本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的組合物、其制備方法及用途。

背景技術(shù)：

免疫力是人體自身的防御機制，是人體識別和消滅外來侵入的任何異物(病毒、細(xì)菌等)，處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞以及識別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的能力。當(dāng)人體免疫功能降低或失調(diào)時，免疫系統(tǒng)不能正常發(fā)揮對機體的保護(hù)作用，從而引發(fā)疾病。

海藻是海洋植物中數(shù)量和品種最多的一類，多糖是其主要成分，具有增強機體免疫活性、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等作用；大量研究結(jié)果表明海藻多糖是通過多種機制激活免疫系統(tǒng)，提高機體特異性和/或非特異性免疫功能發(fā)揮這些作用的。其免疫調(diào)節(jié)作用主要包括促進(jìn)受損免疫器官的修復(fù)，提高單核巨噬細(xì)胞，T、B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞，紅細(xì)胞等的活性，促進(jìn)免疫分子如抗體、細(xì)胞因子等的釋放。

牡蠣是一種具有藥用價值的海洋經(jīng)濟(jì)貝類動物。

海藻及牡蠣在我國養(yǎng)殖水產(chǎn)品中占有重要的地位，不僅是天然保健食品，更是不可多得的天然藥品，對其加工利用對人類健康及生活質(zhì)量的提高具有重要意義。然而，對于由海藻和牡蠣殼組成的組合物的免疫調(diào)節(jié)作用，至今未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的組合物，由活性成分和任選的輔料組成，其特征在于所述活性成分是由海藻或脫脂海藻和牡蠣殼組成，或者由海藻或脫脂海藻和牡蠣殼經(jīng)提取所得到的提取物組成。

優(yōu)選地，在以上組合物中，按重量份計，海藻或脫脂海藻為5-10份、牡蠣殼為1-5份；優(yōu)選地，海藻或脫脂海藻為5-8份、牡蠣殼為2-5份；更優(yōu)選地，海藻或脫脂海藻為5-6份、牡蠣殼為3-5份；進(jìn)一步優(yōu)選地，海藻或脫脂海藻為10份、牡蠣殼為5份，或者海藻為10份、牡蠣殼為2份。

優(yōu)選地，在以上組合物中，所述活性成分為由海藻或脫脂海藻和牡蠣殼混合后，一起用溶劑提取所得到的提取物。

優(yōu)選地，在以上組合物中，其中提取溶劑選自水或者酸水；所述酸水優(yōu)選為pH 2-5(優(yōu)選3-5，進(jìn)一步優(yōu)選3-4，特別優(yōu)選pH3.5)的酸水溶液；其是藥學(xué)上可接受的有機或無機酸的水溶液，優(yōu)選為含選自鹽酸(HCl)、硫酸、硝酸、醋酸、草酸、馬來酸、甲磺酸中至少一種的水溶液，更優(yōu)選為含選自硫酸、鹽酸、醋酸中至少一種的水溶液。優(yōu)選地，海藻或脫脂海藻和牡蠣殼混合物料與溶劑的重量(以g計算)/體積(以mL計算)為1:8-20，優(yōu)選為1:8-15；更優(yōu)選1:10-13，最優(yōu)選1:12。優(yōu)選地，室溫浸泡0.5-2h后，加熱于60-100℃下提取2-4次，每次提取時間為1-4h，合并提取液，離心分出上清液，所得溶液減壓濃縮，得提取物。

優(yōu)選地，在以上組合物中，所述脫脂海藻是將海藻經(jīng)有機溶劑與水組成的混合溶劑浸泡、然后除去溶劑的脫脂處理所得到的；優(yōu)選地，室溫浸泡12－36小時，更優(yōu)選浸泡24小時后除去溶劑。優(yōu)選地，所述有機溶劑為選自醇類、羧酸酯類、酮類、烷烴類中的一種或多種；優(yōu)選地，所述溶劑為選自甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、丙酮、環(huán)已烷、正己烷、石油醚中的一種或多種；優(yōu)選地，所述有機溶劑選自醇類，更優(yōu)選所述有機溶劑選自甲醇、乙醇中一種或兩種。對于脫脂處理中有機溶劑的量沒有限制，只要能達(dá)到脫脂目的即可。優(yōu)選地，海藻重量(g)：脫脂溶劑體積(mL)為1:5－15，更優(yōu)選為1:5－12，進(jìn)一步優(yōu)選為1:8－10，進(jìn)一步優(yōu)選為1:8。

