技術領域

本發(fā)明涉及獸用中藥組合物技術領域，具體涉及一種用于治療豬大腸桿菌性腹瀉的中藥組合物及其制備方法。

背景技術：

中獸醫(yī)藥中的許多中藥和方劑具有抗菌或抑菌作用,并且具有抗菌譜廣、毒副作用小、效果良好和不易產(chǎn)生耐藥性的特點，可以直接作用于微生物的結(jié)構(gòu)和代謝而發(fā)揮抑菌作用?？咕蝎F藥的種類繁多，主要來源于植物，也來源于動物性藥物。中獸藥的抑菌抗菌作用，已經(jīng)不僅局限在清熱解毒類藥物，而且瀉下、補虛等藥物也具有抑菌功效。

中獸藥抗菌的物質(zhì)基礎是活性成分，目前已知多為生物堿、酸類、酮類、醛類、酚類和揮發(fā)油等，如小檗堿、白頭翁素、穿心連內(nèi)酯、苯甲酸、齊墩果酸、山犁酸、葵酰乙醛、大黃素、蒜辣素、熊果甙、白屈菜紅堿、德西明堿、焊菜素等均為活性成分。

中獸藥的抗菌機制非常的繁雜和多樣化，有的抗菌中草藥體內(nèi)外抗菌效果并不一致,如丹皮、知母、黃連等，雖在體外抗菌力弱,但服用后卻有良好療效,即使在濃度很低時也能抑制金黃色葡萄球菌酶的形成,從而發(fā)揮抗菌作用。所以，體外抑菌試驗對中草藥的抗菌作用只能是一種參考性的方法,實際臨床應用效果還必須通過動物體內(nèi)試驗加以比較、驗證,從而進一步閘明其抑菌機理。

對于一些已對抗生素產(chǎn)生耐藥性的細菌,中獸藥對其仍然有良好的效果。研究表明,禽大腸桿菌對石榴皮、訶子、黃答等敏感性較高,同時發(fā)現(xiàn)部分中藥組合對各種血清型大腸桿菌具有抑菌作用,體現(xiàn)了中藥的配伍優(yōu)勢。微生物產(chǎn)生的毒素在感染性疾病中可引起多種病理和組織損傷,對于一些細菌性疾病如大腸桿菌性腹瀉,采用抗菌素可抑制或者殺滅病原微生物,但是不能消除細菌生長或者死亡后釋放出的毒素對機體的損傷。采用中獸藥能對抗多種病原微生物毒素以及阻止毒素對機體的損害作用。研究表明,甘草主要成分甘草甜素及甘草次酸對破傷風毒素具有明顯的中和作用；金銀花、連翹提取物除具有體外抑菌作用以外,還具有抗大腸桿菌熱敏腸毒素的作用中草藥訶子和五倍子的提取物對多數(shù)細菌如沙門氏菌、大腸桿菌和葡萄球菌等有較強的抑菌作用，其他中草藥提取物如黃連、大黃等也具有很好的抑制細菌的作用，這些中獸藥可以作為抑制細菌的最好選擇。

大腸桿菌是人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細菌，周身鞭毛，能運動，無芽孢主要生活在大腸內(nèi)，代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧性。正常情況下，大多數(shù)大腸桿菌是非常安分守己的，不會給本身帶來任何危害，但當機體免疫力降低、腸道長期缺乏刺激等情況下，它們會移到腸道以外的地方，造成相應部位的感染或全身散播性感染。豬大腸桿菌性腹瀉是由原性大腸桿菌引起的仔豬腸道傳染性疾病。常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病三種，以發(fā)生腸炎、腸毒血癥為特征。

通過體外抑菌試驗可以初步判斷中獸藥復方抑菌作用的大小，通過體外抑菌試驗可以篩選獲得有效的中藥組方，為畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展起到積極的保障作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供了一種新的、安全有效的用于治療豬大腸桿菌性腹瀉的中藥組合物及其制備方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為：一種用于治療豬大腸桿菌性腹瀉的中藥組合物，是由按照重量份計的以下原料藥制備得到的：紫花地丁6-12份、車前子6-12份、敗醬草6-12份、五倍子3-6份、黃連5-10份、厚樸4-8份、黃柏5-10份、五味子4-8份、大黃2-4份、吳芋5-10份、虎杖6-12份、板藍根6-12份、威靈仙4-8份、山豆根4-8份。

