損傷成正比的關(guān)系，為臨床預(yù)測和檢測紫外光誘導(dǎo)的皮膚損傷建立基礎(chǔ)，可以準(zhǔn)確且盡早的發(fā)現(xiàn)紫外光誘導(dǎo)的皮膚損傷，是患者得到及時的治療。同時，本發(fā)明提供了一種檢測方法，作為一種簡化的角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白含量和結(jié)構(gòu)變化的檢測方式。既可以在高端精密的醫(yī)學(xué)診斷中得到應(yīng)用，也可以在便捷、家庭中預(yù)測和檢測紫外損傷中得到應(yīng)用，非常利于普及。

附圖說明

圖1 為UVC照射皮膚24小時內(nèi)皮下角蛋白自發(fā)熒光的三視圖。

圖2 為UVA，UVB，UVC照射皮膚24小時內(nèi)皮下角蛋白的光譜圖。

圖3 為角蛋白熒光強(qiáng)度與皮膚損傷的相關(guān)性擬合。

具體實施方式

下面將通過具體描述，對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

除非另有限定，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。

發(fā)明人進(jìn)行了大量的實驗，確定了紫外線誘導(dǎo)皮膚損傷后的角蛋白及角蛋白相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)和含量的變化程度與皮膚損傷程度關(guān)系。

根據(jù)本發(fā)明，使用雄性C57小鼠，UVC、照射的小鼠重量在15-25g范圍之間，UVB/UVA照射的小鼠重量在18-25g范圍之間。紫外線輻射完成后，小鼠在動物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，條件為22-24℃，12小時的明/暗循環(huán)，并可自由進(jìn)食取水。

24小時內(nèi)，使用激光共聚焦顯微鏡對紫外線照射的皮膚進(jìn)行無創(chuàng)成像。其后一天或五天后犧牲小鼠，取損傷皮膚組織，進(jìn)行H&E（蘇木精&伊紅染色）檢測。小鼠的皮膚組織用激光共聚焦顯微鏡成像，其中激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長為440-600 nm。

皮膚組織的儲存：皮膚取出后，取出適量組織浸泡于4%多聚甲醛，用于制作石蠟切片，剩余組織用鋁箔紙包裹好，使用液氮冷凍，之后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱長期保存。

皮膚組織石蠟切片：將皮膚組織浸泡4%多聚甲醛溶液24h，然后依照石蠟切片的制作方法依次浸自來水、蒸餾水、梯度酒精、二甲苯、石蠟，制作成石蠟切片。

皮膚石蠟切片的H&E染色：將石蠟切片浸二甲苯脫蠟，然后依次浸于梯度酒精、蒸餾水，蘇木素染色10分鐘，自來水流水沖洗30min，蒸餾水浸泡30s，95%乙醇10s，伊紅復(fù)染30s，70%酒精洗滌2次，依次浸梯度酒精、二甲苯，中性樹脂封片。

對染色結(jié)果拍照、量化：對上述兩種染色進(jìn)行拍照。并針對表皮角質(zhì)化厚度，表皮厚度等指標(biāo)進(jìn)行量化。

統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)按照平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式給出，數(shù)據(jù)使用單因素方差分析進(jìn)行評估，P值小于0.05認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。

小鼠實驗的結(jié)果如下所述：

圖1：C57小鼠耳部經(jīng)UVC照射，24小時內(nèi)耳部皮膚的自熒光強(qiáng)度隨照射時間的延長而增強(qiáng)。A、B、C、D分別為對照組，照射劑量為0.3 J/cm2，0.6 J/cm2和0.9 J/cm2。

圖1：UVC照射皮膚24小時內(nèi)，皮下自發(fā)熒光量隨紫外輻射劑量的增加而顯著增加。根據(jù)三視圖顯示，熒光位置處于皮膚表皮層，根據(jù)其熒光所處位置以及結(jié)構(gòu)特征（多邊形環(huán)狀結(jié)構(gòu)），我們認(rèn)為這是角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白發(fā)出的熒光。

圖2：皮膚接受不同波段紫外光照射，24小時內(nèi)，皮膚角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的光譜圖。顯示角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白光譜沒有發(fā)生變化，強(qiáng)度增加。

圖3：角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的熒光強(qiáng)度與3-5天皮膚損傷呈正相關(guān)。所述皮膚損傷為，H&E染色，皮膚體細(xì)胞個數(shù)減少。

由以上實驗可以得出，皮膚經(jīng)過紫外線（UVA，UVB和UVC）照射后，角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和含量發(fā)生變化，且該變化與皮膚損傷呈正相關(guān)。因此，表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白能夠作為預(yù)測和檢測皮膚損傷的標(biāo)志物。

本發(fā)明基于這一發(fā)現(xiàn)，建立了一種活體無創(chuàng)檢測紫外線誘導(dǎo)皮膚損傷的方法。該方法包括以下步驟：

(1) 在實驗對象的皮膚受到包含一定劑量紫外光的光源照射后72小時之內(nèi)，檢測所述實驗對象經(jīng)過含紫外光的光源照射的皮膚中角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及含量，其中所述劑量 = 紫外光功率×照射時間；

(2) 檢測所述實驗對象經(jīng)過含紫外光的光源照射的皮膚的表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)及含量；

(3) 按照所述步驟(2)的方法，同樣檢測所述實驗對象未受到含紫外光的光源照射的皮膚表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)及含量；

(4) 將所述實驗對象經(jīng)過含紫外光的光源照射的皮膚表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)及含量和未受到含紫外光的光源照射的皮膚的表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)及含量相對比，獲得經(jīng)紫外光照射誘發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度變化率；

(5) 根據(jù)所述經(jīng)紫外光照射誘發(fā)的表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)及含量變化率，預(yù)測所述被實驗對象的皮膚健康狀態(tài)。

本發(fā)明的利用激發(fā)光激發(fā)表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)及含量的方式包括使用普通的連續(xù)光輸出進(jìn)行激發(fā)的方式、使用電調(diào)制進(jìn)行調(diào)制激發(fā)的方式或者使用脈沖激光進(jìn)行激發(fā)的方式中的至少一種。

在本發(fā)明的檢測方法中，優(yōu)選的是，在被實驗對象的皮膚受到紫外光照射后的48小時之內(nèi)進(jìn)行檢測；更優(yōu)選的是，在24小時之內(nèi)進(jìn)行檢測。

本發(fā)明的活體無創(chuàng)檢測紫外線誘導(dǎo)皮膚損傷的方法，根據(jù)表皮角蛋白以及角蛋白相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)及含量與皮膚損傷程度呈正比的規(guī)律，預(yù)測被實驗對象的皮膚損傷程度。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說明的目的，本文描述了本發(fā)明的具體實施方式，但可以對其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實施方式和實施例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。