本發(fā)明涉及醫(yī)療技術領域，具體而言，涉及一種黑色素含量變化的檢測方法。

背景技術：

皮膚的顏色來自于角質(zhì)形成細胞內(nèi)存儲的黑色素。人體的正常與健康的膚色是黑色素合成與代謝平衡的結果。黑色素是一種生物色素，是酪氨酸或3,4-二羥苯丙氨經(jīng)過一連串化學反應所形成，動物、植物與原生生物都有這種色素。在正常人體表皮中，一個黑素細胞周圍大約有40個角質(zhì)形成細胞，稱為表皮的黑色素形成單位。黑色素在黑素細胞中的黑素小體內(nèi)合成，黑素小體是合成和儲存黑色素的黑素細胞內(nèi)溶酶體相關細胞器。黑色素在黑素小體內(nèi)合成后，隨其遷移到黑素細胞樹突末端，樹突向鄰近的角質(zhì)形成細胞生長并釋放。然后，黑素小體在多種分子的調(diào)節(jié)下，進入鄰近的角質(zhì)形成細胞，形成皮膚色素并起到有效的光防護作用。

目前黑色素含量變化的檢測方法多采用生物化學方法，如氫氧化鈉(NaOH)裂解法、比色法定量檢測、Masson-Fontana氏黑色素染色法(銀染法)等，或者通過一些指標檢測間接反映，如酪氨酸酶活性檢測等。這些方法都需要裂解組織或細胞，或者對組織或細胞進行固定，而無法反映細胞活性狀態(tài)下的黑色素含量變化，其檢測結果可靠性較低。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種黑色素含量變化的檢測方法，此黑色素含量變化的檢測方法能夠反映細胞活性狀態(tài)下的黑色素含量變化，其檢測結果可靠性高。

本發(fā)明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現(xiàn)的：

一種黑色素含量變化的檢測方法，包括以下步驟：利用光聲成像設備往待測活體的表皮發(fā)出脈沖激光，激發(fā)波長在700nm處進行掃描，然后將所述光聲成像設備的探頭貼近所述待測體，同時接收光聲信號和超聲信號，根據(jù)超聲信號所顯示的圖像，圈定細胞和組織的待測區(qū)域，讀取待測區(qū)域的光聲信號的強度均值，根據(jù)待測體的黑色素層的光聲信號波形及強度均值，得到待測體的皮膚組織中的黑色素含量的變化；其中，所述探頭為光纖-超聲一體化探頭。

相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明包括以下有益效果：本發(fā)明利用光聲成像設備的光聲效應的原理，當光聲成像設備的短脈沖激光照射生物組織時，組織內(nèi)的吸收體吸收了光能之后發(fā)生局部的升溫，促使組織發(fā)生熱彈性膨脹，產(chǎn)生超聲波，在組織體表面附近被換能器接受，生成光聲信號。再利用探頭接收產(chǎn)生的光聲信號，并儲存數(shù)據(jù)。電腦系統(tǒng)自動處理數(shù)據(jù)，通過圖像以及數(shù)據(jù)分析，根據(jù)待測體的黑色素層的光聲信號波形及強度均值，即得到待測活體的表皮中的黑色素含量的變化情況。本發(fā)明提供的檢測方法具有如下優(yōu)點：

(1)無需裂解或固定組織、細胞，能夠在活體動物上進行檢測，能夠反映細胞活性狀態(tài)下的黑色素含量的變化，檢測結果的可靠性強；

(2)可以對同一個研究個體進行長時間反復跟蹤成像，既可以實現(xiàn)數(shù)據(jù)的可比性，避免個體差異對試驗結果的影響；

(3)操作簡單，無需其他化學試劑，可在10min以內(nèi)實現(xiàn)黑色素的快速檢測；

(4)可定量檢測，將光聲信號量化即可實現(xiàn)黑色素的定量檢測。

附圖說明

為了更清楚的說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實施例一提供的加入GFP對照腺病毒的體外培養(yǎng)細胞處理5天后離心收集的細胞沉淀示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例一提供的加入1微升表達Wnt3a腺病毒的體外培養(yǎng)細胞處理5天后離心收集的細胞沉淀示意圖；

