本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復(fù)合制劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥對于人類的威脅與日俱增，且癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是傳統(tǒng)治療手段仍需面對的問題，因此，尋找更新、更加全面的治療手段是十分必要的。傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放射療法和化學(xué)療法存在可能損傷機(jī)體正常組織及其他副作用的缺點(diǎn)，從而限制了其對癌癥的治療效果。近年來，以利用近紅外光熱轉(zhuǎn)換的光熱治療（photothermal therapy, PTT）迅速發(fā)展為繼傳統(tǒng)化療、放療、手術(shù)治療之后又一新型腫瘤治療技術(shù)。光熱治療的基本原理是利用在腫瘤部位聚集的光熱材料，通過激光照射，光熱轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的高熱量，可使腫瘤局部溫度升高（42℃以上），從而造成腫瘤細(xì)胞損傷，甚至熱消融消除腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療癌癥的目的。由于，光熱治療是基于將光熱材料靶向傳輸?shù)侥[瘤部位，然后選擇性對腫瘤部位進(jìn)行激光照射，從而極大地降低了對機(jī)體其他正常組織毒副作用使得全身系統(tǒng)毒性極大降低，因此，光熱治療是一種極具發(fā)展情景的腫瘤治療技術(shù)。其中，光熱材料能否成功靶向腫瘤部位且在腫瘤部位細(xì)胞位點(diǎn)上有較強(qiáng)近紅外光吸收，并能高效率的實(shí)現(xiàn)光熱轉(zhuǎn)換是成功實(shí)施PTT的關(guān)鍵。

目前，被廣泛研究的光熱材料主要包括無機(jī)材料和有機(jī)材料。其中，包括主要集中于以金、銀、鈀等為基礎(chǔ)的新型金屬納米粒、以銅為基礎(chǔ)的半導(dǎo)體納米粒材料以及以碳為基礎(chǔ)的石墨烯、碳管的無機(jī)材料運(yùn)用于光熱治療時(shí)存在很多不可忽略的問題，如金屬納米離子的生物代謝差、在機(jī)體內(nèi)不易消除而可能還存在長期毒性以及碳納米材料的生物毒性等。而與其相比，含有發(fā)色團(tuán)并且在經(jīng)紅外區(qū)域有較強(qiáng)的光吸收的有機(jī)光熱分子因其良好的生物相容性、光學(xué)穩(wěn)定性、較高的光熱轉(zhuǎn)換效率等優(yōu)勢而備受研究者關(guān)注。但是，單純的有機(jī)小分子應(yīng)用于光熱治療仍然存在著一些不可避免的問題，比如化學(xué)穩(wěn)定性差、易發(fā)生光漂白以及在體內(nèi)靶向性差，不能在腫瘤部位較長時(shí)間滯留，通過靜脈給藥后藥物很快被代謝清除，不能達(dá)到有效的PTT濃度。因此，研究發(fā)現(xiàn)將有機(jī)光熱小分子與其他高分子通過聚集體的形式形成膠束或者泡囊時(shí)，可以有效地提高有機(jī)小分子的穩(wěn)定性，以及對腫瘤部位的靶向性。

屬于碳菁類染料一類的吲哚菁綠（ICG）是由美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)可以用于臨床近紅外成像的有機(jī)光熱分子，但由于ICG水溶性差，且穩(wěn)定性較差，亦會在血中與蛋白結(jié)合而降低進(jìn)入癌細(xì)胞的量，從而限制了ICG在光熱治療中的應(yīng)用。針對ICG的這些缺陷，有研究者設(shè)計(jì)了一種采用非共價(jià)鍵形成的磷脂聚乙二醇-吲哚菁綠的膠束，可延長吲哚菁綠在腫瘤局部滯留時(shí)間，使吲哚菁綠在腫瘤內(nèi)的富集量明顯提高，從而使光熱效果更加顯著（X Zheng，D Xing，F(xiàn) Zhou et al.Mol.Pharm,2011,8:447~456）。此外，有報(bào)道一種由卟啉-磷脂雙分子層自組裝形成的納米顆粒（Porphysome），這種納米顆粒具有廣泛可調(diào)性吸光系數(shù)、結(jié)構(gòu)依賴性的熒光自淬滅特性和獨(dú)特的光熱及光聲特性。研究人員利用該納米粒實(shí)現(xiàn)了對淋巴系統(tǒng)的感光成像，并生成了低背景的熒光圖像。通過靜脈給藥的方式在小鼠體內(nèi)該納米顆粒具有極好的酶生物降解性，急性毒性極低，有好的生物安全性。進(jìn)一步的動物試驗(yàn)也表明這種納米顆粒具有良好的腫瘤靶向性，在激光照射誘導(dǎo)下，可使小鼠的腫瘤因產(chǎn)生光熱效應(yīng)而被清除。

Cypate分子中擁有兩個(gè)羧基，可以同時(shí)連接多肽兩端形成對酶穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此，可有效避免光熱試劑在到達(dá)靶位之前脫落，提高了穩(wěn)定性，而且Cypate在近紅外區(qū)能產(chǎn)生熒光并具有光熱效應(yīng)，故在研究中受到重視。但Cypate的疏水性強(qiáng)，靶向性差，在腫瘤部位滯留時(shí)間短，易在體內(nèi)清除。因此，開發(fā)生物相容性好、靶向性好、光熱轉(zhuǎn)換效率高的包載光熱試劑Cypate脂質(zhì)體在腫瘤光熱治療上更具應(yīng)用價(jià)值。

此外，免疫治療是近年來備受關(guān)注的另一種新型治療手段。與其他治療手段不同，免疫治療的原理是通過激發(fā)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的免疫識別功能來從根本上清除腫瘤細(xì)胞。盡管許多研究表明機(jī)體中的細(xì)胞免疫和體液免疫均對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但由于免疫治療發(fā)揮作用周期長，需要花時(shí)間等待才能啟動對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，故抑制惡性腫瘤生長和發(fā)展的效果不理想。因此，免疫治療需要聯(lián)合其他治療手段來達(dá)到抗腫瘤的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復(fù)合制劑的制備、表征以及聯(lián)合應(yīng)用。該復(fù)合制劑能利用光熱效應(yīng)治療實(shí)體瘤，并通過啟動自身免疫，進(jìn)一步清除殘余的腫瘤細(xì)胞，提高抗腫瘤效果，達(dá)到預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的效果。

本發(fā)明主要是一方面通過包載光熱材料的脂質(zhì)體，通過EPR效應(yīng)，以被動靶向作用傳輸?shù)侥[瘤部位，在近紅外光的照射下產(chǎn)生的光熱效應(yīng)，對腫瘤產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性損傷，另一方面利用免疫原阿霉素-牛血清白蛋白（ADM-BSA）非特異地激活機(jī)體的免疫功能，產(chǎn)生抗ADM多克隆抗體，再應(yīng)用分子橋透明質(zhì)酸-阿霉素（HA-ADM），由于HA可特異性地于腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，可形成“腫瘤細(xì)胞—HA-ADM—抗ADM多克隆抗體”復(fù)合物，從而增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的免疫識別能力，同時(shí)未結(jié)合的HA-ADM還可以發(fā)揮主動靶向化療作用，從而達(dá)到更好的抗腫瘤效果。故本發(fā)明基于EPR效應(yīng)、配體-受體、抗原-抗體特異性靶向作用，具有被動靶向、主動靶向和免疫治療的三重靶向治療作用的特點(diǎn)，腫瘤復(fù)發(fā)抑制率從低濃度的20%，提高至高濃度的60%，能夠更為高效地治療癌癥。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復(fù)合制劑，由Cypate脂質(zhì)體、ADM-BSA以及HA-ADM組成；Cypate脂質(zhì)體是一種具有良好近紅外光熱效應(yīng)和光熱治療效果的包載光熱試劑的脂質(zhì)體，利用脂質(zhì)成分形成穩(wěn)定的類似細(xì)胞膜的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，包載疏水性有機(jī)光熱材料Cypate于脂質(zhì)雙分子層中，其粒徑為80～200nm，優(yōu)選100～120nm，包封率高且化學(xué)穩(wěn)定性好，具有良好的光熱效應(yīng)。脂質(zhì)體可以為磷脂、膽固醇自組裝產(chǎn)物形成的給藥系統(tǒng)，與Cypate協(xié)同性好，能有效提高被包裹藥物的穩(wěn)定性及其靶向性，改善藥物的溶解度或延長血液循環(huán)時(shí)間，通過EPR效應(yīng)，發(fā)揮被動靶向作用，增加藥物在腫瘤部位的蓄積，降低對正常組織毒副作用。

