本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)填充納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種可用于缺損骨質(zhì)的填充，促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的納米復(fù)合材料。

背景技術(shù)：

納米二氧化鈦(TiO₂)作為無(wú)機(jī)納米材料的閃光點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在包括醫(yī)藥和食品在內(nèi)的諸多領(lǐng)域，但是由于它能夠產(chǎn)生大量的活性氧，可破壞細(xì)胞膜，并可以影響蛋白質(zhì)和基因，存在一定的缺陷。溫敏性羥丁基殼聚糖是一種可生物降解的聚陽(yáng)離子多糖，具有生物降解，具有獨(dú)特的跨細(xì)胞膜的能力，具有穩(wěn)定的“立體”效應(yīng)，能增強(qiáng)納米粒子在溶液中的穩(wěn)定性，避免團(tuán)聚。

但是關(guān)于將納米TiO₂與溫敏性羥丁基殼聚糖組合形成新的促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的納米符合材料目前還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種生物安全性高、可注射、可填充并促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)具有抗炎性和抗菌性的納米復(fù)合材料。

本發(fā)明的第一方面，提供一種促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的復(fù)合納米材料，由納米二氧化鈦和羥丁基殼聚糖制成，所述的納米二氧化鈦和羥丁基殼聚糖的重量比是(1-3):1。

優(yōu)選的，所述的促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的復(fù)合納米材料是采用微乳液法制備的溫敏性羥丁基殼聚糖二氧化鈦納米微球復(fù)合體(縮寫TiO₂@CTS)。

優(yōu)選的，所述的溫敏性羥丁基殼聚糖二氧化鈦納米微球復(fù)合體的制備方法包括以下步驟：將納米二氧化鈦，羥丁基殼聚糖，環(huán)己烷，TritonX-100，正己醇，共同加入ddH₂O，37℃磁力攪拌，所得溶液體系用PBS 3000rpm離心清洗2遍，4℃保存。

本發(fā)明的第二方面，提供上述促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的復(fù)合納米材料的制備方法，包括以下步驟：將納米二氧化鈦，羥丁基殼聚糖，環(huán)己烷，TritonX-100，正己醇，共同加入ddH₂O，37℃磁力攪拌，所得溶液體系用PBS 3000rpm離心清洗2遍，4℃保存。

優(yōu)選的，所述的促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的復(fù)合納米材料的制備方法，包括以下步驟：用微乳液法制備，將納米二氧化鈦50mg～150mg，羥丁基殼聚糖50mg，3～5ml環(huán)己烷，1～2ml TritonX-100，1～2ml正己醇，共同加入18ml ddH₂O，37℃磁力攪拌2h，所得溶液體系用PBS 3000rpm離心清洗2遍，4℃保存。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的復(fù)合納米材料的制備方法，包括以下步驟：用微乳液法制備，將納米二氧化鈦50mg，羧丁基殼聚糖50mg，4.2ml環(huán)己烷，1mlTritonX-100，1ml正己醇，共同加入18ml ddH₂O，37℃磁力攪拌2h，所得溶液體系用PBS 3000rpm離心清洗2遍，4℃保存。

本發(fā)明的第三方面，提供上述促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的復(fù)合納米材料在制備骨質(zhì)填充材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四方面，提供一種促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的骨質(zhì)填充材料，所述的促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的骨質(zhì)填充材料中包含上述復(fù)合納米材料。

優(yōu)選的，所述的促進(jìn)成骨生長(zhǎng)的骨質(zhì)填充材料中上述復(fù)合納米材料和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)聯(lián)用。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明將納米TiO₂與殼聚糖形成新的納米材料：溫敏性羥丁基殼聚糖二氧化鈦納米微球復(fù)合體，并通過(guò)一系列細(xì)胞分子生物學(xué)和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，提供了一種生物安全性高、可注射、可填充并促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)具有抗炎性和抗菌性的納米復(fù)合材料，可作為替代骨粉、效果更好的新材料。

附圖說(shuō)明

圖1.透射電鏡觀察及Zeta電位值。

圖2.MTT比色法細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果。

圖3.血液相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4.TiO₂@CTS的成骨水平的觀察。

圖5.在軟件中選取觀察范圍。

圖6.在Image-Pro軟件中選取新生骨區(qū)域并測(cè)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

1、TiO₂@CTS的制備：

用微乳液法制備TiO₂@CTS，納米二氧化鈦50mg，羧丁基殼聚糖50mg，4.2ml環(huán)己烷，1mlTritonX-100，1ml正己醇，共同加入18ml ddH₂O，37攝氏度磁力攪拌2h，所得溶液體系用PBS 3000rpm離心清洗2遍，4度冰箱放置留用。