圖3是本發(fā)明實施例一提供的加入2微升表達Wnt3a腺病毒的體外培養(yǎng)細胞處理5天后離心收集的細胞沉淀示意圖；

圖4是本發(fā)明實施例一提供的加入4微升表達Wnt3a腺病毒的體外培養(yǎng)細胞處理5天后離心收集的細胞沉淀示意圖；

圖5是本發(fā)明實施例一提供的加入6微升表達Wnt3a腺病毒的體外培養(yǎng)細胞處理5天后離心收集的細胞沉淀示意圖；

圖6是本發(fā)明實施例一提供的加入GFP對照腺病毒的體外培養(yǎng)細胞的光聲信號檢測示意圖；

圖7是本發(fā)明實施例一提供的加入1微升表達Wnt3a腺病毒的體外培養(yǎng)細胞的光聲信號檢測示意圖；

圖8是本發(fā)明實施例一提供的加入2微升表達Wnt3a腺病毒的體外培養(yǎng)細胞的光聲信號檢測示意圖；

圖9是本發(fā)明實施例一提供的加入4微升表達Wnt3a腺病毒的體外培養(yǎng)細胞的光聲信號檢測示意圖；

圖10是本發(fā)明實施例一提供的加入6微升表達Wnt3a腺病毒的體外培養(yǎng)細胞的光聲信號檢測示意圖；

圖11是本發(fā)明實施例一提供的Vevo Zr軟件分析量化得到的信號強度均值示意圖；

圖12是本發(fā)明實施例二提供的Vevo Zr軟件分析量化得到的信號強度均值示意圖；

圖13是本發(fā)明實施例三提供的K14-kitl轉基因小鼠毛囊生長期皮膚中黑色素情況的示意圖；

圖14是本發(fā)明實施例三提供的K14-kitl轉基因小鼠毛囊靜止期皮膚中黑色素情況的示意圖；

圖15是本發(fā)明實施例三提供的普通C57BL/6小鼠毛囊生長期皮膚中黑色素情況的示意圖；

圖16是本發(fā)明實施例三提供的普通C57BL/6小鼠毛囊靜止期皮膚中黑色素情況的示意圖；

圖17是本發(fā)明實施例三提供的K14-kitl轉基因小鼠毛囊生長期皮膚中黑色素情況的示意圖；

圖18是本發(fā)明實施例三提供的K14-kitl轉基因小鼠毛囊靜止期皮膚中黑色素情況的示意圖；

圖19是本發(fā)明實施例三提供的普通C57BL/6小鼠毛囊生長期皮膚中黑色素情況的示意圖；

圖20是本發(fā)明實施例三提供的普通C57BL/6小鼠毛囊靜止期皮膚中黑色素情況的示意圖；

圖21是本發(fā)明實施例三提供的Vevo Zr軟件分析量化得到的信號強度均值示意圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的黑色素含量變化的檢測方法進行具體說明。

黑色素含量變化的檢測方法包括以下步驟：

步驟S1：利用光聲成像設備往待測體發(fā)出脈沖激光，激發(fā)波長在700nm處進行掃描；

步驟S2：將光聲成像設備的探頭貼近待測體，同時接收光聲信號和超聲信號，根據(jù)超聲信號所顯示的圖像，圈定細胞和組織的待測區(qū)域，讀取待測區(qū)域的光聲信號的強度均值，根據(jù)待測體的黑色素層的光聲信號波形及強度均值，得到待測體的皮膚組織中的黑色素含量的變化；其中，所述探頭為光纖-超聲一體化探頭。

由于探頭為光纖-超聲一體化探頭，所以其不僅能夠接收光聲信號，還能夠接收普通的超聲信號，而上述的超聲信號，就是指的這普通的超聲信號(非光聲信號)。當接收光聲信號和超聲信號后，會出現(xiàn)不同顏色的圖像，圖像中，光波激發(fā)產(chǎn)生的信號(光聲信號)為紅色部分，普通超聲波激發(fā)產(chǎn)生的信號(超聲信號)為灰色部分。光聲信號代表黑色素的顯像，超聲信號顯示組織的結構，圖像重疊后可得知光聲信號在組織中的定位。

