本發(fā)明屬于化學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及抗HIV蛋白酶抑制劑硫酸茚地那韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素抗炎效應(yīng)及治療急性呼吸窘迫綜合癥治療中糖皮質(zhì)激素長期使用導(dǎo)致的耐受。

背景技術(shù)：

糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素。糖皮質(zhì)激素有快速、強(qiáng)大而非特異性的抗炎作用。對(duì)各種炎癥均有效。在炎癥初期，GC抑制毛細(xì)血管擴(kuò)張，減輕滲出和水腫，又抑制白血細(xì)胞的浸潤和吞噬，而減輕炎癥癥狀。在炎癥后期，抑制毛細(xì)血管和纖維母細(xì)胞的增生，延緩肉芽組織的生成。而減輕疤痕和粘連等炎癥后遺癥。糖皮質(zhì)激素為治療急性呼吸窘迫綜合癥和哮喘的常用藥物，但在長期使用或者大劑量應(yīng)用時(shí)，出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素的療效下降的現(xiàn)象，稱為糖皮質(zhì)激素耐受。糖皮質(zhì)激素結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)，活化的GR迅速轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制減少基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄激活的GR結(jié)合糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GRE)，誘導(dǎo)抗炎靶基因的轉(zhuǎn)錄，如lipocortin-1的合成。糖皮質(zhì)激素治療建議不超過14天[Steinberg KB,Hudson LD,Goodman RB,et al.Effi cacy and safety of corticosteroids for persistent acute respiratory distress syndrome.N Engl J Med 2006；354:1671-1684]，原因是大劑量糖皮質(zhì)激素長期使用導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素耐受，即糖皮質(zhì)激素不能有效地與其受體糖皮質(zhì)激素受體α(GRα)有效結(jié)合，即細(xì)胞漿中GRα下降。GRα的轉(zhuǎn)錄活性則被抑制，不能抑制炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致抗炎效果減弱、耐受。

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指非心源性的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致嚴(yán)重的急性缺氧性呼吸衰竭，臨床上以呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫為特征。ARDS肺部的最基本病理改變是肺血管內(nèi)皮和肺上皮急性彌漫性損傷及透明膜。ARDS發(fā)病危險(xiǎn)因素既可來自肺的直接損傷，亦可來自間接損傷[The ARDS Definition Task Force,Ranieri VM,Rubenfeld GD,Thompson BT,Ferguson ND,Caldwell E,Fan E,Camporota L,Slutsky AS:Acute Respiratory Distress Syndrome:The Berlin Definition2012,307:2526–2533]。在美國，成人ARDS患者發(fā)病率為每年10萬人中有7人發(fā)病，雖然ARDS的管理有了重大進(jìn)展，根據(jù)近3年的臨床研究顯示28天內(nèi)有20-40％死亡，另外，還有15-20％的患者在12個(gè)月內(nèi)死亡[Rosuvastatin for sepsis-associated acute respiratory distress syndrome.N Engl J Med 2014；370:2191–200.；Sweeney RM,McAuley DF.Acute respiratory distress syndrome.Lancet.2016 Apr 28.pii:S0140-6736(16)00578-X.]。尋找與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用的藥物以改善糖皮質(zhì)激素的耐受很有必要。