上述技術(shù)方案中，所述ADM-BSA的結(jié)構(gòu)式為：

所述HA-ADM的結(jié)構(gòu)式為：

。

上述靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復(fù)合制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1) 將磷脂、膽固醇和Cypate置于反應(yīng)器中，加入有機(jī)溶劑，密閉攪拌，得到混合物；水浴下，混合物在攪拌后，超聲處理；然后在攪拌條件下加入純化水，繼續(xù)水浴攪拌3～8 min后，超聲處理；再繼續(xù)攪拌10～20min；然后去除有機(jī)溶劑，即得Cypate脂質(zhì)體；

(2) 將PBS溶液加入BSA中，得到BSA溶液；將ADM.HCl溶解于PBS和DMF混合溶液中，得到ADM溶液；混合BSA溶液與ADM溶液，然后以3～5滴/min的滴速滴加戊二醛溶液，室溫下避光反應(yīng)；反應(yīng)完成后于4℃下離心處理，取上清，于4℃下，透析；透析完成后，取出透析袋內(nèi)液，凍干即為ADM-BSA；

(3)將HA加入純水中，然后加入EDC與NHS，攪拌下，室溫避光反應(yīng)7.5～8.5小時(shí)，然后離心處理得到上清；將ADM^.HCl溶解于純化水得到ADM溶液；然后將ADM溶液滴加入上清中，攪拌下，避光反應(yīng)10～14小時(shí)，然后離心處理，取上清進(jìn)行純水透析；透析完成后，取出透析袋內(nèi)液，凍干即為HA-ADM；

所述靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復(fù)合制劑由Cypate脂質(zhì)體、ADM-BSA以及HA-ADM組成。

上述技術(shù)方案中，將磷脂、膽固醇和Cypate置于反應(yīng)器中，加入無水乙醇和乙酸乙酯，密閉攪拌，得到混合物；水浴加熱，混合物在攪拌溶解后超聲處理；然后在攪拌條件下，開蓋加入純化水，迅速密閉，繼續(xù)水浴攪拌3～8 min乳化后，超聲處理；再繼續(xù)攪拌10～20min至徹底乳化；然后開蓋，水浴繼續(xù)攪拌去除有機(jī)溶劑，即得Cypate脂質(zhì)體；所述Cypate脂質(zhì)體為顆粒物，粒徑為80～200nm，優(yōu)選100～120 nm；所述Cypate脂質(zhì)體中，Cypate位于脂質(zhì)體雙分子層中。

上述技術(shù)方案中，將脂質(zhì)成分及Cypate按質(zhì)量比25:2加入有機(jī)溶劑中。密閉攪拌，待全部溶解后，水浴攪拌下，加入純化水，仍密閉攪拌，超聲乳化后，開蓋繼續(xù)攪拌揮發(fā)有機(jī)溶劑至直至揮發(fā)完全。磷脂可以是大豆磷脂，也可以是其他脂質(zhì)比如卵磷脂。Cypate能高效的被包裹在脂質(zhì)體雙分子中，且脂質(zhì)成分在水相中維持在一定的濃度，使得形成的脂質(zhì)體較為穩(wěn)定。

本發(fā)明公開的Cypate脂質(zhì)體的制備方法中，加入的有機(jī)溶劑可以是無水乙醇和乙酸乙酯，也可以是其他單一有機(jī)溶劑或混合溶劑，選擇溶劑為能溶解脂質(zhì)和Cypate且揮發(fā)性較好的有機(jī)試劑。

優(yōu)選的，處方和工藝制備去除有機(jī)溶劑，然后進(jìn)行超濾處理即得光熱試劑Cypate脂質(zhì)體；超濾處理時(shí)截留分子量為100 kD，轉(zhuǎn)速為4000~6000，反復(fù)超濾3次以上，對上述Cypate脂質(zhì)體進(jìn)行濃縮。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中，磷脂、膽固醇的質(zhì)量和與疏水性有機(jī)光熱材料的質(zhì)量比為25∶2；有機(jī)溶劑為無水乙醇和乙酸乙酯混合液等；所述混合物中，磷脂的濃度為2mg/mL，膽固醇的濃度為0.5mg/mL，采用揮發(fā)的方式或純化水透析的方式去除有機(jī)溶劑，水浴的溫度為45℃～50℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1250 r·min^-1；步驟（2）中，PBS和DMF混合溶液中，PBS與DMF等體積；所述戊二醛溶液中戊二醛的質(zhì)量濃度為22～28%；所述BSA、ADM^.HCl、戊二醛的質(zhì)量比為1∶（50～90）∶（6～8）；透析至紫外檢測至透析外液在480 nm處吸收峰消失即完成透析；步驟（3）中，HA、EDC、NHS的摩爾比為1∶20∶20；攪拌速率為120 r·min^-1；離心處理工藝為8000 r·min^-1離心10 min，純水透析至接收液在480nm處無紫外吸收后即完成透析。

優(yōu)選的，步驟(1)中，磷脂、膽固醇和疏水性有機(jī)光熱材料的質(zhì)量比為4∶1∶0.4；無水乙醇和乙酸乙酯混合液中，無水乙醇和乙酸乙酯的體積比為3∶1；磷脂、膽固醇和疏水性有機(jī)光熱材料的質(zhì)量和與純化水的質(zhì)量比為3∶100；于37℃下，在750 r·min^-1的攪拌速度下采用揮發(fā)的方式去除有機(jī)溶劑；超聲處理時(shí)間為1分鐘；步驟(2)中，所述戊二醛溶液中戊二醛的質(zhì)量濃度為25%；以4滴/min的滴速滴加戊二醛溶液；室溫下避光反應(yīng)時(shí)間為6小時(shí)；4℃下離心處理時(shí)的轉(zhuǎn)速為3000 r·min^-1，時(shí)間為10 min；步驟(3)中，將HA加入純水中，然后加入EDC與NHS，攪拌下，室溫避光反應(yīng)8小時(shí)，然后離心處理得到上清；純水透析時(shí)，24小時(shí)換一次接收液。

上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，戊二醛的稀釋度和滴加速度和攪拌速率尤為重要，稀釋度過小、滴加過快以及攪拌過快均會導(dǎo)致大量沉淀產(chǎn)生；步驟(3)中HA的活化時(shí)間和反應(yīng)溫度對HA-ADM產(chǎn)率影響較大，在本發(fā)明公開的活化時(shí)間以及反應(yīng)溫度下，HA-ADM產(chǎn)率最高，重復(fù)單元根據(jù)透明質(zhì)酸而定。

上述技術(shù)方案中，制備光熱試劑時(shí)，乳化時(shí)水浴溫度為45℃～50℃，揮發(fā)有機(jī)溶劑時(shí)水浴溫度為37℃；乳化時(shí)，攪拌速度為1250 r·min^-1，揮發(fā)去除溶劑時(shí)的攪拌速度為750 r·min^-1。制備工藝較為簡單且可控，將脂質(zhì)成分與藥物Cypate溶解于少量有機(jī)溶劑中，然后按3:100比例加入水相，通過攪拌（轉(zhuǎn)速為1250 r·min^-1），超聲的方式進(jìn)行乳化，使得制得脂質(zhì)體的批間差異小，重復(fù)性好；乳化時(shí)水浴溫度可增加脂質(zhì)在有機(jī)相中的溶解度，但溫度過高則可能引起脂質(zhì)氧化和光熱試劑Cypate變性；反應(yīng)溫度以及攪拌速率的不同對于脂質(zhì)體的形成以及包裹的穩(wěn)定性有影響，本發(fā)明方法使Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包裹后化學(xué)穩(wěn)定性良好，在pH 5.0、pH 7.4、細(xì)胞培養(yǎng)基及血清中，Cypate在48 h內(nèi)紫外吸收變化均小于10 %，明顯改善了游離Cypate的化學(xué)穩(wěn)定性。以Cypate為計(jì)，濃度在1.0～25.0 μg·mL^-1范圍內(nèi)，相同濃度下，Cypate脂質(zhì)體在1.5 W/cm²激光照射（785 nm）下，5分鐘內(nèi)升溫效果明顯優(yōu)于游離Cypate，如在2.0 μg·mL^-1時(shí)，Cypate脂質(zhì)體比游離Cypate升溫更好，可增加升溫15℃，光熱轉(zhuǎn)換效率明顯提高；取得了意想不到的技術(shù)效果。