2、TiO₂@CTS的表征：

應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察形態(tài)(圖1a)：TiO₂呈邊界清晰的球形，粒徑約20-30nm，顆粒分散均勻。與殼聚糖結(jié)合后形成球形的TiO₂@CTS顆粒后邊界模糊，電鏡觀察羥基殼聚糖已成功復(fù)合至二氧化鈦的表面。圖1b顯示三組材料的Zeta電位值分別為：殼聚糖-19mv、TiO₂ 8.3mv，TiO₂@CTS通過(guò)靜電相互作用表現(xiàn)出輕微的負(fù)電荷約-2.9mv。上述結(jié)果充分說(shuō)明羥基-殼聚糖可以結(jié)合二氧化鈦復(fù)合材料，并可用于進(jìn)一步的生物學(xué)研究。

3、TiO₂@CTS生物安全性評(píng)價(jià)：

應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)證明，經(jīng)不同濃度TiO₂@CTS處理的MC3T3細(xì)胞均保持良好增長(zhǎng)(圖2)。

血液相容性實(shí)驗(yàn)：

如圖3所示：與對(duì)照組相比，TiO₂@CTS組未見明顯的溶血反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了TiO₂@CTS納米粒子的生物安全性。

4、TiO₂@CTS的成骨水平的觀察：

采用12只新西蘭大白兔，每只體重2.5Kg，于兔頂蓋骨區(qū)制作骨缺損模型，并在各缺損區(qū)域內(nèi)植入不同材料。手術(shù)過(guò)程如下：兔全身麻醉后顱頂部備皮，常規(guī)外科消毒后沿顱頂中線切開皮膚，暴露骨膜，切開顱骨骨膜，于顱骨骨膜下分離，顯露頂骨。以直徑5mm取骨環(huán)鉆在兩側(cè)頂骨以顱骨中線對(duì)稱制造4處環(huán)形骨缺損區(qū)，去除外側(cè)顱骨板，直徑5mm，深約1mm。4處環(huán)形骨缺損區(qū)分別充填：Matrigle(A組空白對(duì)照組)、TiO₂@CTS(B組)、TiO₂@CTS+BMPs(C組)、異種異體骨粉(D組即陽(yáng)性對(duì)照組)，將軟組織復(fù)位逐層縫合。術(shù)后8周處死動(dòng)物，顱骨取材后應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色對(duì)不脫鈣骨組織標(biāo)本觀察，評(píng)價(jià)溫敏性羥基幾丁糖與rhBMP-2/TiO₂納米微球緩釋系統(tǒng)的成骨水平。

結(jié)果顯示：術(shù)后1周，新西蘭兔顱頂傷口均達(dá)到I期愈合，未出現(xiàn)傷口感染或裂開現(xiàn)象。術(shù)后8周，處死動(dòng)物并取標(biāo)本。肉眼觀察A組無(wú)明顯骨組織生長(zhǎng)，B組、C組和D組可見骨組織生長(zhǎng)。

組織病理學(xué)觀察比較各組不脫鈣的骨組織切片：除A組未見明顯骨組織生長(zhǎng)外(圖4a)，其余3組均可見新骨組織形成，有哈弗氏管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，B組可見新骨片狀形成，材料區(qū)較稀疏邊緣區(qū)較致密(圖4b)；C組可見骨組織形成片狀互相連接，結(jié)構(gòu)較均勻(圖4d)；D組可見骨組織由邊緣區(qū)向材料區(qū)生長(zhǎng)(圖4b)；上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TiO₂@CTS能夠有效促進(jìn)成骨的生長(zhǎng)。

骨形態(tài)測(cè)量學(xué)檢查：光學(xué)顯微鏡(Olympus P70，日本)下不同放大倍數(shù)(×4，×10，×20，×40)觀察骨組織再生情況并采集圖片，使用Image-ProPlus6.0(MediaCybemetics,美國(guó))圖像分析軟件，選定新生骨區(qū)域，測(cè)量新生骨組織所占面積(見圖5、圖6)。結(jié)果表明：A組新生骨所占面積為(2.99±5.11)％，B組為(42.23±5.69)％，C組為(63.04±4.56)％，D組為(37.71±7.23)％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩組間比較，結(jié)果A組與其他各組有明顯差異，C組與B、D組有明顯差異，B組與D組間無(wú)明顯差異。表明TiO₂@CTS具有與骨粉類似的成骨作用，而TiO₂@CTS+BMPs成骨作用更好。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。