本發(fā)明的第二個目的是提供了上述的一種用于治療豬大腸桿菌性腹瀉的中藥組合物的制備方法，包括以下步驟：

1）按照上述的重量配比，分別準確稱取紫花地丁30-60g、車前子30-60g、敗醬草30-60g、五倍子15-30g、黃連25-50g、厚樸20-40g、黃柏25-50g、五味子20-40g、大黃10-20g、吳芋25-50g、虎杖30-60g、板藍根30-60g、威靈仙20-40g、山豆根20-40g，放置于20L-30L的圓筒鍋中，加水10-15L，浸泡30-60分鐘；

2）將加入原料藥的圓筒鍋放置于加熱器上，2200W條件下加熱30分鐘至沸騰，然后降低加熱器功率到600W,使其慢慢煮沸40-60min，用紗布進行過濾，得到第一次煎煮過濾的濾液，保存?zhèn)溆茫?/p>

3）將第一次煎煮過濾的濾渣，再加入10-15L純凈水，2200W條件下加熱30分鐘至沸騰，然后降低加熱器功率到600W,使其慢慢煮沸40-60min，用紗布進行過濾，得到第二次煎煮過濾的濾液，保存?zhèn)溆茫?/p>

4）合并第一次煎煮過濾的濾液和第二次煎煮過濾的濾液，2200W條件下加熱25分鐘至沸騰，然后降低加熱器功率到1200-1600W，煮沸360-420min，揮發(fā)多余水分后得到中藥組合物濃縮液750-800ml，冷卻后密封保存于4℃冰箱備用。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的一種用于治療豬大腸桿菌性腹瀉的中藥組合物及其制備方法，是根據(jù)中獸醫(yī)藥學辨證施治理論和傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗，結(jié)合現(xiàn)代免疫藥理和臨床獸醫(yī)學等技術方法，對中草藥進行組方篩選，其中板藍根具有清熱解毒、涼血、抗菌功效，黃柏能清熱燥濕、瀉火解毒、退熱除蒸，紫花地丁也具有清熱解毒功效，該中藥組方是治療豬大腸桿菌性腹瀉的有效組方，其組方合理，安全有效，原料易得，制備工藝簡單，易于操作。經(jīng)過應用試驗驗證，中藥組合物各劑量試驗組治療有效率均高于對照組，且中劑量中藥組合物的有效率為100%，該制劑在臨床上具有廣闊的推廣應用價值。

附圖說明

圖1為大黃素標準品的曲線圖。

圖2為復方藥中大黃素的含量測定結(jié)果。

圖3為標準品曲線圖。

具體實施方式

實施例1：

治療豬大腸桿菌性腹瀉的中藥組合物的制備方法：

1 材料與方法：

1.1材料：

菌種：

大腸桿菌（購自中國工業(yè)微生物菌種管理與保藏中心）

藥材：

紫花地丁、車前子、敗醬草、五倍子、黃連、厚樸、黃柏、五味子、大黃、吳芋、虎杖、板藍根、威靈仙、山豆根。

對照品：

鹽酸小檗堿、大黃酸、大黃素甲醚、齊墩果酸、苦參堿、氧化苦參堿、沒食子酸、五味子甲素、精氨酸、大黃素。

試劑：

MH(A)培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術有限責任公司）、MH(B)培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術有限責任公司）、甲醇（色譜純）、甲苯、乙酸乙酯（煙臺市雙雙化工有限公司）、甲酸（萊陽市雙雙化工有限公司）、氫氧化鈉、苯、異丙醇（分析純）、氨水、鹽酸、乙醚、三氯甲烷、石油醚（煙臺市雙雙化工有限公司）、甲酸乙酯（天津市凱信化學工業(yè)有限公司）、硫酸、無水乙醇（天津市北聯(lián)精細化學開發(fā)有限公司）、環(huán)己烷、三乙胺(天津市凱信化學工業(yè)有限公司)、正丁醇、冰醋酸、酒石酸銅（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、香草醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、L-精氨酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