本發(fā)明的Cypate脂質(zhì)體有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性、腫瘤被動靶向性，可對荷瘤小鼠進(jìn)行高效光熱治療，產(chǎn)生顯著的腫瘤細(xì)胞消除效果；本發(fā)明研發(fā)了生物相容性好，化學(xué)穩(wěn)定性良好的納米級微粒給藥系統(tǒng)脂質(zhì)體，將Cypate包載在脂質(zhì)雙分子層中，從而能夠被動靶向腫瘤部位，并在近紅外光激發(fā)下產(chǎn)生顯著光熱效應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長，甚至達(dá)到消除腫瘤細(xì)胞的治療效果。因此本發(fā)明還公開了光熱試劑Cypate脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明公開的包載疏水性有機(jī)光熱材料的脂質(zhì)體均一性好，其粒徑為80～200nm，化學(xué)穩(wěn)定性好，有良好生物相容性，且在體內(nèi)具有良好腫瘤被動靶向性；比如Cypate脂質(zhì)體可采用785nm激光器激發(fā)產(chǎn)生光熱效應(yīng)明顯強(qiáng)于相同濃度下游離組Cypate產(chǎn)生的光熱效應(yīng)，其原因可能是由于疏水性有機(jī)光熱小分子能在脂質(zhì)雙分子層中有序排列，而不同于游離Cypate（水溶性不好）在水溶液中的聚集狀態(tài)；Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后化學(xué)穩(wěn)定性良好，尤其改善了游離Cypate在微酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性，亦即改善了Cypate在腫瘤局部微環(huán)境下的穩(wěn)定性，有利于發(fā)揮PTT作用，達(dá)到抗腫瘤效果；脂質(zhì)體是一種研究較為成熟且安全性高的納米微粒給藥系統(tǒng)，從而使得Cypate脂質(zhì)體具有廣泛運(yùn)用于臨床的潛力；Cypate脂質(zhì)體粒徑<200 nm，具有顯著的EPR效應(yīng)，從而有良好的腫瘤被動靶向性，并能在近紅外光激發(fā)下高效發(fā)揮光熱效應(yīng)治療腫瘤，在靜脈注射（5mg·kg^-1）后24 h進(jìn)行光熱治療（785 nm, 1.5W·cm^-2, 3 min），產(chǎn)生的光熱效應(yīng)可完全熱消融腫瘤細(xì)胞，且無復(fù)發(fā)現(xiàn)象。

本發(fā)明的多靶向抗腫瘤復(fù)合制劑基于EPR效應(yīng)、配體-受體、抗原-抗體特異性靶向作用，具有被動靶向、主動靶向和免疫治療的三重靶向治療作用特點(diǎn)，能夠更為高效地治療癌癥。其中制備Cypate脂質(zhì)體具有良好的抗腫瘤優(yōu)勢；并且，阿霉素作為半抗原，用牛血清白蛋白你 阿霉素-牛血清白蛋白具有免疫原性，可促使癌癥機(jī)體產(chǎn)生抗阿霉素多抗；透明質(zhì)酸-阿霉素同時(shí)具有以下兩方面的作用：A.免疫治療的連接橋作用，特異性地作用于癌細(xì)胞表面的CD44受體，在癌細(xì)胞表面形成“CD44受體—透明質(zhì)酸-阿霉素—抗阿霉素抗體”復(fù)合物；B.主動靶向化療作用，未形成復(fù)合物的HA-ADM，可利用CD44受體受體介導(dǎo)，使抗癌藥阿霉素進(jìn)入癌細(xì)胞，并發(fā)揮抗癌作用。Cypate脂質(zhì)體介入并光照，以光熱效應(yīng)明顯遏制小鼠腫瘤的生長，為抗體的產(chǎn)生及分子橋的作用發(fā)揮爭取時(shí)間；此外光熱治療也能夠協(xié)同增強(qiáng)機(jī)體的非特異免疫能力，可提高免疫治療的效果。

本發(fā)明首先利用光熱治療高效地抑制實(shí)體瘤生長，進(jìn)一步利用小分子免疫原非特異地激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，并介入基于配體-受體、抗原-抗體的相互作用的分子橋，將免疫細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到光熱治療協(xié)同聯(lián)合免疫治療有效抗腫瘤的目的。首次公開的Cypate脂質(zhì)體、ADM-BSA和HA-ADM組成的被動靶向光熱治療、主動靶向化療和免疫治療的三效合一的抗癌制劑，實(shí)現(xiàn)了在免疫治療發(fā)揮作用的前期引入光熱治療，不僅遏制了腫瘤的增長、改善了小鼠生存狀態(tài)，而且保證了免疫治療及分子橋的主動靶向化療發(fā)揮作用所需的時(shí)間，并協(xié)同增強(qiáng)了免疫治療效果，發(fā)揮顯著的治療作用；取得意想不到的技術(shù)效果。

由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明公開的免疫治療制劑中的小分子化療藥物阿霉素ADM偶聯(lián)大分子牛血清蛋白BSA為免疫原(ADM-BSA)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗ADM抗體；同時(shí)將透明質(zhì)酸HA通過EDC、NHS將羧基活化后與阿霉素ADM相連合成的分子橋HA-ADM，將機(jī)體的免疫效應(yīng)靶向腫瘤細(xì)胞，得到一種可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性的廉價(jià)復(fù)合物大分子，達(dá)到長期自身清除腫瘤細(xì)胞的目的。

（2）與游離光熱分子Cypate相比，本發(fā)明設(shè)計(jì)的Cypate脂質(zhì)體，其顯著的優(yōu)勢在于化學(xué)穩(wěn)定性高、生物相容性良好、光熱轉(zhuǎn)換效率高、體內(nèi)腫瘤靶向性優(yōu)異，由于疏水性有機(jī)光熱小分子能在脂質(zhì)雙分子層中有序排列，用激光器在785nm波長激發(fā)下產(chǎn)生的光熱效應(yīng)明顯強(qiáng)于同濃度游離組Cypate產(chǎn)生的光熱效應(yīng)，為高效的腫瘤光熱治療的成功實(shí)施奠定了基礎(chǔ)。

（3）Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后化學(xué)穩(wěn)定性良好，尤其改善了游離Cypate在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性，從而能進(jìn)一步改善Cypate在腫瘤局部微環(huán)境下的穩(wěn)定性，發(fā)揮PTT效果，得到的Cypate脂質(zhì)體是一種安全性高的納米微粒給藥系統(tǒng)；Cypate脂質(zhì)體粒徑<200 nm，具有顯著的EPR效應(yīng)，從而有良好的腫瘤被動靶向性，并能在近紅外光激發(fā)下高效發(fā)揮腫瘤光熱治療效果，在靜脈注射（5mg·kg^-1）后24 h進(jìn)行光熱治療（785 nm, 1.5W·cm^-2, 3 min），產(chǎn)生的光熱效應(yīng)可完全熱消融腫瘤細(xì)胞，且在考察的21天內(nèi)無復(fù)發(fā)現(xiàn)象；從而使得Cypate脂質(zhì)體具有廣泛運(yùn)用于臨床的潛力。