優(yōu)選地，在以上組合物中，其中海藻為選自羊棲菜(Hizikia fusiforme(Harv.)Okamura)、海蒿子(Sargassum confusum C.Ag.)、海帶(Laminaria japonica Aresch.)、昆布(Ecklonia kurome Okam.)、銅藻(Sargassum horneri(Turn.)C.Ag.)、萱藻(Scytosiphon lomentarius(Lyngb.)J.Ag.)、匍枝馬尾藻(Sargassum polycystum C.Ag.)、裂葉馬尾藻(Sargassum siliquastrum(Turn.)Ag.)、瓦氏馬尾藻(Sargassum vachellianum Grev.)、鋸齒馬尾藻(Sargassum serratifolium(C.Agardh)C.Agardh)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii(Mert.Ex Roth)O.Kuetz.)、海黍子(Sargassum muticum(Yendo)Fensholt)、梨形巨藻(Macrocystis pyrifera(L.)AG.)、裙帶菜(Undaria pinnatifida(Harv.)Sur)、鹿角菜(Pelvetia siliquosa Tseng et C.F.Chang)、鵝掌菜(Endarachne binghamiae J.Ag.)、網(wǎng)地藻(Dictyota dichotoma(Huds.)Lamx.)、海蘊(Nemacystus decipiens(Sur.)Kuckuck)、鐵釘菜(Ishige okamurai Yendo)、葉狀鐵釘菜(Ishige sinicola(S.et G.)Chihara)中的一種或多種。

優(yōu)選地，以上組合物為片劑、硬膠囊劑、丸劑、顆粒劑、軟膠囊劑、口服液體制劑或注射劑，優(yōu)選為顆粒劑或口服液。

本發(fā)明還提供一種制備上述組合物的方法，包括海藻與牡蠣殼和任選的輔料混合；或者將海藻脫脂后，與牡蠣殼和任選的輔料混合；或者將海藻與牡蠣殼混合后一起用溶劑提取得到活性成分，任選地將所述活性成分與輔料混合，任選地，在提取之前，將海藻進(jìn)行脫脂處理。

優(yōu)選地，在以上制備方法中，所述的脫脂處理是：將海藻用有機溶劑與水組成的混合溶劑進(jìn)行浸泡，然后除去溶劑，優(yōu)選地，室溫浸泡12－36小時，更優(yōu)選浸泡24小時后除去溶劑。優(yōu)選地，所述有機溶劑為選自醇類、羧酸酯類、酮類、烷烴類中的一種或多種；優(yōu)選地，所述溶劑為選自甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、丙酮、環(huán)已烷、正己烷、石油醚中的一種或多種；優(yōu)選地，所述有機溶劑選自醇類，更優(yōu)選所述有機溶劑選自甲醇、乙醇中一種或兩種；對于脫脂處理中有機溶劑的量沒有限制，只要能達(dá)到脫脂目的即可。優(yōu)選地，海藻重量(g)：脫脂溶劑體積(mL)為1:5－15，更優(yōu)選為1:5－12，進(jìn)一步優(yōu)選為1:8－10，進(jìn)一步優(yōu)選為1:8。