在顯示圖像之后，在讀取待測區(qū)域之前，還包括：利用圖像分析軟件圈定待測區(qū)域。

為了進行比較，在脈沖激光的時間段內(nèi)，可保持圖像的對比度一致，保持圖像的亮度一致。圈定待測區(qū)域是在顯示出的圖像中，選取顯示效果較好的區(qū)域，進行檢測。

光聲成像是利用光聲效應，通過生物體對光吸收率的不同，從而導致產(chǎn)生的聲波存在差異，來達到區(qū)分測試物的不同組織結構和功能的目的。它結合了超聲的高穿透力和光學的高對比度特性，因此比目前的純超聲具有更高的對比度和分辨率。本發(fā)明就是提供了一種能夠?qū)M織和細胞中的黑色素含量變化進行快速無損檢測、可以對同一樣本的實時連續(xù)動態(tài)進行監(jiān)測、基于光聲信號的測定黑色素濃度的方法。當利用本發(fā)明提供的方法進行檢測時，光聲成像設備的光聲信號激發(fā)系統(tǒng)發(fā)出脈沖激光，被待測體及其內(nèi)的黑色素吸收，應激產(chǎn)生出光聲信號，接著探頭貼近待測體，探頭中的光聲信號采集系統(tǒng)通過超聲探測器接收待測體產(chǎn)生的光聲信號，并儲存數(shù)據(jù)，再通過與光聲成像設備連接的電腦系統(tǒng)自動處理被記錄的待測體的光聲信號波形，經(jīng)時域分析，得知待測體中黑色素含量變化。

上述黑色素含量變化的檢測方法中，使用的探頭為手持式探頭。手持式探頭方便手握，可以針對不同部位實現(xiàn)簡單快捷的檢測。

另外，探頭的光纖束為25.4×1.25mm，震源深度為9～11mm，中心頻率為20～22MHz，軸向分辨率為70～80μm。利用此種探頭進行檢測，能夠得到高靈敏度、高分辨率的實時在體影像。

上述黑色素含量變化的檢測方法中，脈沖激光的能量密度在20mJ/cm²以下。

當待測體為體外培養(yǎng)細胞時，在利用光聲成像設備往待測體發(fā)出脈沖激光之前，還包括：構建瓊脂糖凝膠圓孔模型，待其凝固后，將體外培養(yǎng)細胞加入到瓊脂糖凝膠圓孔模型的圓孔中。

而構建瓊脂糖凝膠圓孔模型的方法為：制備質(zhì)量濃度為150～250mg/kg的瓊脂糖凝膠模塊，并使瓊脂糖凝膠模塊的中部保留直徑為0.8～1.2cm的圓孔。

當待測體為動物活體時，在利用光聲成像設備往待測體發(fā)出脈沖激光之前，還包括：對動物活體進行麻醉；

在將所述光聲成像設備的探頭貼近所述待測體時，探頭需緊貼動物活體的待測皮膚。也就是，在步驟S1之前，先進行麻醉，然后進行步驟S1和步驟S2的操作，在步驟S2中，探頭緊貼動物活體的待測皮膚。若動物活體存在毛發(fā)，則麻醉后可以利用脫毛劑脫去動物待測皮膚位置的毛發(fā)，然后固定探頭與待測皮膚接觸。

但若待測體為體外培養(yǎng)細胞時，則需要先制備帶有直徑0.8～1.2cm孔徑的濃度為2％的瓊脂糖凝膠模塊，收集細胞于瓊脂糖凝膠模塊的圓孔中，將探頭放置于瓊脂糖凝膠模塊上進行檢測。

