本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料領域，具體涉及一種抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料的制備方法。

背景技術(shù)：

感染性骨缺損由于存在感染和骨缺損的雙重病變，治療棘手，療程長，且易出現(xiàn)肌肉萎縮、局部瘢痕而致肢體功能受到嚴重影響。迄今為止，感染性骨缺損仍是臨床上比較棘手和亟待解決的治療難題。感染之后細菌在植入體表面形成生物膜而使單純的植骨術(shù)因感染不易控制而失敗，因此患者往往不能進行一期植骨，而需徹底清創(chuàng)，待感染因素消除、傷口愈合、血管重建后再進行二期植骨修復骨缺損。這種治療方法既增加了患者的痛苦，也延長了治療時間。局部藥物釋放系統(tǒng)（DDS），通過載體將抗生素釋入局部，可以在感染局部獲得較高的血藥濃度，且能夠長期維持局部有效抑菌濃度，避免全身毒副反應，在抑制感染的同時實現(xiàn)對骨缺損的修復。

α型半水硫酸鈣作為骨修復材料，因其在缺損部位的原位自固化性能、可降解、接近人松質(zhì)骨的力學性能；固化后形成大量微孔；不明顯釋放大量熱而不影響所裝載藥物活性以及促進骨愈合等優(yōu)良性能，已作為產(chǎn)品被臨床上使用。硫酸鈣作為骨缺損的填充物，阻止軟組織長入；降解形成的局部微環(huán)境及局部高濃度的鈣離子有利于血管和成骨細胞的長入，促進成骨細胞的增殖、分化，調(diào)節(jié)類骨質(zhì)的形成。在對半水硫酸鈣材料生物活性的提高中需從成份上加入礦化的有機成分和從結(jié)構(gòu)上增加材料的多級性，實現(xiàn)進一步的仿生。同時有機高分子材料絲素微球的加入可降低硫酸鈣材料的脆性而提高材料的韌性。而且在材料中加入高分子的載藥微球，可以實現(xiàn)藥物的持續(xù)釋放。硫酸鈣具有良好生物相容性，尤其具有本位自固化性及可塑性，結(jié)合礦化納米絲素纖維材料的骨誘導修復能力的特點，本發(fā)明研制一種具有本位自固化性能，又具有良好骨誘導修復能力的骨植入修復材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料的制備方法，使其具有可調(diào)控的藥物釋放速度，初期釋放和后續(xù)持續(xù)釋放結(jié)合的釋放特點。具體的提出硫酸鈣與萬古霉素直接結(jié)合作為初期釋放載體，硫酸鈣與載萬古霉素絲素微球結(jié)合作為后期釋放載體，實現(xiàn)了藥物的持續(xù)可控釋放。

一種抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料，其特征是由5wt%~10wt%二水硫酸鈣、5wt%~10wt%載萬古霉素絲素微球、5wt%萬古霉素、75wt%~85wt%α型半水硫酸鈣作為固相原料，濃度為3wt%~15wt%的礦化絲素納米纖維溶液作為液相原料。制備抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料。

上述固相原料與液相原料混合成漿體，其載萬古霉素絲素微球的載藥率為4.03wt%~4.72wt%；液固比為0.5mL/g~0.7mL/g；固化后為多孔結(jié)構(gòu)，其孔隙率為30%~40%。

一種抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料的制備方法，包括以下步驟：

（1）水熱法制備α型半水硫酸鈣：將300 g 二水硫酸鈣與1.5 g油酸鈉充分混和，加入1200mL 蒸餾水攪拌均勻后置于密閉的高壓反應釜中，加熱至120 ℃，此時壓力約為0.138MPa,保持壓力恒溫加熱7 h。然后取出所制備材料放置在 120 ℃的電熱通風干燥箱中干燥4 h，然后自然冷卻至室溫，用研缽研磨，180目塞子過篩，制得粒徑均一的α型半水硫酸鈣粉末。