儀器：

ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、恒溫振蕩器（ZD-85，國華企業(yè)）、電子天平（AL204，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，國畫電器有限公司）、200g手提式高速萬能粉碎機（DFT-200，溫嶺市林大機械有限公司）、電磁爐、GOODLOOK-1000型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070，上海鴻都電子科技有限公司）、數(shù)控超聲波清洗器（KH7200DB,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、實驗室專用超純水機、Agilent Technologies 1290 Infinity 超高效液相色譜儀、TDZ4-WS臺式低速離心機、玻璃砂芯過濾裝置、DensiCHEK plus比濁儀、錐形瓶、漏斗、量筒、燒杯等。

2.方法：

2.1粉碎藥材：

取紫花地丁、車前子、敗醬草、五倍子、黃連、厚樸、黃柏、五味子、大黃、吳芋、虎杖、板藍根、威靈仙、山豆根15味藥材各200g-300g左右，粉碎成粉末，分開裝袋，保存。

2.2藥材的薄層鑒定：

薄層鑒定方法主要參考2010年版《中華人民共和國獸藥典》（二部）中的性狀鑒別方法對紫花地丁、車前子、敗醬草、五倍子、黃連、厚樸、黃柏、五味子、大黃、吳芋、虎杖、板藍根、威靈仙、山豆根15味藥材進行薄層鑒定。

2.3 藥材煎煮：

（1）復方藥豬細菌性腹瀉的配方：

分別準確稱取紫花地丁30-60g、車前子30-60g、敗醬草30-60g、五倍子15-30g、黃連25-50g、厚樸20-40g、黃柏25-50g、五味子20-40g、大黃10-20g、吳芋25-50g、虎杖30-60g、板藍根30-60g、威靈仙20-40g、山豆根20-40g，放置于20L-30L的圓筒鍋中，加水10-15L，浸泡30-60分鐘；

（2）將圓筒鍋放置于加熱器上，2200W條件下加熱約30分鐘至沸騰，然后降低加熱器功率到600W,使其慢慢煮沸40-60min，用普通紗布進行過濾，得濾液，保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）將第一次煎煮過濾的濾渣，再加入10-15L純進水， 2200W條件下加熱約30分鐘至沸騰，然后降低加熱器功率到600W,使其慢慢煮沸40-60min，用普通紗布進行過濾，得濾液，保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）合并兩次煎煮、過濾的濾液，2200W條件下加熱約25分鐘至沸騰，然后降低加熱器功率到1200-1600W,煮沸360-420min，揮發(fā)多余水分，得濃縮液約750-800ml，冷卻后密封保存于4℃冰箱備用。

實施例2：

中藥組合物對大腸桿菌的抑菌試驗：

1.高效液相色譜法測定煎煮液中大黃素的含量：

復方藥中選取虎杖的活性成分是大黃素，通過測出煎煮液中大黃素的濃度含量，從而換算得到中藥煎煮液的濃度含量。

1.1色譜條件：

流動相：質(zhì)量分數(shù)為0.1%的磷酸-甲醇（0min,V磷酸：V甲醇=27:73,1min100%甲醇），流速1.5ml/min，波長430nm，樣品、標準品進樣量為10μL。大黃素的最大吸收波長為290nm，在439nm有較大吸收。

1.2樣品處理：

吸取煎煮液0.5ml于離心管中，再加入4.5ml的甲醇，超聲處理30min之后用離心機（4000r/min）離心15min，最后用針管移取1ml上清液作為樣品儲備液。

1.3標準品處理：

精密稱取大黃素標準品5 mg，置于5ml容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度線,制備成1mg/ml標準品儲備液，備用。用移液管精密移取1ml標準品儲備液，置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，備用。