優(yōu)選地，所述提取溶劑選自水或者酸水；所述酸水優(yōu)選為pH 2-5(優(yōu)選3-5，進(jìn)一步優(yōu)選3-4，特別優(yōu)選pH3.5)的酸水溶液；其是藥學(xué)上可接受的有機或無機酸的水溶液，優(yōu)選為含選自鹽酸(HCl)、硫酸、硝酸、醋酸、草酸、馬來酸、甲黃酸中至少一種的水溶液，更優(yōu)選為含選自硫酸、鹽酸、醋酸中至少一種的水溶液。優(yōu)選地，海藻或脫脂海藻和牡蠣殼混合物料與溶劑的重量(以g計算)/體積(以mL計算)為1:8-20，優(yōu)選為1:8-15；更優(yōu)選1:10-13，最優(yōu)選1:12。優(yōu)選地，室溫浸泡0.5-2h后，加熱于60-100℃下提取2-4次，每次提取時間為1-4h，合并提取液，離心分出上清液，所得溶液減壓濃縮，得提取物。

優(yōu)選地，上述制備方法包括：海藻(或脫脂海藻)和牡蠣殼進(jìn)行粉碎、混勻，按料液重量體積比1g∶8-20mL加入水，于室溫浸泡0.5-2h，然后加熱于60-100℃提取，重復(fù)提取步驟2-4次，每次提取時間為1-4h，合并提取液，離心分出上清液，濃縮上清液，得提取物。

上述片劑、硬膠囊劑、丸劑、顆粒劑、軟膠囊劑、口服液體制劑或注射劑可以通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法制成。例如，顆粒劑可通過向活性成分中加入適當(dāng)?shù)妮o料(如二氧化硅、糊精、淀粉、磷酸鹽、碳酸鹽、甘露醇、山梨酸或鉀鹽、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖酐、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇等稀釋輔料中的一種或多種)，干燥，粉碎，再加入合適的粘合劑(固體粘合劑如PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、微晶纖維素等或液體粘合劑如乙醇、明膠漿、淀粉漿、糖漿等中的一種或多種)，然后制粒，整粒而制成。

本發(fā)明還提供上述組合物在制備用于提高免疫能力的藥物中的用途，或者作為保健品或食品的用途。優(yōu)選所述藥物為用于抗腫瘤輔助治療的藥物。

本發(fā)明的組合物在體外具有很好的促進(jìn)脾細(xì)胞增殖的作用。Lewis肺癌小鼠體內(nèi)移值瘤實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物能夠顯著增加荷瘤小鼠體重和胸腺指數(shù)，從細(xì)胞水平和動物水平說明了該組合物可以提高免疫力，并發(fā)揮抗腫瘤作用。本發(fā)明令人意外地發(fā)現(xiàn)，由海藻和牡蠣殼的聯(lián)合用藥組成的組合物在提高免疫的效果上有協(xié)同增效作用。

具體實施方式

實施例1

稱取海蒿子粗粉100g，牡蠣殼粗粉100g，混合后，按料液重量體積比1g∶12mL加入水，室溫浸泡0.5h，水煎煮提取2.5h；提取液趁熱8層紗布過濾，濾液5000rpm離心20分鐘；重復(fù)提取步驟，共3次。合并上清液，減壓濃縮干燥后，得組合物1。

采用HPLC-PMP衍生法對組合物1中的褐藻糖膠含量進(jìn)行測定。具體為：稱取組合物適量，加水溶解定容，配置成10mg/mL的溶液，精密量取100μL，加入2M三氟乙酸溶液100μL，混勻，N₂保護(hù)下封管，100℃下降解5h，冷卻，加入200μL甲醇，35℃下氮氣吹干，反復(fù)加入甲醇共4次，除去三氟乙酸，加入100μL水轉(zhuǎn)移到Ependorff管，進(jìn)行PMP衍生化反應(yīng)。加入0.3M的HCl 100μL，中和，再加入500μL氯仿萃取，渦旋30s后，離心棄去下層，如此反復(fù)3次，上層水相過0.22μm微孔濾膜，進(jìn)HPLC液相色譜儀分析。測得組合物1的褐藻糖膠含量為2.16％。