（4）本發(fā)明中，以小分子化療藥物阿霉素ADM偶聯(lián)大分子牛血清蛋白BSA得到的免疫原(ADM-BSA)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗ADM抗體；將透明質(zhì)酸HA通過EDC、NHS將羧基活化后與阿霉素ADM相連合成的分子橋HA-ADM，將機(jī)體的免疫效應(yīng)靶向腫瘤細(xì)胞，得到一種可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性的廉價(jià)復(fù)合物大分子，達(dá)到長期清除腫瘤細(xì)胞的目的；特別是Cypate脂質(zhì)體結(jié)合HA-ADM+ADM-BSA組成復(fù)合制劑，對于深部殘余以及轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞治療效果好，整合了光熱治療和免疫治療的優(yōu)勢，避免它們各自治療上的缺陷，同時(shí)，光熱治療也可非特異地激活機(jī)體的免疫功能，達(dá)到協(xié)同治療的目的；取得了意想不到的技術(shù)效果。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體透射電鏡圖；

圖2為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體化學(xué)穩(wěn)定性圖，A、游離Cypate，B、Cypate脂質(zhì)體；

圖3為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體升溫曲線圖，A、游離Cypate，B、Cypate脂質(zhì)體；

圖4為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)圖，A、非激光照射，B、激光照射；

圖5為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取試驗(yàn)圖；

圖6為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體的細(xì)胞亞定位試驗(yàn)圖，A、非激光照射，B、激光照射；

圖7為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體的近紅外活體成像試驗(yàn)圖，A為小動物成像照片，B為數(shù)據(jù)圖；

圖8為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體的組織分布結(jié)果圖，A為組織成像照片，B為數(shù)據(jù)圖；

圖9為實(shí)施例一中Cypate脂質(zhì)體的抑瘤曲線（A）和腫瘤組織（B）圖；

圖10為實(shí)施例二中免疫原ADM-BSA的紫外吸收圖（A）和紅外圖譜（B）；

圖11為實(shí)施例二中免疫原ADM-BSA在正常小鼠和荷瘤小鼠ELISA結(jié)果圖；

圖12為實(shí)施例三中HA-ADM的核磁鑒定圖；

圖13為實(shí)施例三中HA-ADM以及HA+ADM的DSC鑒定圖；

圖14為實(shí)施例三中連接橋在癌細(xì)胞表面連接抗體的紫外吸光圖；

圖15為實(shí)施例三中細(xì)胞流式結(jié)果圖；

圖16為實(shí)施例三中體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖17為實(shí)施例四中聯(lián)合治療的腫瘤生長曲線（A）和腫瘤組織（B）圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不限于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實(shí)施例從Cypate脂質(zhì)體的制備及表征、Cypate脂質(zhì)體體內(nèi)外藥效學(xué)評價(jià)、ADM-BSA的制備及其在荷瘤鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗阿霉素多克隆抗體、HA-ADM的制備及連接橋作用印證以及產(chǎn)生多抗的荷瘤鼠使用聯(lián)合治療方法治療等方面詳述本發(fā)明技術(shù)方案帶來的意想不到的技術(shù)效果。

實(shí)施例一 Cypate脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)的考察

稱取10g磷脂，2.5g膽固醇及0.5gCypate置于西林瓶中加入3.75mL無水乙醇和1.25mL乙酸乙酯，密閉，50℃水浴1250 r·min^-1攪拌5min并超聲1 min，使其充分溶解。在攪拌條件下快速均勻加入430g純化水，50℃水浴1250 r·min^-1攪拌5min乳化后，超聲1min,再繼續(xù)攪拌15min使其乳化完全，開蓋以37℃水浴750 r·min^-1攪拌5小時(shí)，徹底揮發(fā)有機(jī)溶劑，即得Cypate脂質(zhì)體混懸液。

制得的Cypate脂質(zhì)體均一性較好，形狀為規(guī)整球形，用透射電鏡（TEM）觀察Cypate脂質(zhì)體表觀形態(tài)為球形，且分布均勻，見圖1，用激光粒度儀測得Cypate脂質(zhì)體的平均粒徑為（111.9±5.94）nm（n=3）。取1.0 mLCypate脂質(zhì)體溶液置于超濾管（截留分子量100000）中，4℃5000 r·min^-1離心15 min分離液相后，加入1.0 mL水于超濾管中洗滌，重復(fù)上述操作3次，合并超濾管內(nèi)液，用甲醇破壞脂質(zhì)體并定容，至吸光度為0.3-1.0之間，測定并計(jì)算藥物含量A；另取同體積Cypate脂質(zhì)體溶液，加入甲醇破壞脂質(zhì)體并定容后測定，算得相應(yīng)藥物含量A₀，計(jì)算包封率（%）=（A₀-A）/A₀×100%；結(jié)果泡囊包封率為（98.11 ± 1.13）%（n=3）。

對上述Cypate脂質(zhì)體體外化學(xué)穩(wěn)定性分別進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)分為Cypate脂質(zhì)體和游離Cypate兩組，分別在pH 5.0、pH 7.4、細(xì)胞培養(yǎng)基（medium）及血清（serum）中考察它們的穩(wěn)定性。以Cypate濃度計(jì)算，用以上介質(zhì)分別配制Cypate脂質(zhì)體和游離Cypate的5μg·mL^-1的溶液（n=3），確定在0、2、4、8、24、48 h6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定Cypate的紫外吸收光譜。圖2結(jié)果顯示，游離Cypate僅在血清中具有較好的穩(wěn)定性，在pH 7.4和培養(yǎng)基中穩(wěn)定性較差，在pH5.0環(huán)境下極不穩(wěn)定，48h后紫外吸收下降了60%左右。然而，Cypate脂質(zhì)體的Cypate在pH 5.0、pH 7.4及血清中均能較穩(wěn)定存在，且在pH5.0環(huán)境下48h后紫外吸收的下降＜5%，表明Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后化學(xué)穩(wěn)定性明顯提高，為后期的光熱治療奠定基礎(chǔ)。

對上述Cypate脂質(zhì)體體外升溫效應(yīng)進(jìn)行考察，以Cypate濃度計(jì)算，配制1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg·mL^-1的水溶液，采用785 nm激發(fā)的激光，1.5 W·cm^-2 條件下照射5 min，每隔25s對溶液溫度進(jìn)行記錄。圖3表明，785nm激光照射下純水的幾乎沒有升溫效果，游離Cypate及脂質(zhì)體的光熱效應(yīng)均顯示濃度依賴性，而且相同濃度下，制備的Cypate脂質(zhì)體（Cy-Liposome）比游離Cypate（Free Cypate）表現(xiàn)出更強(qiáng)的升溫效果，當(dāng)濃度為5 μg·mL^-1時(shí)，Cy-Liposome溫度可升高37.6 ℃，而Free Cypate則僅升高15.3 ℃，兩者相差22.3 ℃，表明與Free Cypate相比，Cy-Liposome具有良好的升溫效應(yīng)，其原因可能由于疏水性的Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后可均勻分布在脂質(zhì)雙分子中，減少了Cypate的聚集，從而在激光照射下增強(qiáng)非輻射躍遷，從而能產(chǎn)生更多熱量，說明有利于后期的PTT治療。對上述Cypate脂質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞毒性考察。取對數(shù)生長期4T1細(xì)胞，以5000個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔細(xì)胞板，在37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁后，用完全培養(yǎng)基分別配制不同濃度的Cypate脂質(zhì)體溶液和游離Cypate溶液（以Cypate計(jì)算，濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 μg·mL^-1）每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，更換培養(yǎng)基，非光照組放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，光照組用785nm激光器對每孔進(jìn)行激光照射（1.5 W·cm^-2，3 min）后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg·mL^-1 MTT溶液10 μL和完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去液體，每孔加入100 μL DMSO，避光震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm測定吸光度，計(jì)算得到細(xì)胞生長存活率。結(jié)果，從圖4A中可以看出，Cypate脂質(zhì)體和游離Cypate溶液在非光照條件下，25μg·mL^-1以內(nèi)均沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，而從圖4B中可以看出，在激光照射條件下Cypate脂質(zhì)體組和游離Cypate均對腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制作用，且Cypate脂質(zhì)體的IC₅₀為5.03 μg·mL^-1，而游離Cypate在濃度25.0 μg·mL^-1以內(nèi)未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞致死量＜50%，顯示脂質(zhì)體比游離組擁有更加有效的PTT治療作用，其原因可能是由于脂質(zhì)體用較好的細(xì)胞相容性，使得細(xì)胞對其的攝取量增加，且具有更強(qiáng)的光熱效果。而作為對照的非光照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，提示Cy-Liposome作為光熱治療制劑在后續(xù)光熱治療中將體現(xiàn)對治療部位的針對性和可控性。