2.抑菌試驗、測最小抑菌濃度：

根據(jù)配置的MH（A）瓊脂培養(yǎng)基的體積吸取不同體積的復方藥煎煮液加于已加熱溶解的MH(A)培養(yǎng)基中對復方藥進行倍比稀釋，瓊脂中所含復方藥的濃度分別為0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、25μg/ml。在45℃下充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3-4mm，配置好的復方藥瓊脂平板應放入4℃冰箱保藏備用。然后用比濁儀調(diào)大腸桿菌菌液比濁度,使其達到0.5，向配好的復方藥平板中各加比濁度為0.5的大腸桿菌菌液50μL，再用涂布棒涂均勻，置于37℃培養(yǎng)18-20個小時后觀察實驗結(jié)果。

3. 實驗結(jié)果：

3.1薄層鑒定結(jié)果：

經(jīng)薄層鑒定確定此次復方藥中所用藥材均為地道藥材。

3.2復方藥中大黃素得含量測定結(jié)果：

大黃素標準品的曲線圖如圖1所示，復方藥中大黃素的含量測定結(jié)果如圖2所示，標準品曲線圖如圖3所示。

表1顯示為大黃素標準品的濃度與峰面積關系。

表2顯示為根據(jù)標準品曲線圖計算得到復方藥樣品大黃素含量。

表1

表2

因為此次高效液相色譜測出的結(jié)果是把復方藥煎煮液用甲醇稀釋了10倍所得，所以通過高效液相色譜測得該復方藥中大黃素的含量應為50μg/ml。

3.3抑菌試驗結(jié)果：

表3顯示為不同濃度的復方藥對大腸桿菌的抑制結(jié)果。

表3

其中，“— ”表示無菌生長 ，“＋ ”表示有菌生長， 隨“＋”數(shù)增加菌落長勢增強。觀察試驗結(jié)果得到該中獸藥復方對豬大腸桿菌的最小抑菌濃度為＜8μg/ml。

實施例3：

中藥組合物在豬大腸桿菌性腹瀉的臨床應用：

1. 試驗材料：

1.1中藥組合物由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制，其組方為：紫花地丁60g、車前子60g、敗醬草60g、五倍子30g、黃連50g、厚樸40g、黃柏50g、五味子40g、大黃120g、吳芋50g、虎杖60g、板藍根360g、威靈仙40g、山豆根40g，制備方法如上方法。

1.2 試驗動物：

甘肅永登縣某豬養(yǎng)殖場3日齡疑為大腸桿菌感染伴有腹瀉癥狀仔豬12只。

2 試驗方法：

2.1 藥物配置：

將中藥組合物按照以上方法制備后，稀釋、配置成濃度為8μg/ml的藥液，裝入干凈的棕色瓶中，密封，4℃放置備用。

2.2 試驗分組：

將12只仔豬隨機分為低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組、空白對照組4組，每組3只。

3 中藥組合物對豬大腸桿菌治療試驗：

3.1取配置濃度為8μg/ml的中藥組合物藥液，分別按照低劑量治療組（20ml）、中劑量治療組（30ml）、高劑量治療組（50ml），空白對照組不給藥，進行灌服，一日2次，連用3天，期間自由哺乳、飲水。

3.2 療效考核標準試驗期間，每日觀察試驗組仔豬腹瀉癥狀的情況，一個療程后統(tǒng)計腹瀉癥狀的改善情況，并計算有效率。

4. 試驗結(jié)果：

4.1中藥組合物對豬大腸桿菌性腹瀉的治療效果：

表4顯示為中藥組合物對豬大腸桿菌性腹瀉的治療效果，由表4可以看出，中藥組合物各劑量試驗組治療有效率均高于對照組，且中劑量中藥組合物的有效率為100%。因此，該制劑在臨床上具有廣闊的推廣應用價值。

表4

其中，有效率指能夠明顯改善腹瀉癥狀的仔豬與試驗組總仔豬數(shù)所占的比例（%）。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。