本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及頭孢呋辛酯的新用途，具體涉及頭孢呋辛酯的藥物組合物及其在脫發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：頭孢呋辛酯為頭孢呋辛的乙酰乙酯。在體內(nèi)水解后釋出頭孢呋辛而發(fā)揮其抗菌活性，頭孢呋辛酯之作用機制、抗菌譜和抗菌作用皆與頭孢呋辛同。與其他口服頭孢菌素相比，頭孢呋辛酯對革蘭陽性球菌包括肺炎雙球菌、A組(溶血性)鏈球菌和金葡菌作用并不弱，而對革蘭陰性菌如淋球菌、流感桿菌、卡他摩拉菌和大腸桿菌科等的作用則優(yōu)于頭孢克洛(cefaclor)。頭孢呋辛酯為第二代頭孢菌素類抗生素。口服經(jīng)胃腸道吸收后，在酯酶作用下迅速水解為頭孢呋辛而發(fā)揮抗菌作用。對革蘭陽性球菌的活性與第一代頭孢菌素相似或略差，但對葡萄球菌和革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶顯得相當(dāng)穩(wěn)定。除耐甲氧西林葡萄球菌、腸球菌屬和李斯特菌屬外，其他陽性球菌(包括厭氧球菌)對頭孢呋辛酯均敏感。頭孢呋辛酯對金黃色葡萄球菌的抗菌活性較頭孢唑啉差，1～2mg/L的頭孢呋辛酯可分別抑制對青霉素敏感和耐藥的全部金黃色葡萄球菌。迄今為止，尚未見頭孢呋辛酯及其藥物組合物與脫發(fā)的相關(guān)性報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種頭孢呋辛酯的藥物組合物，該藥物組合物中含有頭孢呋辛酯和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，頭孢呋辛酯和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療脫發(fā)。本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：一種頭孢呋辛酯的藥物組合物，包括頭孢呋辛酯、化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型；所述化合物(Ⅰ)具有如下結(jié)構(gòu)式：進一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。進一步地，化合物(Ⅰ)是從防風(fēng)中分離出來的天然化合物，它包含以下分離步驟：(a)將防風(fēng)粉碎，用75～85％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用25％乙醇洗脫8個柱體積，再用70％乙醇洗脫12個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72％的甲醇水溶液等度洗脫，收集10～16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)。進一步地，化合物(Ⅰ)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。上述頭孢呋辛酯的藥物組合物在制備治療脫發(fā)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明提供的頭孢呋辛酯的藥物組合物中含有頭孢呋辛酯和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，頭孢呋辛酯和該天然產(chǎn)物單獨作用時，對脫發(fā)具有治療作用；二者聯(lián)合作用時，對脫發(fā)的治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療脫發(fā)的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。具體實施方式下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。實施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證分離方法：(a)將防風(fēng)(2kg)粉碎，用80％乙醇熱回流提取(15L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用25％乙醇洗脫8個柱體積，再用70％乙醇洗脫12個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1(10個柱體積)、45:1(8個柱體積)、25:1(10個柱體積)和15:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1(10個柱體積)、15:1(8個柱體積)和1:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72％的甲醇水溶液等度洗脫，收集10～16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(HPLC歸一化純度大于98％)。