臨床上抗HIV蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)硫酸茚地那韋(Indinavir sulfate)的適應(yīng)癥為和其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)合使用，用于治療成人及兒童HIV-1感染。成人的臨床研究證明減緩艾滋病的發(fā)展進(jìn)程或致死亡的危險(xiǎn)性，增加總體存活率，使血清病毒核糖核酸處于持久性低水平，使CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)呈持久性升高，但抗HIV蛋白酶抑制劑與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，預(yù)防或治療糖皮質(zhì)激素長期使用導(dǎo)致的耐受的藥理作用未見報(bào)道。本發(fā)明人通過大量的研究發(fā)現(xiàn)抗HIV蛋白酶抑制劑與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，可以明顯抑制靶細(xì)胞細(xì)胞漿中GRα的下降，減少糖皮質(zhì)激素長期使用導(dǎo)致的耐受，增強(qiáng)ARDS治療中糖皮質(zhì)激素的抗炎效應(yīng)?；诖耍景l(fā)明人發(fā)明了抗HIV蛋白酶抑制劑硫酸茚地那韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，減少糖皮質(zhì)激素長期使用導(dǎo)致的耐受，從而增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素的療效，延長糖皮質(zhì)激素的使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了抗HIV蛋白酶抑制劑硫酸茚地那韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，治療急性呼吸窘迫綜合癥治療中糖皮質(zhì)激素長期使用導(dǎo)致的耐受，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素的抗炎作用的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的抗HIV蛋白酶抑制劑硫酸茚地那韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，抑制在急性呼吸窘迫綜合癥治療中靶細(xì)胞細(xì)胞漿中GRα的下降治療糖皮質(zhì)激素長期使用導(dǎo)致的耐受。

本發(fā)明提供的糖皮質(zhì)激素包括中效糖皮質(zhì)激素和長效糖皮質(zhì)激素。

本發(fā)明提供的長效糖皮質(zhì)激素包括可以為地塞米松、丙酸氟替卡松。

本發(fā)明提供的中效糖皮質(zhì)激素可以為甲潑尼龍琥珀酸鈉(甲強(qiáng)龍)，潑尼松龍

本發(fā)明提供的中效糖皮質(zhì)激素優(yōu)選甲潑尼龍琥珀酸鈉(甲強(qiáng)龍)。

本發(fā)明提供的茚地那韋的使用劑量范圍是400mg～4800mg，優(yōu)選400mg～2400mg。

具體實(shí)施例

實(shí)驗(yàn)例1抗HIV蛋白酶抑制劑硫酸茚地那韋對(duì)LPS刺激肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的GRα和磷酸化NF-κB的影響

1.1藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品

LPS(Sigma公司產(chǎn)品，購買于大連美侖生物技術(shù)有限公司)

硫酸茚地那韋(純度99.1％，購買于上海翰香生物科技有限公司)

GRα抗體(Glucocorticoid Receptor(D8H2)Rabbit mAb，cellsignal公司，貨號(hào)：3660s) 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(中科院細(xì)胞庫)

甲強(qiáng)龍(注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，輝瑞制藥生產(chǎn)，500mg/瓶)

1.2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

當(dāng)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長融合至70％-80％，換新鮮培養(yǎng)液，將傳代的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分組包括：(1)陰性對(duì)照組；(2)甲強(qiáng)龍?zhí)幚斫M(30μM作用時(shí)間96h)；(3)甲強(qiáng)龍?zhí)幚斫M(30μM作用時(shí)間96h)+硫酸茚地那韋(1μM作用時(shí)間96h)；(4)甲強(qiáng)龍?zhí)幚斫M(30μM作用時(shí)間96h)+硫酸茚地那韋(3μM作用時(shí)間96h)；(5)甲強(qiáng)龍?zhí)幚斫M(30μM作用時(shí)間96h)+硫酸茚地那韋(10μM作用時(shí)間96h)；培養(yǎng)的細(xì)胞裂解，以總蛋白提取試劑及細(xì)胞核提取試劑提取總蛋白和細(xì)胞核組分，BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce公司)測(cè)定蛋白濃度后，取50μg樣品蛋白進(jìn)行10％的十二烷基磺酸鈉2聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠變性電泳、然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，分別加入GRα抗體，β-actin作內(nèi)參，Western blot檢測(cè)細(xì)胞胞漿中GRα蛋白表達(dá)。以LPS未刺激組作為對(duì)照，計(jì)為相應(yīng)蛋白的100％，分析抗HIV蛋白酶抑制劑+甲強(qiáng)龍與單純甲強(qiáng)龍?zhí)幚斫M對(duì)GRα的表達(dá)差異，組間進(jìn)行T檢驗(yàn)。