對上述Cypate脂質(zhì)體傳輸藥物進(jìn)入細(xì)胞的能力進(jìn)行細(xì)胞攝取試驗(yàn)。取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞鋪6孔板，接種密度為1×10⁵/mL，每孔3 mL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12 h，細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液。以Cypate計(jì)，分別加入10 μgmL^-1用培養(yǎng)基配制好的游離Cypate溶液和Cypate脂質(zhì)體溶液，每孔1 mL，每組3個(gè)復(fù)孔。分別在給藥后培養(yǎng)6 h、24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加入500 μL 胰酶消化液，消化5 min后，再用500 μL培養(yǎng)基終止消化，然后用500 μL的PBS清洗合并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，1200 rmin^-1離心10 min，用1mL PBS重新溶解，吹散均勻后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后將細(xì)胞混懸液用細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎，強(qiáng)度為200 W，1秒/次，間隔1秒，超聲25次粉碎細(xì)胞，往1.0mL細(xì)胞粉碎液中加入3 mL甲醇，紫外分光光光度計(jì)測定吸光度，并通過細(xì)胞個(gè)數(shù)換算10⁶個(gè)細(xì)胞對Cypate的攝取量。結(jié)果，從圖5可知，4T1細(xì)胞對Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后的攝取量明顯高于游離Cypate，且隨著時(shí)間的延長差距加大。在6 h時(shí)，Cypate脂質(zhì)體中的Cypate攝取量是游離組的3.17倍，24 h時(shí)則增加到5.89倍；而游離組Cypate的攝取量隨時(shí)間變化改變不大，從6 h到24 h，攝取量只增加了19 %。因此，可見Cypate脂質(zhì)體的光熱治療效果好，與其具有良好的細(xì)胞相容性，促使包載的Cypate更多地進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)。

考察上述Cypate脂質(zhì)體在激光照射后在細(xì)胞中的定位情況，進(jìn)行亞細(xì)胞定位試驗(yàn)。為取對數(shù)生長期4T1細(xì)胞接種于玻璃底培養(yǎng)皿中，接種密度為2×10⁵個(gè)·mL ^-1，加入1 mL，在37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1）非光照組，加入用完全培養(yǎng)基配制的Cypate脂質(zhì)體溶液，以Cypate計(jì)算30.0 μg·mL^-1，培養(yǎng)2 h后，吸出培養(yǎng)基，并用PBS清洗3遍，在避光條件下染色：加入Lysotracker Green DND 26（100.0 nM）100 μL染溶酶體，在37℃培養(yǎng)箱中染色3 min，然后吸出染液，用PBS清洗3遍后，再加入Hochest 33342（1.0 μM）100 μL染細(xì)胞核，在37℃培養(yǎng)箱中染色15 min后，再用PBS清洗3遍，加入4%多聚甲醛對細(xì)胞固定20 min；2）光照組，在給藥（30.0 μg·mL^-1）培養(yǎng)2h后，吸出培養(yǎng)基并用PBS清洗3遍等操作相同。但在染色前，加入新鮮完全培養(yǎng)基，785 nm,1.5 W/cm²條件下，光照1 min后，放入繼續(xù)培養(yǎng)30 min后照射，其余同非光照組相同步驟進(jìn)行染色并固定細(xì)胞。將光照與非光照組通過激光共聚焦顯微鏡（LSM 710）進(jìn)行拍攝。圖6A顯示，非激光照射組，Cypate標(biāo)記的紅色熒光與溶酶體的綠色熒光發(fā)生重疊而產(chǎn)生了橘黃色熒光，結(jié)果表明Cypate脂質(zhì)體在進(jìn)入細(xì)胞后主要定位于溶酶體中。但經(jīng)過激光照射后，由于產(chǎn)生的PTT作用及PDT作用使得原來定位的溶酶體被破壞，所以由Lysotracker Green DND 26染色的溶酶體熒光強(qiáng)度較弱（圖6B）。

為考察本發(fā)明Cypate脂質(zhì)體在體內(nèi)對腫瘤部位的靶向性，構(gòu)建4T1皮下腫瘤模型裸鼠，進(jìn)行近紅外熒光活體成像試驗(yàn)。將50 μL含有2×10⁶個(gè)4T1細(xì)胞混懸液皮下注射接種于裸鼠的右后肢，待腫瘤體積長至60-100 mm³時(shí) (腫瘤體積公式：腫瘤體積=長×寬²/2)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：以Cypate計(jì)算濃度為5 mg·kg^-1，分別從尾靜脈注射Cypate脂質(zhì)體溶液和游離Cypate。配制4%的水合氯醛溶液，腹腔注射麻醉裸鼠后，用小動物活體成像系統(tǒng)掃描成像，分別記錄給藥后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的小動物成像照片和數(shù)據(jù)。圖7A顯示，對照組游離Cypate組給藥后24 h，Cypate熒光信號主要分布于肝臟部位，信號強(qiáng)、面積大，且代謝快，而腫瘤部位熒光弱；但實(shí)驗(yàn)組Cypate脂質(zhì)體的肝區(qū)藥物分布量的強(qiáng)度和面積均顯著降低，ROI圈出的富集在腫瘤部位的熒光信號強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間顯著提高，在96 h仍有較強(qiáng)滯留，腫瘤部位成像效果明顯，如圖7B，表明Cypate脂質(zhì)體在體內(nèi)具有良好的被動靶向性。

對上述Cypate脂質(zhì)體在體內(nèi)組織分布進(jìn)行考察。

（1）培養(yǎng)4T1腫瘤細(xì)胞，將其消化制備成2×10⁷個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，保證細(xì)胞分散均勻，在小鼠右后肢近腹部上側(cè)種瘤，每只小鼠皮下注射500 μL，待腫瘤體積長至60-100 mm³時(shí)（腫瘤體積公式：腫瘤體積=長×寬²/2）繼續(xù)以下實(shí)驗(yàn)。

（2）以Cypate計(jì)算濃度為7.5mg·kg^-1，分別由尾靜脈注射Cypate脂質(zhì)體溶液和游離Cypate。28 h后，頸椎脫臼處死小白鼠取出心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織，置于小動物成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光成像，記錄成像圖。并通過軟件ROI圈出各組織的Cypate熒光信號強(qiáng)度（n=3）。圖8A是游離Cypate在各組織的近紅外熒光成像圖，可見在腫瘤部位熒光弱，而在肝臟部位熒光較強(qiáng)；而Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后，在腫瘤部位的熒光極大增強(qiáng)，在肝臟組織熒光明顯減弱。圖8B是通過軟件ROI圈出各組織的Cypate熒光信號強(qiáng)度，結(jié)果Cypate脂質(zhì)體的腫瘤部位熒光信號強(qiáng)度是游離Cypate的1.58倍，而在肝臟組織的熒光信號強(qiáng)度下降了77.9%，因此，Cypate脂質(zhì)體具有良好的被動靶向性，且降低了肝臟的蓄積，可降低肝毒性。

對上述Cypate脂質(zhì)體體內(nèi)抑瘤效果進(jìn)行考察。采用上述建立腫瘤模型的方法構(gòu)建小白鼠荷瘤模型，待腫瘤體積至70 mm³時(shí)，設(shè)計(jì)以下6組（每組5只鼠）給藥：PBS組2組、游離Cypate2組、Cypate脂質(zhì)體組2組（以Cypate計(jì)算濃度為5.0 mg·kg^-1），分為一類用激光照射，另一類未照激光，并且，以第0天給藥，第1天用激光照射，光熱治療（785 nm，1.5W/cm²，3分鐘）。分別在第0、1、2、4、5、7、9、11、13、15、17、19、21天測量小鼠的體重和腫瘤體積。以第0天的腫瘤體積作為對照，得到腫瘤的生長曲線圖9，可知，注射PBS組，光照或未光照對腫瘤的生長均無影響，說明單獨(dú)光照不能對腫瘤產(chǎn)生抑制效果。而在相同濃度下，游離Cypate組及Cypate脂質(zhì)體組，未光照均不影響腫瘤生長。游離Cypate組光照對腫瘤的生長有一定抑制，但Cypate脂質(zhì)體組（Cypate濃度大于等于3.0 mg·kg^-1）光照可在腫瘤部位迅速產(chǎn)生熱損傷作用使腫瘤消融，且在觀察的21天時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象，說明脂質(zhì)體的包載，使得Cypate在激光照射條件下能對腫瘤產(chǎn)生很好的PTT效果，其脂質(zhì)體是一種具有良好發(fā)展前景的光熱治療納米給藥系統(tǒng)。