結(jié)構(gòu)確證：HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z469.3238，結(jié)合核磁特征可得分子式為C30H44O4，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，CDCl3，600MHz)：H-1(1.49，m)，H-1(2.87，ddd，J＝13.3，7.0，4.2Hz)，H-2(2.41，ddd，J＝15.4，6.8，4.2Hz)，H-2(2.65，ddd，J＝15.4，11.2，7.0Hz)，H-5(1.37，d，J＝11.2Hz)，H-6(1.68，m)，H-6(1.93，m)，H-7(1.73，m)，H-7(1.87，m)，H-9(1.60，d，J＝9.4Hz)，H-11(4.17，d，J＝9.1Hz)，H-15(5.43，d，J＝10.3Hz)，H-16(5.52，d，J＝10.3Hz)，H-18(2.46，d，J＝8.4Hz)，H-19(1.41，m)，H-20(1.10，m)，H-21(1.28，m)，H-21(1.48，m)，H-22(1.36，m)，H-22(1.51，m)，H-23(1.32，s)，H-24(9.82，s)，H-25(1.06，s)，H-26(1.17，s)，H-27(1.24，s)，H-28(0.87，s)，H-29(0.90，d，J＝6.3Hz)，H-30(0.93，d，J＝6.1Hz)，OH-11(3.13，s)，OH-12(4.73，brs)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δC(ppm，CDCl3，125MHz)：39.2(CH2，1-C)，22.3(CH2，2-C)，207.6(C，3-C)，34.5(C，4-C)，63.2(CH，5-C)，20.4(CH2，6-C)，40.9(CH2，7-C)，57.8(C，8-C)，51.6(CH，9-C)，38.2(C，10-C)，71.9(CH，11-C)，146.7(C，12-C)，119.2(C，13-C)，36.3(C，14-C)，128.9(CH，15-C)，139.5(CH，16-C)，41.4(C，17-C)，47.3(CH，18-C)，40.1(CH，19-C)，40.7(CH，20-C)，30.7(CH2，21-C)，39.2(CH2，22-C)，22.3(CH3，23-C)，201.1(CH，24-C)，15.7(CH3，25-C)，19.4(CH3，26-C)，20.9(CH3，27-C)，19.1(CH3，28-C)，17.2(CH3，29-C)，21.3(CH3，30-C)。紅外波譜表明該化合物含有羥基(3478cm-1)，羰基(1760cm-1)，雙鍵(1663cm-1)和醛基(1641cm-1)。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有30個碳信號，包括七個甲基，六個亞甲基，九個次甲基(一個連氧碳和兩個烯烴碳，一個醛基)，以及八個季碳(一個酮基，一個含氧烯屬季碳，一個烯屬季碳)，以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示的五個叔甲基質(zhì)子信號δH1.32(3H，s)，1.06(3H，s)，1.17(3H，s)，1.24(3H，s)和0.87(3H，s)，兩個仲甲基質(zhì)子信號δH0.90(3H，d，J＝6.3Hz)，0.93(3H，d，J＝6.1Hz)以及1H-NMR數(shù)據(jù)表明該化合物為烏蘇烷型三萜類化合物。HMBC譜中H-5和H3-23與C-24的相關(guān)性表明C-4位連有一個醛基，NOESY譜中H-24與H3-25的相關(guān)信號暗示醛基處在β位。從紅外譜中可知結(jié)構(gòu)中含有羥基，而從1H-NMR數(shù)據(jù)可知含有兩個羥基。HMBC譜中H-9和H-18與C-12，H-18和H3-27與C-13，OH-12與C-12相關(guān)信號以及它們的碳化學(xué)位移表明該化合物存在烯醇式結(jié)構(gòu)，羥基連接在C-12位與C-12和C-13形成的雙鍵構(gòu)成烯醇式結(jié)構(gòu)，此外根據(jù)HMBC譜中OH-11與C-11的相關(guān)信號以及化學(xué)位移確認(rèn)另一個-OH連在C-11位。另C-15與C-16也形成雙鍵結(jié)構(gòu)，C-3位形成酮基。HMBC譜中H3-23和H-24與C-3的相關(guān)性以及它們的碳化學(xué)位移進一步確證C-3位形成酮基。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：實施例2：藥理作用脫發(fā)是一種最常見皮膚疾病。長期以來，人們一直致力于尋找和研發(fā)治療脫發(fā)的藥物，如糖皮質(zhì)激素、米諾地爾等。然而到目前為止，尚沒有一種藥物能完全治愈脫發(fā)，且存在較大的不良反應(yīng)。因此，開發(fā)療效確切、無不良反應(yīng)的防治脫發(fā)的藥物具有重要的社會意義和經(jīng)濟意義。本實施例采用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)建立小鼠脫毛模型，觀察藥物對改善脫毛小鼠毛發(fā)生長的作用。1、材料與方法1.1動物SPF級，雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～20g，上海斯萊克實驗動物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫控制在24～26℃，光線每12h明暗交替，自由進食，隔日更換墊料。1.2試劑與樣品頭孢呋辛酯購自中國藥品生物制品檢定所?；衔?Ⅰ)自制，制備方法見實施例1。環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。CBA檢測試劑盒(美國，BD公司)、CD4檢測試劑盒(上海穎心實驗室設(shè)備有限公司)、CD8檢測試劑盒(上海穎心實驗室設(shè)備有限公司)。1.3儀器JEM-1010型電鏡(日本，日本電子公司)、C6型流式細(xì)胞儀(美國，BD公司)、MK3型酶標(biāo)儀(美國，Thermo公司)。1.4小鼠分組及模型制備C57BL/6小鼠用麻醉機麻醉。麻醉后，將松香和石蠟按1∶1的比例混合加熱融化，并均勻涂抹于項背部，凝固變硬后揭去，誘導(dǎo)生長期毛發(fā)，每只小鼠脫毛面積約為2.0cm×2.0cm。注意不要燙傷小鼠皮膚。脫毛后9天(小鼠背部皮膚誘導(dǎo)生長期毛囊產(chǎn)生)，根據(jù)隨機數(shù)字表，將小鼠分為5組，每組20只，分別是空白對照組、模型對照組、頭孢呋辛酯組(280mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)組(280mg·kg-1)、頭孢呋辛酯與化合物(Ⅰ)組合物組【140mg·kg-1頭孢呋辛酯+140mg·kg-1化合物(Ⅰ)】。