（2）載藥絲素微球的制備：按萬古霉素與絲素蛋白質(zhì)量比為1：20將萬古霉素加入濃度為20mg/mL~60mg/mL的絲素溶液中，在常溫下，磁力攪拌30 min，獲得載藥絲素溶液。實驗中，取絲素溶液的濃度分別為20 mg/mL、40 mg/mL和60 mg/mL。向500 mL燒杯中加入100 mL乙酸乙酯，并用移液管加入2 mL Span80，常溫下，將二者攪拌混合15 min后，采用注射器將2 ml濃度為20mg/mL~60mg/mL的絲素溶液逐滴滴入攪拌的混合溶液中。持續(xù)攪拌2 h，絲素微球?qū)腋∮谝宜嵋阴ブ小ξ⑶蛳礈烊?，通過冷凍干燥機在-50 ℃條件下凍干12 h，收集微球以備用。

（3）礦化絲素納米纖維溶液的制備：將絲素蛋白溶液在 60℃ 下緩慢濃縮 24h，得到濃度為20 wt%的較為均一的絲素納米粒溶液。稀釋至0.5wt%，在60℃烘箱中密封培養(yǎng)24h，制備出直徑為15~50nm、長度 1~2μm 的絲素納米纖維。將50mL10倍PBS加入10mL絲素納米纖維溶液中，反應12h。取沉淀，加入蒸餾水清洗。靜置，取沉淀。重復多次，得礦化絲素納米纖維溶液。

將5wt%~10wt%二水硫酸鈣、5wt%~10wt%載藥絲素微球、5wt%萬古霉素、75wt%~85wt%α型半水硫酸鈣作為固相，濃度為3wt%~15wt%的礦化絲素納米纖維溶液作為液相。制備抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料。

本發(fā)明的有益效果為：在液/固比為0.5mL/g~0.7mL/g時，材料具有良好的自固化性能。材料具有良好的生物相容性、力學性能、藥物緩釋性能，及促成骨細胞的粘附。

具體實施方式

實施例1

α型半水硫酸鈣的制備：將300 g 二水硫酸鈣與1.5 g油酸鈉充分混和，加入1200mL 蒸餾水攪拌均勻后置于密閉的高壓反應釜中，加熱至120 ℃，壓力為0.138MPa，保持壓力恒溫加熱7 h。然后取出所制備材料放置在 120 ℃的電熱通風干燥箱中干燥4 h，自然冷卻至室溫，用研缽研磨，180目塞子過篩，制得粒徑均一的α型半水硫酸鈣粉末。

載藥絲素微球的制備：按萬古霉素與絲素蛋白質(zhì)量比為1：20將萬古霉素加入絲素蛋白溶液中，在常溫下，磁力攪拌30 min，獲得濃度為20mg/mL~60mg/mL的載藥絲素溶液。實驗中，取載藥絲素溶液的濃度分別為20 mg/mL、40 mg/mL和60 mg/mL。向500 mL燒杯中加入100 mL乙酸乙酯，并用移液管加入2 mL Span80，常溫下，將二者攪拌混合15 min后，采用注射器將2 mL濃度是20 mg/mL或40 mg/mL或60 mg/mL的載藥絲素溶液逐滴滴入攪拌的混合溶液中。持續(xù)攪拌2 h，載藥絲素微球?qū)腋∮谝宜嵋阴ブ小Ｈ〕鲚d藥絲素微球洗滌三次，通過冷凍干燥機在-50 ℃條件下凍干12 h，備用。

礦化絲素納米纖維溶液的制備：將絲素蛋白溶液在 60℃ 下緩慢濃縮 24h，得到濃度為20 wt%的絲素納米粒溶液。將絲素納米粒溶液稀釋至0.5wt%，在60℃烘箱中密封培養(yǎng)24h，制備出直徑為15nm~50nm、長度 1μm~2μm 的絲素納米纖維溶液。將50mL 10倍PBS加入10mL絲素納米纖維溶液中，反應12h。取沉淀物，加入蒸餾水清洗。靜置，取沉淀。重復多次，得礦化絲素納米纖維溶液。

將0.1g二水硫酸鈣、0.1g載藥絲素微球、0.1g萬古霉素、1.7g α型半水硫酸鈣混合均勻。加入1mL~1.4mL濃度為3wt%~15wt%礦化納米絲素纖維溶液，制得抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料。

測得抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料的終凝時間為47min~61min,抗壓強度為5.63MPa~7.11MPa，壓縮斷裂功為12.99J~16.83J。