實(shí)施例二 免疫原BSA-ADM的合成和抗體的制備

阿霉素是小分子，只有免疫反應(yīng)性而無免疫原性，不能直接免疫動物產(chǎn)生抗體，需要與異體蛋白（多用牛血清白蛋白，BSA）偶聯(lián)制備免疫原。另外，在酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法中，將抗體結(jié)合在酶標(biāo)板上的包被抗原，常將阿霉素與另一異體蛋白（多用卵清蛋白，OVA）結(jié)合。

通過戊二醛交聯(lián)法制備合成免疫原ADM-BSA和包被原ADM-OVA。制備過程如下：稱取100 mg BSA于25 mL圓底燒瓶中，加入5 mL 0.1 mol^.L^-1 PBS溶液，充分溶解，攪拌速率為10 r^.min^-1，另取40.0 mg ADM^.HCl溶解于3.0 mL DMF和 PBS混合溶液中(DME:PBS=1:1)，將ADM逐滴加入BSA溶液中，待ADM與BSA充分混勻后，逐滴加入稀釋25倍的戊二醛3.68 mL，滴速為3滴/min，室溫下避光反應(yīng)6 h，于4 ℃、3000 r^.min^-1離心10 min取上清，用0.01 mol^.L^-1 PBS溶液 4 ℃連續(xù)透析4天，根據(jù)透析外液透析出來紅色（未結(jié)合的ADM）的顏色情況不時(shí)更換透析液。透析完成后，取出透析袋內(nèi)液體，凍干得橙紅色固體粉末，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

包被原的合成過程與免疫原ADM-BSA的類似，保持蛋白質(zhì)OVA與阿霉素的摩爾比為1:90；阿霉素與戊二醛的摩爾比為1:4，其余實(shí)驗(yàn)條件均不變。

免疫原在凍干過稱中，另取相同體積的透析介質(zhì)，同樣經(jīng)凍干并稱量，將凍干的免疫原的質(zhì)量減去凍干的鹽成分的質(zhì)量，即為所需的免疫原的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，凍干所得產(chǎn)物中鹽含量高達(dá)70%左右。

合成的免疫原主要通過紫外-可見分光光度法和傅里葉轉(zhuǎn)換紅外法表征結(jié)果如圖10。圖10-A為ADM、BSA、ADM+BSA及ADM-BSA水溶液通過紫外-可見光分光光度計(jì)，在200 nm~900 nm進(jìn)行掃描測得相應(yīng)的紫外-可見圖譜。由圖可知， BSA的紫外特征峰在280 nm左右處；ADM則在233 nm、253 nm、290 nm、485 nm處有不同吸收強(qiáng)度的吸收峰，產(chǎn)物ADM-BSA在485 nm左右出現(xiàn)了ADM的特征峰，并且在255 nm左右出現(xiàn)一個(gè)肩峰，推斷是ADM的吸收峰與BSA吸收峰加和的結(jié)果，推斷ADM與BSA交聯(lián)成功，得到了阿霉素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物（ADM-BSA）。而圖10-B為ADM、BSA、ADM+BSA混合物、產(chǎn)物ADM-BSA在500~4000 cm^-1的紅外吸收圖譜； ADM-BSA在1500-1700 cm^-1 左右出現(xiàn)了BSA上的酰胺I帶吸收峰，以及亞胺的吸收峰（1635 cm^-1）。2800-3500 cm^-1左右的強(qiáng)峰歸屬于BSA上游離的-COOH和-NH₂以及ADM上的同類基團(tuán)疊加，推斷目標(biāo)產(chǎn)物合成成功。

分別選取健康Balb/c雌性小鼠（3-5周齡）和荷瘤小鼠（對數(shù)生長期4T1細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基配制成2×10⁵個(gè)細(xì)胞/mL，每只小鼠皮下注射50 μL，構(gòu)建皮下瘤小鼠模型）作為模型動物,考察免疫原ADM-BSA產(chǎn)生多克隆抗體的情況。共免疫3次（首次免疫和第2、3次加強(qiáng)免疫）。首次免疫時(shí)，先稱取1～2mg免疫原ADM-BSA粉末（扣除其中鹽成分），將其溶解在1 mL的生理鹽水中，加入1～1.5 mL福氏完全佐劑，充分混合成W/O型乳濁液，在小鼠上肢腋窩或腹股溝（淋巴結(jié)較豐富區(qū)）進(jìn)行皮下注射0.1 mL/只。在首次免疫2周后，進(jìn)行加強(qiáng)免疫二免，僅需要將福氏完全佐劑替換為福氏不完全佐劑，其余與首次免疫相同。并且分別在二免5～7天后眼眶取血0.1～0.5 mL，于-4 ℃放置過夜，吸取上層清液（抗血清），備用。

通過酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）間接競爭法檢測分別檢測正常小鼠和荷瘤小鼠血清中抗ADM抗體活性，將抗血清用0.1mol/L PBS（pH7.4）稀釋10倍的溶液，得到的抗血清1:500稀釋液，基本實(shí)驗(yàn)流程如下：

（1）以一定比例稀釋包被抗原（ADM-OVA）, 按200 μL/孔加入于96孔酶標(biāo)板中， 4 ℃包被酶標(biāo)板12～24 h；

（2）通過洗板機(jī)用PBST 緩沖液清洗3次；

（3）按 280 μL/孔，加入0.01 mg. mL^-1酪蛋白溶液，室溫放置1 h，封阻酶標(biāo)板上空余處；

（4）同（2）相同操作；

（5）在酶標(biāo)板的每孔中依次分別加入 100 μL 標(biāo)準(zhǔn)阿霉素溶液和 100 μL 一定稀釋度的抗血清，室溫低速振搖 1 h；

（6）同（2）相同操作；

（7）按200 μL/孔加入稀釋的山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶（GaRIgG-HRP）（1:5000），室溫放置1 h；

（8）同（2）相同操作；

（9）按200 μL /孔加入底物溶液（醋酸鈉緩沖液+TMB+H₂O₂），室溫避光條件下在微量振蕩器上振搖約 20~30 min,進(jìn)行顯色；

（10）當(dāng)深藍(lán)色出現(xiàn)，可按80 μL/孔加入5 % H₂SO₄溶液終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)為黃色；

（11）用酶標(biāo)儀測定其490 nm處吸光度。

如圖11，可知，正常小鼠二免血清中當(dāng)抗ADM多克隆抗體稀釋500倍時(shí)，PBS組的吸光度值（0.802）為標(biāo)準(zhǔn)溶液組（0.113）的7.10倍；而荷瘤小鼠二免血清稀釋500倍時(shí)，PBS組的吸光度值（0.763）為標(biāo)準(zhǔn)溶液組（0.311）的2.45倍。結(jié)果表明，合成的免疫原ADM-BSA在正常小鼠和荷瘤小鼠中具有較好的免疫原性，雖然小鼠荷瘤后免疫系統(tǒng)功能較低，但仍然能產(chǎn)生特異性多克隆抗體。

實(shí)施例三 HA-ADM的合成

合成路線如下：

（1）透明質(zhì)酸的活化：稱取42.07 mg 透明質(zhì)酸（HA）于10 mL圓底燒瓶中，加入2.0 mL 純化水，充分溶解后，攪拌速率為120 r·min^-1，另取38.3 mg EDC和22.9mg NHS依次加入，避光條件下反應(yīng)8h，8000 r·min^-1離心10 min后收取上清液，即為活化HA溶液。