其中，麻醉的方法可以為：利用動物麻醉劑按照40～45mg/kg對動物活體進行腹腔注射。當然，麻醉應根據(jù)實際情況選取藥品和施藥部位，不同動物體的注射或者施藥部位有所區(qū)別。動物麻醉劑可以為苯巴比妥鈉、戊巴比妥鈉、氨基甲酸乙酯等，優(yōu)選戊巴比妥鈉。

另外，動物活體的檢測結束后，待動物清醒后繼續(xù)飼養(yǎng)，可以實現(xiàn)同一個體的動態(tài)連續(xù)觀察。

上述黑色素含量變化的檢測方法中，光聲成像設備可以為加拿大維勝公司的Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)。Vevo LAZR的光聲成像技術采用整合了光纖的光纖-超聲一體化探頭，可向深部組織發(fā)送納秒級的脈沖激光。不同組織對激光能量的選擇特異性吸收，引起短暫的熱膨脹，此過程產(chǎn)生的聲壓波被256震源的線陣探頭檢測到，而傳回的超聲脈沖同樣被探頭檢測到，并用于生高分辨率解剖學影像。Vevo LAZR獨具的技術優(yōu)勢，使在獲得光聲信號的同時，能得到組織的超聲影像，實現(xiàn)光聲/超聲的共成像。

上述黑色素含量變化的檢測方法中，可以設置光聲成像設備的顯示優(yōu)先率為98％，轉換成圖像的紅色信號即為檢測到的光聲信號，灰階信號為超聲影像(可呈現(xiàn)局部組織結構)，圖像重疊后可顯示光聲信號在組織中的定位?？梢栽诠潭úㄩL700nm處連續(xù)拍攝73幀(約1秒)，設置圖像亮度和對比度保持一致(如亮度50，對比度50)。截取圖像進行信號分析，圈定要分析的區(qū)域，圖像分析軟件分析樣本的光聲信號強度均值。從成像圖中獲取黑色素的定位和分布信息以及每個黑色素檢測點的量化光譜曲線及強度值，計算光聲效應(photoacoustic effect，PA)的平均值。使用加拿大維勝公司的Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)時，可以配備lz250探頭。

以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述：

實施例一

本實施例針對體外培養(yǎng)細胞進行檢測，提供的黑色素含量變化的檢測方法包括以下步驟：

(1)細胞處理：iMC23黑素細胞株(無黑色素產(chǎn)生的黑素母細胞株)，采用DMEM培養(yǎng)液【含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)】進行培養(yǎng)(CO₂培養(yǎng)箱，37℃，含5％CO₂，貼壁培養(yǎng))，按照每孔10⁶濃度接種在6孔板中，每孔加入不同滴度的表達Wnt3a的腺病毒感染細胞，以刺激細胞黑色素的合成。第二天檢測熒光表達量，確定腺病毒感染成功。誘導培養(yǎng)5天后，用胰酶將細胞消化并離心收集。

(2)構建瓊脂糖凝膠圓孔模型：制備2％的瓊脂糖凝膠模塊，中間留有直徑為1cm的圓孔，待其凝固后，每個圓孔中分別加入步驟(1)中的不同處理組收集的細胞。

(3)利用Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)(VisualSonics公司，多倫多，加拿大)配備lz250探頭(光纖束為25.4×1.25mm；震源深度10mm；中心頻率為21MHz；軸向分辨率為75μm)獲得光聲信號。激發(fā)波長為700nm、激光能量密度小于20mJ/cm²。每個樣本的光聲信號強度通過Vevo Zr軟件分析量化。將探頭放置于瓊脂糖凝膠模塊上進行檢測。

結果可參見圖1～圖11，其中，1為對照組(加入GFP對照腺病毒)，2為處理組(加入1微升表達Wnt3a腺病毒)，3為處理組(加入2微升表達Wnt3a腺病毒)，4為處理組(加入4微升表達Wnt3a腺病毒)，5為處理組(加入6微升表達Wnt3a腺病毒)。圖1～圖5為處理5天后離心收集的細胞沉淀，可見細胞沉淀的顏色隨著加入Wnt3a腺病毒的增加而逐漸變黑。圖6～圖10為各處理組細胞的光聲信號檢測，圖11為Vevo Zr軟件分析量化得到的信號強度均值。可見隨著Wnt3a濃度的增加，黑色素的光聲信號逐漸增強。