同時隨著絲素濃度從20mg/mL增加到60mg/mL，載藥絲素微球的藥物釋放速率逐漸減小，此材料0d~6d藥物釋放率為22%~24%， 0d~22d藥物釋放率為60%~63%，載藥率、包封率為4.26%~4.44%、86.94%~91.04%，抑菌環(huán)直徑為18.67mm~20.59mm。

實施例2

α型半水硫酸鈣、載藥絲素微球、礦化絲素納米纖維溶液的制備同實例1。

將0.1g二水硫酸鈣、0.2g載藥絲素微球、0.1g萬古霉素、1.6g α型半水硫酸鈣混合均勻。加入1mL~1.4mL濃度為3wt%~15wt%礦化納米絲素纖維溶液，制得抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料。測得材料的終凝時間為92min~130min，抗壓強度為4.53MPa~6.35MPa，壓縮斷裂功為14.59J~18.83J。隨著絲素濃度從20mg/mL增加到60mg/mL，載藥絲素微球的藥物釋放速率逐漸減小，此材料0d~6d藥物釋放率為15%~17%， 0d~22d藥物釋放率為39%~42%，載藥率、包封率為4.46%~4.64%、87.98%~92.08%，抑菌環(huán)直徑為18.02mm~21.94mm。

實施例3

α型半水硫酸鈣、載藥絲素微球、礦化絲素納米纖維溶液的制備同實例1。

將0.2g二水硫酸鈣、0.2g載藥絲素微球、0.1g萬古霉素、1.5g α型半水硫酸鈣混合均勻。加入1mL~1.4mL濃度為3wt%~15wt%礦化納米絲素纖維溶液，制得抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料。測得材料的終凝時間為36min~50min，抗壓強度為4.25MPa~5.99MPa，壓縮斷裂功為15.38J~19.41J。隨著絲素濃度從20mg/mL增加到60mg/mL，載藥絲素微球的藥物釋放速率逐漸減小，此材料0d~6d藥物釋放率為16%~19%， 0d~22d藥物釋放率為36%~39%，載藥率、包封率為4.54%~4.72%、87.29%~91.39%，抑菌環(huán)直徑為19.73mm~21.27mm。

實施例4

α型半水硫酸鈣、載藥絲素微球、礦化絲素納米纖維溶液的制備同實例1。

將0.2g二水硫酸鈣、0.1g載藥絲素微球、0.1g萬古霉素、1.6g α型半水硫酸鈣混合均勻。加入1mL~1.4mL濃度為3wt%~15wt%礦化納米絲素纖維溶液，制得抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料。測得材料的終凝時間為21min~35min，抗壓強度為5.12MPa~6.66MPa，壓縮斷裂功為13.29J~16.89J。隨著絲素濃度從20mg/mL增加到60mg/mL，載藥絲素微球的藥物釋放速率逐漸減小，此材料0d~6d藥物釋放率為16%~18%， 0d~22d藥物釋放率為45%~48%，載藥率、包封率為4.03%~4.21%、86.04%~90.14%，抑菌環(huán)直徑為19.14mm~20.62mm。

實施例5

二水硫酸鈣質(zhì)量為0.2g、載藥絲素微球質(zhì)量為0.1g、萬古霉素質(zhì)量為0.1g、α型半水硫酸鈣質(zhì)量為1.6g。加入1.2mL濃度為5wt%礦化納米絲素纖維溶液攪拌均勻，測得終凝時間為29min±3min，抗壓強度為6.65MPa±0.06 MPa，壓縮斷裂功為15.82J±0.30J。絲素濃度為40mg/mL時，此材料0d~6d藥物釋放率為16%±1%， 0d~22d藥物釋放率為45%±1%，載藥率、包封率為4.34%±0.03%、96.38%±0.05%，抑菌環(huán)直徑為19.88mm±0.53mm。制得抗感染硫酸鈣/載藥絲素微球/礦化絲素納米纖維骨修復材料凝固時間可控制在30min左右，并滿足松質(zhì)骨力學性能、具有良好的抑菌性能及藥物釋放性能，最復合臨床手術(shù)要求。

說明：本說明書中的PBS是磷酸緩沖鹽溶液。