（2）HA-ADM的合成：取10.8 mg ADM^.HCl溶解于1.3 mL純化水后，逐滴加入到上述活化HA溶液中，120 r·min^-1，25 ℃避光反應(yīng)12 h。8000 r·min^-1離心10 min取上清，與分子截留量為8000-14000透析袋中，以1000 mL純化水作為接收液，透析，每隔24h更換一次接收液，透析完全后（接收液在480nm處無紫外吸收），透析袋內(nèi)溶液經(jīng)冷凍干燥得紅色粉末，-20 ℃避光保存，即為HA-ADM，備用。

HA-ADM的結(jié)構(gòu)表征

（1）¹H-NMR譜表征：圖12為從分子橋HA-ADM和HA在重水中的核磁圖譜，由圖的¹HNMR可以看出，其HA-ADM特征峰有：δ（ppm）：1.94（s,CH₃ in HA），而3.76~3.26（m，- CH₃ in HA），5.35（s，CH₃ in ADM）。但由于重水的活潑氫交換作用的影響，不能觀察到明顯的酰胺峰。故根據(jù)上述核磁圖譜特征峰可以看出HA-ADM合成成功。

（2）DSC表征：圖13為DSC鑒定圖，上圖為自制HA-ADM測定結(jié)果；下圖為HA與ADM的混合物測定結(jié)果，由圖13可以看出，合成產(chǎn)物HA-ADM在224.7℃出現(xiàn)吸熱峰；而HA和ADM的混合物則無明顯的吸熱峰。由于產(chǎn)物和原料的物理混合物，曲線顯著不同，表明產(chǎn)物是新生成的物質(zhì)，證明分子橋HA-ADM可成功合成。

故，以上兩種方法均證實(shí)HA-ADM合成成功。

HA-ADM連接橋作用考察

考察分子橋HA-ADM，既能與抗ADM抗體結(jié)合，又能與腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)受體結(jié)合，通過形成“CD44-HA-ADM-抗ADM抗體”復(fù)合物，即通過考察：CD44受體-透明質(zhì)酸-阿霉素-抗阿霉素抗體的形成，證實(shí)HA-ADM具有將抗體靶向到腫瘤細(xì)胞的能力。采用細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附分析法來進(jìn)行驗(yàn)證，其原理與細(xì)酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）原理一致，只是用細(xì)胞板中貼壁生長的細(xì)胞代替了在酶標(biāo)板上包被抗原，在操作上略有不同，其基本過程如下：

（1）分別取對數(shù)生長期4T1細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，接種密度為1×10⁵個(gè)·mL^-1，每孔100 μL，在37 ℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁；

（2）每孔加入100 μL PBS，洗滌3次；

（3）分別加入以下樣品溶液各100μL（n=6），細(xì)胞培養(yǎng)箱恒溫孵育1 h。樣品溶液使用完全培養(yǎng)基分別配制：1）抗血清+HA-ADM溶液（即：antiserum+HA-ADM）；2）抗血清+ADM溶液(即：antiserum+ ADM）；3）正常血清+ HA-ADM溶液（即：normal serum+HA-ADM）；4）PBS+HA-ADM溶液（即：PBS+HA-ADM）。以 ADM為計(jì)，濃度均為5.0 μg·mL^-1，抗血清及陰性血清的稀釋倍數(shù)均為200倍；37 ℃條件下恒溫震蕩30 min；

（4）每孔加入100 μL PBST，洗滌3次，然后每孔100 μL加入PBS稀釋的山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶（GaRIgG-HRP，標(biāo)記二抗），37 ℃恒溫孵育1 h；

（5）細(xì)胞板以PBST洗滌，每次100 μL，共3次；每孔加入100 μL底物溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配：20mL純水、1 mL pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液、200 μl 1 %四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、20 μL 5 %過氧化氫），室溫避光條件下，在微量振蕩器上震搖20 min左右，進(jìn)行顯色；

（6）當(dāng)細(xì)胞板上有些孔已顯深藍(lán)色時(shí)，按40 μL/孔加入5% H₂SO₄溶液終止顯色反應(yīng)；

（7）用酶標(biāo)儀測定其490nm處吸光度，結(jié)果見圖14。

由于HA-ADM，一端的HA可與癌細(xì)胞表面高表達(dá)的CD44結(jié)合，另一端的ADM可與小鼠抗血清（抗ADM多抗）結(jié)合，而小鼠抗血清可與標(biāo)記二抗作用，最終使細(xì)胞顯色，故在細(xì)胞ELISA測定結(jié)果圖14中，具體吸光度大小為：抗血清+HA-ADM >抗血清+ADM >正常血清+ HA-ADM > PBS+HA-ADM組，其中，“抗血清+HA-ADM”的吸光度值最高，分別依次為各對照組的1.47、2.58、3.95倍（均為p<0.05）。可見“抗血清+HA-ADM”組的吸光度值大，它使留在細(xì)胞板上的標(biāo)記二抗越多，說明多抗被引導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的效率越高，即證明分子橋HA-ADM使癌細(xì)胞表面形成了“CD44-HA-ADM-抗ADM抗體（CD44受體-透明質(zhì)酸-阿霉素-抗阿霉素抗體）”復(fù)合物，為刺激機(jī)體自身免疫，對癌細(xì)胞發(fā)起免疫殺傷作用的奠定了基礎(chǔ)。

HA-ADM主動靶向抗癌作用考察

（1）4T1細(xì)胞對HA-ADM的攝取情況

取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞，制成10⁶ 個(gè)/mL細(xì)胞的混懸液，每孔3 mL 接種于6孔板，在37 ℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁后，分別加入用完全培養(yǎng)基配制的溶液3 mL：1）HA-ADM溶液；2）ADM溶液，使各組溶液的ADM終濃度均為10 μgmL^-1。分別培養(yǎng)1h、4h后，PBS洗滌3次，加適量胰酶消化后在1 mL 4℃預(yù)凍的PBS溶液中重懸，1 h內(nèi)進(jìn)入流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果見圖15。由流式結(jié)果圖15可知，在1h和4 h，HA-ADM組的攝取量分別為ADM組的2.04倍和2.44倍，說明因HA介導(dǎo)顯著提高了攝取量，即HA-ADM具有主動靶向性。

（2）體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，考察HA-ADM主動靶向抗癌作用

采用MTT法，通過對鼠乳腺癌（4T1）細(xì)胞的細(xì)胞毒性，考察HA-ADM主動靶向抗癌作用。

通過4T1細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)HA-ADM、ADM、HA-ADM+HA及HA的細(xì)胞毒性。取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞，制成5×10³個(gè)/mL細(xì)胞的混懸液，每孔100 μL 接種于96孔板，在37 ℃、5％ CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁后，分別加入用無葉酸的完全培養(yǎng)基配制的溶液：①HA- ADM溶液；②HA-ADM+ADM溶液; ③ADM溶液；④HA溶液。其中各樣品溶液的ADM終濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μgmL^-1，實(shí)驗(yàn)組②中每孔加入4mgmL^-1游離HA。給藥24h后，吸取含藥培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后每孔加入5 mg·mL^-1 MTT溶液10 μL和完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去液體，每孔加入100 μL DMSO，避光震蕩20 min，用酶標(biāo)儀于490 nm測定吸光度，計(jì)算得到細(xì)胞生長存活率。不同藥物濃度作用不同時(shí)間的細(xì)胞存活率。

計(jì)算公式為：“存活率=（A_藥物-A_{調(diào)零孔}/A_對照-A_{調(diào)零孔}）×100%）”。分別以濃度（各組ADM濃度一致）為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，得到不同濃度藥物對癌細(xì)胞作用24h后的生長抑制曲線，并計(jì)算半數(shù)致死量IC₅₀值。結(jié)果見圖16，可知，在24 h，當(dāng)ADM濃度一致時(shí)，HA-ADM 、HA-ADM+HA、ADM對4T1的細(xì)胞生長抑制IC₅₀（μg·mL^-1）依次為：0.14、1.60、1.05，而HA對細(xì)胞幾乎無毒性，表明分子橋?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷作用較ADM（p<0.05）大，即HA-ADM分子橋?qū)δ[瘤細(xì)胞具有主動靶向性。