所有小鼠脫毛區(qū)皮下注射CTX150mg/kg后，模型組任其自然生長，空白對照組給予生理鹽水(100mg/kg)灌胃治療，其他組藥物灌胃治療，持續(xù)8周。1.5組織取材分別在給藥后1、2、4、8周，每組隨機選取小鼠各5只，行眼眶采血，每只1～2mL。用于ELISA檢測：每組取2個血樣，加入EDTA抗凝，3000r/min離心30min取上清，于－20℃保存?zhèn)溆?。用于流式?xì)胞術(shù)檢測：每組取3個血樣，分離血清，于-70℃保存?zhèn)溆谩Ｋ袆游锶⊙罅⒓刺幩?，取其脫毛區(qū)域皮膚組織。經(jīng)10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片，切片厚4～5μm，-80℃下保存?zhèn)溆谩?.6ELISA檢測外周血CD4+、CD8+表達水平樣本室溫下平衡20min。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔。空白孔什么都不加，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。待測樣本先加樣本稀釋液40μL，再加待測樣本10μL，隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔(空白孔不加)加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱孵育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)5次。所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。加終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔OD值。統(tǒng)計CD4和CD8的OD值，將CD4/CD8均值作為結(jié)果進行統(tǒng)計分析。1.7統(tǒng)計學(xué)方法結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較應(yīng)用單因素方差分析。2、實驗結(jié)果2.1體質(zhì)量變化和毛發(fā)生長情況小鼠經(jīng)CTX誘導(dǎo)脫毛至實驗結(jié)束，各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異(P＞0.05)。脫毛小鼠經(jīng)頭孢呋辛酯、化合物(Ⅰ)、頭孢呋辛酯與化合物(Ⅰ)組合物給藥后1～2周，各組小鼠脫毛區(qū)局部皮膚由粉色逐漸轉(zhuǎn)變成灰黑色，小鼠脫毛區(qū)皮膚灰黑色區(qū)域明顯比模型組和生理鹽水組要大；給藥至4～8周，各組小鼠脫毛區(qū)呈黑色，且有毛發(fā)逐漸長出、伸長。給藥組毛發(fā)相對于模型組和生理鹽水組，毛發(fā)更為致密。2.2對脫毛小鼠外周血CD4+/CD8+比值表達水平的影響頭孢呋辛酯組、化合物(Ⅰ)組、頭孢呋辛酯組與化合物(Ⅰ)組合物組外周血CD4+/CD8+比值隨著時間的延長，呈下降趨勢。1、2、3、4周，與模型對照組比，頭孢呋辛酯組與化合物(Ⅰ)組合物組外周血CD4+/CD8+比值顯著下降(P＜0.01)；與模型對照組比，頭孢呋辛酯組、化合物(Ⅰ)組外周血CD4+/CD8+比值下降(P＜0.05)。試驗結(jié)果見表1。表1對脫毛小鼠外周血CD4+/CD8+比值表達水平的影響組別1周2周3周4周模型對照組5.48±0.065.37±0.054.99±0.094.83±0.11頭孢呋辛酯組5.15±0.054.76±0.064.40±0.174.12±0.08化合物(Ⅰ)組4.87±0.024.34±0.134.16±0.063.65±0.27頭孢呋辛酯與化合物(Ⅰ)組合物組3.94±0.043.67±0.023.29±0.252.94±0.08脫毛模型最常用實驗動物為C57BL/6小鼠，由于其為有色種屬，皮膚顏色隨毛囊的發(fā)育而表現(xiàn)不同的顏色，是研究毛囊發(fā)育和再生一種很好的實驗動物。目前關(guān)于脫發(fā)的病理生理機制尚未明確，可能的原因主要與局部感染、神經(jīng)毒物、精神抑郁、內(nèi)分泌因素等因素相關(guān)。近年來隨著遺傳、基因、分子水平的不斷發(fā)展，國內(nèi)外諸多學(xué)者認(rèn)為脫發(fā)主要是一種由T細(xì)胞免疫介導(dǎo)的自身免疫性炎癥疾病，由于毛囊異常暴露于潛在免疫活性的免疫系統(tǒng)，再通過毛囊的抗原物質(zhì)激活強大的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)釋放大量炎癥，繼而引起脫發(fā)。CD4+和CD8+T細(xì)胞在脫發(fā)患者毛囊內(nèi)及周圍的浸潤是引起毛發(fā)脫落的關(guān)鍵，CD8+T細(xì)胞一直被認(rèn)為對毛囊發(fā)揮直接的細(xì)胞毒作用，而CD4+T細(xì)胞起輔助細(xì)胞作用，在脫發(fā)的發(fā)病過程中兩者是共同發(fā)揮作用的。頭孢呋辛酯、化合物(Ⅰ)、頭孢呋辛酯組與化合物(Ⅰ)組合物維持治療對脫毛小鼠具有明顯療效，顯著改善了小鼠脫毛區(qū)的毛發(fā)生長情況，通過下調(diào)外周血CD4+/CD8+比值來發(fā)揮作用，為臨床脫發(fā)的藥物治療提供了新的治療方案。其中，頭孢呋辛酯和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，對毛發(fā)生長的改善作用效果顯著，優(yōu)于頭孢呋辛酯或化合物(Ⅰ)單獨的作用效果，可以開發(fā)成防治脫發(fā)的藥物。上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3