實施例2

稱取羊棲菜粗粉100g，按照羊棲菜與70％乙醇的重量體積比1g∶8mL，加入95％乙醇，室溫浸泡24h；過濾，獲得脫脂后的羊棲菜粗粉，干燥。稱取牡蠣殼粗粉20g，與脫脂羊棲菜混合；按料液重量體積比1g∶12mL，加入pH 3.5的鹽酸水溶液，室溫浸泡0.5h后，100℃提取2h；提取液趁熱8層紗布過濾，濾液5000rpm離心20分鐘；重復(fù)提取，共2次。合并上清液，減壓濃縮干燥后，得組合物2。測得組合物2的褐藻糖膠含量為3.84％。

實施例3

稱取羊棲菜粗粉100g，按照羊棲菜與溶劑(CH₃OH∶CH₂Cl₂∶H₂O＝4∶2∶1)的重量體積比1g∶8mL，加入溶劑，室溫浸泡24h；過濾，獲得脫脂后的羊棲菜粗粉，干燥。稱取牡蠣殼粗粉50g，與脫脂羊棲菜混合；按料液重量體積比1g∶12mL加入水，室溫浸泡0.5h后，100℃提取2.5h；提取液趁熱8層紗布過濾，濾液5000rpm離心20分鐘；重復(fù)提取步驟，共3次。合并上清液，減壓濃縮干燥后，得組合物3。測得組合物3的褐藻糖膠含量為3.62％。

實施例4

稱取海帶粗粉100g，牡蠣殼粗粉10g，混合后，按料液重量體積比1g∶12mL，加入pH 2.5的鹽酸水，室溫浸泡0.5h后，80℃提取2h；提取液趁熱8層紗布過濾，濾液5000rpm離心20分鐘；重復(fù)提取步驟，共2次。合并上清液，減壓濃縮干燥后，得組合物4。測得組合物4的褐藻糖膠含量為1.89％。

實施例5

取實施例1制得的組合物，加入適量的糊精和乳糖作為填充劑，適量的乙醇作為潤濕劑，制備軟材；將所制軟材過10-14目篩，制得濕顆粒；濕顆粒于60℃下烘干得干顆粒；干顆粒經(jīng)10-14目篩整粒，即得組合物制劑。

實施例6

取實施例2制得的組合物，加入適量的糊精和乳糖作為填充劑，適量的乙醇作為潤濕劑，制備軟材；將所制軟材過10-14目篩，制得濕顆粒；濕顆粒于60℃下烘干得干顆粒；干顆粒經(jīng)10-14目篩整粒，即得組合物制劑。

實施例7

按實施例2法脫脂提取，提取液離心、濃縮至一定相對密度，加入適量的甜菊苷作為矯味劑，過濾，滅菌，灌裝，即得組合物口服液制劑。

對比實施例1

海蒿子提取物1的制備：稱取海蒿子粗粉100g，按料液重量體積比1g∶12mL加入水，室溫浸泡0.5h，水煎煮提取2.5h；提取液趁熱8層紗布過濾，濾液5000rpm離心20分鐘；重復(fù)提取步驟，共3次。合并上清液，減壓濃縮干燥后，得海蒿子提取物1。

對比實施例2

羊棲菜提取物1的制備：稱取羊棲菜粗粉100g，按料液重量體積比1g∶12mL加入水，室溫浸泡0.5h，水煎煮提取2.5h；提取液趁熱8層紗布過濾，濾液5000rpm離心20分鐘；重復(fù)提取步驟，共3次。合并上清液，減壓濃縮干燥后，得羊棲菜提取物1。

對比實施例3

羊棲菜提取物2的制備：稱取羊棲菜粗粉100g，按照羊棲菜與70％乙醇的重量體積比1g∶8mL，加入95％乙醇，室溫浸泡24h；過濾，獲得脫脂后的羊棲菜粗粉，干燥。按料液重量體積比1g∶12mL，加入pH 3.5的鹽酸水溶液，室溫浸泡0.5h后，100℃提取2h；提取液趁熱8層紗布過濾，濾液5000rpm離心20分鐘；重復(fù)提取步驟，共2次。合并上清液，減壓濃縮干燥后，得羊棲菜提取物2。

對比實施例4

牡蠣殼提取物1的制備：稱取牡蠣殼粗粉100g，按料液重量體積比1g∶12mL加入水，浸泡0.5h，水煎煮提取2.5h；提取液趁熱8層紗布過濾，濾液5000rpm離心20分鐘；重復(fù)提取步驟，共3次。合并上清液，減壓濃縮干燥后，得牡蠣殼提取物1。

測試?yán)?