表1硫酸茚地那韋對(duì)LPS刺激肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的GRα的影響(n＝5)

^*，p<0.05，^**，p<0.01，與LPS刺激比較；^#，p<0.05，^##，p<0.01，與LPS+甲強(qiáng)龍組比較

實(shí)驗(yàn)例2抗HIV蛋白酶抑制劑硫酸茚地那韋對(duì)LPS導(dǎo)致的急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)模型大鼠的影響

2.1藥品與試劑

LPS(Sigma公司產(chǎn)品，購買于大連美侖生物技術(shù)有限公司)

硫酸茚地那韋(純度99.1％，購買于上海翰香生物科技有限公司)

甲強(qiáng)龍(注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，輝瑞制藥生產(chǎn)，500mg/瓶)

GRα抗體(Glucocorticoid Receptor(D8H2)Rabbit mAb，cellsignal公司，貨號(hào)：3660s) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Sprague Dawley大鼠，雄性，體重150g-200g，山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為：SYXK(魯)20030020。

2.2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.2.1內(nèi)毒素二次打擊ARDS大鼠模型制備、分組及給藥

雄性大鼠70只，體重180-220g，取60只腹腔注射LPS 2mg/kg，16小時(shí)后10％水合氯醛麻醉，分離氣管，氣管內(nèi)滴入LPS生理鹽水溶液，體積0.2mL/只，劑量：5mg/kg。隨機(jī)分為6組，即模型組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg組，甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥40mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥80mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥240mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥480mg/kg組。另外取10只大鼠作為對(duì)照組。氣管內(nèi)滴入LPS 24小時(shí)開始給藥，連續(xù)給藥5天，每日給藥1次，末次給藥結(jié)束24小時(shí)，處死動(dòng)物，取肺，稱重，測(cè)定肺系數(shù)，取一葉肺，HE染色制備病理片，進(jìn)行病理評(píng)分，病理評(píng)分根據(jù)參考文獻(xiàn)[Matute-Bello,G.et al.Acute Lung Injury in Animals Study Group.An official American Thoracic Society workshop report:features and measurements of experimental acute lung injury in animals.Am J Respir Cell Mol Biol 44,725-738(2011).]進(jìn)行評(píng)分。比較硫酸茚地那韋組加甲強(qiáng)龍與模型組及單純甲強(qiáng)龍組的差異。組間進(jìn)行T檢驗(yàn)。

2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2結(jié)果顯示甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg組可明顯減少ARDS模型大鼠的肺系數(shù)，降低肺病理評(píng)分(與模型組比較，p<0.05或p<0.01)；甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥40mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥80mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥240mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥4800mg/kg組明顯減少ARDS模型大鼠的肺系數(shù)，降低肺病理評(píng)分(與模型組比較，p<0.01)；與甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg組比較，甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥40mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥80mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥240mg/kg組、甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥480mg/kg組明顯減少ARDS模型大鼠的肺系數(shù)，降低肺病理評(píng)分(與甲強(qiáng)龍組比較，p<0.05或p<0.01)，說明硫酸茚地那韋與甲強(qiáng)龍聯(lián)合使用，明顯增強(qiáng)甲強(qiáng)龍的抗ARDS作用。甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥480mg/kg組減少ARDS模型大鼠的肺系數(shù)，降低肺病理評(píng)分與甲強(qiáng)龍肌肉注射20mg/kg+硫酸茚地那韋灌胃給藥240mg/kg組比較，無顯著性差異。

表2硫酸茚地那韋對(duì)ARDS模型大鼠肺系數(shù)和肺病理的影響(n＝10)

^*，p<0.05，^**，p<0.01，與模型組比較；^#，p<0.05，^##，p<0.01，與甲強(qiáng)龍組比較。