實施例二

本實施例針對體外培養(yǎng)細胞進行檢測，提供的黑色素含量變化的檢測方法包括以下步驟：

(1)細胞處理：iMC23黑素細胞株(無黑色素產(chǎn)生的黑素母細胞株)，采用DMEM培養(yǎng)液(含10％FBS)進行培養(yǎng)(CO₂培養(yǎng)箱，37℃，含5％CO₂，貼壁培養(yǎng))，按照每孔10⁶濃度接種在6孔板中，每孔分別加入GFP對照腺病毒和表達Wnt3a的腺病毒感染細胞，以刺激細胞黑色素的合成。第二天檢測熒光表達量，確定腺病毒感染成功。誘導培養(yǎng)第2天和第5天后，用胰酶將細胞消化并離心收集。

(2)構建瓊脂糖凝膠圓孔模型：制備2％的瓊脂糖凝膠模塊，中間留有直徑為1cm的圓孔，待其凝固后，每個圓孔中分別加入步驟(1)中的不同處理組收集的細胞。

(3)利用Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)(VisualSonics公司，多倫多，加拿大)配備lz250探頭(光纖束為25.4×1.25mm；震源深度10mm；中心頻率為21MHz；軸向分辨率為75μm)獲得的光聲信號。激發(fā)波長為700nm、激光能量密度小于20mJ/cm²。每個樣本的光聲信號強度通過Vevo Zr軟件分析量化。

結果可參見圖12，其中，1為對照組(加入GFP對照腺病毒)，2為處理組(加入表達Wnt3a腺病毒2天)，3為處理組(加入表達Wnt3a腺病毒4天)，4為處理組(加入表達Wnt3a腺病毒6天)。Vevo Zr軟件分析量化得到的信號強度均值?？梢婋S著Wnt3a處理時間的延長，黑色素的光聲信號逐漸增強。

實施例三

本實施例針對動物活體進行檢測，提供的黑色素含量變化的檢測方法包括以下步驟：

(1)動物準備：普通C57BL/6小鼠和K14-kitl轉基因小鼠，比較背部皮膚在不同生長時期皮膚中黑色素含量的差異。兩種小鼠在出生后6周(毛囊生長期)和8周(毛囊靜止期)，分別進行光聲成像觀察。先用戊巴比妥鈉按40mg/kg腹腔注射，小鼠麻醉后，利用脫毛劑去除小鼠背部檢測區(qū)域的皮膚表面毛發(fā)，將經(jīng)過脫毛的小鼠放置于檢測箱中，固定lz250探頭與檢測部位的皮膚接觸。

(2)利用Vevo LAZR光聲成像設備(VisualSonics公司，多倫多，加拿大)配備lz250探頭(光纖束為25.4×1.25mm；震源深度10mm；中心頻率為21MHz；軸向分辨率為75μm)獲得的光聲信號。激發(fā)波長為700nm、激光能量密度小于20mJ/cm²。每個樣本的光聲信號強度通過Vevo Zr軟件分析量化。

結果可參見圖13～圖21，K14-kitl-Ana為K14-kitl轉基因小鼠的毛囊生長期，K14-kitl-Tel為K14-kitl轉基因小鼠的毛囊靜止期；B6-Ana為普通C57BL/6小鼠的毛囊生長期，B6-Tel為普通C57BL/6小鼠的毛囊靜止期。Vevo Zr軟件分析量化得到的信號強度均值?？梢奒14-kitl-Ana皮膚組織中黑色素的光聲信號最強，K14-kitl-Tel信號減弱，與靜止期皮膚中黑素細胞的減少有關，但由于表皮中的黑色素依然存在，所以能檢測到相關信號。B6-Ana小鼠毛囊中黑色素明顯，檢測信號較強，靜止期后黑色素明顯減少，表皮中沒有黑色素，信號較弱。所檢測信號的強弱趨勢與組織切片觀察結果一致。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。