小鼠脾細(xì)胞增殖實驗

雄性Balb/C小鼠(體質(zhì)量18～22g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后進(jìn)行實驗。無菌制備小鼠脾細(xì)胞懸液，配成1.5×10⁶個細(xì)胞·mL^-1，取130μL細(xì)胞懸浮液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，然后加入20μL濃度為150μg/mL的樣品溶液和50μL培養(yǎng)液?？瞻捉M加等體積的培養(yǎng)液。每樣3個平行孔。于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μL MTT溶液(5mg·mL^-1)，再繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出培養(yǎng)板，離心棄上清，每孔加入150μL DMSO，于振蕩器上充分振蕩30s。靜止20min，在570nm波長下用全自動酶標(biāo)儀測定吸光度值。脾細(xì)胞增殖率％＝[(A_樣品-A_空白)/A_空白]×100％。

無菌制備Balb/C小鼠脾細(xì)胞懸液，配成1.5×10⁶個細(xì)胞·mL^-1，取130μL細(xì)胞懸浮液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，然后加入20μL濃度為150μg/mL的樣品溶液和50μL培養(yǎng)液，然后分別加入終濃度為1μg·mL^-1的刀豆蛋白A(ConA)，或終濃度為5μg·mL^-1的脂多糖(LPS)。空白組加等體積的培養(yǎng)液。后繼操作同上，在560nm波長下用全自動酶標(biāo)儀測定吸光度值。脾細(xì)胞增殖率％＝[(A_{LPS/ConA+樣品}-A_LPS/ConA)/A_LPS/ConA]×100％。

所測定藥物分別為：海蒿子提取物1、羊棲菜提取物1、羊棲菜提取物2、牡蠣殼提取物1、組合物1、組合物2、組合物3和組合物4的150μg·mL^-1水溶液。結(jié)果列于表1。

從表1可見，組合物1-4能明顯提高體外小鼠脾細(xì)胞增殖能力，提示具有顯著的免疫增強作用。

表1對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(mean±SD,n＝3)

測試?yán)?

取腫瘤生長旺盛的Lewis肺癌荷瘤C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死。無菌條件下剝離腫瘤，用無菌生理鹽水制成細(xì)胞懸液，接種于C57BL/6雄性小鼠右上肢腋窩皮下。接種腫瘤細(xì)胞數(shù)為2×10⁶cell/只。接種后第9天分組給藥。實驗共設(shè)4組：模型組、陽性藥對照組、羊棲菜提取物2、組合物2。陽性藥順鉑2mg/kg腹腔注射，每2天給藥一次。羊棲菜提取物2組及組合物2組按500mg/kg體重灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14天。停藥后24小時處死動物，剝離脾臟、胸腺，稱量，計算脾指數(shù)，胸腺指數(shù)。結(jié)果列于表2。

從表2可見，陽性藥顯著降低荷瘤小鼠的脾指數(shù)(P<0.001)和胸腺指數(shù)(P<0.05)，反映陽性藥對荷瘤小鼠的免疫器官有較大的副作用。相比之下，羊棲菜提取物2、組合物2組均有升高荷瘤小鼠脾指數(shù)的趨勢；組合物2組與模型組相比，能顯著升高小鼠胸腺指數(shù)(P<0.05)，說明組合物2對荷Lewis瘤小鼠具有免疫增強作用。

表2對荷Lewis瘤小鼠免疫力的作用(means±SD，n＝10)

注：與模型組相比：^*P<0.05，^**P<0.0，1^***P<0.001。