實(shí)施例四

將4T1細(xì)胞在37℃、5% CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用含10%胎牛血清無葉酸的1640培養(yǎng)基配制成5×10⁵個(gè)細(xì)胞/mL，每只鼠皮下注射50μL（含1×10⁴個(gè)細(xì)胞），構(gòu)建皮下瘤小鼠模型（荷瘤鼠模型）。經(jīng)觀察，4T1荷瘤Balb/c鼠模型動物構(gòu)建成功，用于Cypate脂質(zhì)體靶向光熱治療聯(lián)合ADM-BSA及HA-ADM免疫治療組成的多靶向抗腫瘤復(fù)合制劑的療效考察試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)動物分組為：

實(shí)驗(yàn)組①：免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg^-1)（分子橋促進(jìn)免疫治療+主動靶向化療+1.5 mg·kg-1靶向光熱治療）；

實(shí)驗(yàn)組②：免疫+HA-ADM + PTT(0.5 mg·kg^-1)（分子橋促進(jìn)免疫治療+主動靶向化療+0.5 mg·kg^-1靶向光熱治療）；

免疫治療聯(lián)合分子橋組：免疫+HA-ADM（分子橋促進(jìn)免疫治療+主動靶向化療）；

分子橋功能驗(yàn)證組：免疫+ ADM（體內(nèi)有抗體，普通化療+被動靶向化療）；

單純免疫治療組：免疫+PBS（體內(nèi)有抗體，但無分子橋介入）；

靶向光熱治療聯(lián)合主動靶向化療組：非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg^-1)(體內(nèi)無抗體，分子橋主動靶向化療+1.5 mg·kg^-1靶向光熱治療）；

主動靶向化療組：非免疫+HA-ADM（體內(nèi)無抗體，分子橋主動靶向化療）；

化療藥對照組：非免疫+ ADM（體內(nèi)無抗體，普通化療）；

陰性對照組：非免疫+PBS（體內(nèi)無抗體，不治療）。

具體步驟如下：1）免疫周期：接種腫瘤第1天開始第1次免疫，免疫間隔時(shí)間及取血間隔時(shí)間與健康鼠一致，均為兩周；2）光熱治療組：在第0天尾靜脈注射Cypate脂質(zhì)體（以Cypate為計(jì)，給藥劑量為0.5或1.5 mg·kg^-1），給藥24 h后，采用785 nm激光器1.5 W·cm^-2條件下對腫瘤部位照射3 min；3）分子橋介入：待免疫的荷瘤鼠血清檢測出相應(yīng)抗體后，為接種腫瘤后第22天，即光熱治療介入后第1天，尾靜脈注射分子橋，并以此為起點(diǎn)其后的第2、3、5、7、9天給予相應(yīng)藥物；介入分子橋HA-ADM或ADM時(shí)，濃度以ADM為計(jì)，給藥劑量均為0.33 mg·kg^-1。其后，觀察并測量各組小鼠腫瘤體積，以第0天測量體積V₀設(shè)為初始體積，計(jì)算各組瘤體積增長倍數(shù)做為指標(biāo)，測量第i天的腫瘤體積增長倍數(shù)=（V_i -V₀）/ V₀。治療24天后，對照組小鼠出現(xiàn)死亡，將全部小鼠處死，取出其腫瘤組織，并拍攝照片。

由圖17A可知，組1A（陰性對照組1，非免疫+PBS）腫瘤生長速度明顯最快，組2A（陰性對照組2，單純免疫，免疫+PBS）腫瘤生長速度則稍低于陰性對照組，而且組2B（免疫及單純化療，免疫+ ADM）、組2C（分子橋引導(dǎo)免疫治療組，免疫+HA-ADM）、組1B(化療藥對照組，非免疫+ ADM）、組1C（主動靶向化療組、非免疫+HA-ADM）的腫瘤生長速度，均較為接近。但是，以下各組的瘤體顯著減小或不復(fù)發(fā)：組2E（實(shí)驗(yàn)組1，免疫/HA-ADM/PTT,1.5mg·kg^-1，組2D（實(shí)驗(yàn)組2，免疫/HA-ADM/PTT,0.5mg·kg^-1，以及組1D（陽性對照組，非免疫/HA-ADM/PTT，1.5mg·kg^-1）?？梢妼?shí)驗(yàn)組1（免疫+HA-ADM +PTT，1.5 mg·kg^-1）、實(shí)驗(yàn)組2（免疫+HA-ADM +PTT，0.5 mg·kg^-1）腫瘤生長速度明顯降低，且Cypate脂質(zhì)體的給藥濃度越高，抑瘤效果越明顯，而沒有免疫、體內(nèi)無抗體的靶向光熱治療聯(lián)合主動靶向化療組（非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg^-1)）的抑瘤效果也不錯。

圖17B為治療24天后各組腫瘤組織照片，由圖可知實(shí)驗(yàn)組（靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療組）與對照組相比，以及參考實(shí)例一中單獨(dú)Cypate脂質(zhì)體光熱治療抗腫瘤活性的研究，發(fā)現(xiàn)Cypate脂質(zhì)體給藥濃度為0.5 mg·kg^-1和1.5 mg·kg^-1時(shí)，腫瘤在給藥24 h后進(jìn)行激光照射后，分別在第9天和13天出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況。而將光熱治療結(jié)合免疫治療后，腫瘤復(fù)發(fā)率均有所下降。實(shí)驗(yàn)組1（免疫+HA-ADM +PTT，Cypate脂質(zhì)體1.5 mg·kg^-1）、實(shí)驗(yàn)組2（免疫+HA-ADM + PTT，Cypate脂質(zhì)體0.5 mg·kg^-1），以本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，腫瘤復(fù)發(fā)抑制率從低濃度的20%，提高至高濃度的60%。而沒有免疫、體內(nèi)無抗體的靶向光熱治療聯(lián)合主動靶向化療組（非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg^-1)）僅能達(dá)到20%的腫瘤復(fù)發(fā)抑制率?？梢娝O(shè)計(jì)的以Cypate脂質(zhì)體經(jīng)過光熱治療后，殺死實(shí)體腫瘤，而剩余少量殘留的腫瘤細(xì)胞則通過免疫原ADM-BSA非特異性地激活機(jī)體的免疫功能并聯(lián)合分子橋HA-ADM腫瘤靶向功能的免疫治療而被消除或抑制，證實(shí)了主動靶向光熱治療聯(lián)合主動免疫治療可抑制腫瘤生長并一定程度地抑制腫瘤復(fù)發(fā)。

綜上所述，本發(fā)明由Cypate脂質(zhì)體、ADM-BSA與HA-ADM組成的復(fù)合制劑，提供了一個(gè)能方便、高效提高腫瘤特異性，并有效抑制腫瘤生長和復(fù)發(fā)的聯(lián)合治療腫瘤的方法，主要包含兩個(gè)主要部分，通過近紅外激光結(jié)合光熱試劑對間質(zhì)腫瘤照射，通過包載光熱材料的脂質(zhì)體產(chǎn)生的光熱效應(yīng)，對腫瘤產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性損傷，同時(shí)利用免疫原ADM-BSA非特異地激活機(jī)體的免疫功能，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用分子橋HA-ADM，將增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的免疫識別能力以及一定的靶向化療能力，從而達(dá)到更好的抗腫瘤效果。這兩個(gè)組成部分均能激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)力。動物試驗(yàn)研究表明，將具有選擇性光熱治療與提高免疫系統(tǒng)的響應(yīng)性結(jié)合的聯(lián)合治療應(yīng)用，不僅可以摧毀治療原發(fā)性腫瘤，也有根除治療遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移腫瘤的潛力。因此熱療聯(lián)合免疫治療復(fù)合制劑表現(xiàn)出了其抗腫瘤活性方面的優(yōu)勢，為進(jìn)一步的免疫治療聯(lián)合光熱治療的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)方法，并為開發(fā)生物相容性好、靶向性好、光熱轉(zhuǎn)換效率高的包載光熱試劑Cypate脂質(zhì)體并結(jié)合ADM-BSA、HA-ADM在腫瘤免疫治療展示出應(yīng)用前景。