本發(fā)明涉及一種藥物組合物，更具體地，涉及一種以茶多酚修飾的還原氧化石墨烯作為載體的抗癌藥物組合物，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

化學治療是目前應用最為廣泛的癌癥治療手段。然而，傳統(tǒng)的化學治療會導致很多的負面效應，如頭發(fā)脫落、熱損傷、惡心等癥狀。為此，現(xiàn)有技術(shù)提出了如利用氧化石墨烯等具有生物相容性的材料來負載和傳遞治療藥物的方法，以提升癌癥治療效率。

然而，氧化石墨烯在水溶液和含有高濃度鹽、蛋白和血清的細胞培養(yǎng)液中很容易產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，且對哺乳動物細胞的具有生物毒性。另一方面，雖然研究發(fā)現(xiàn)還原態(tài)的氧化石墨烯的生物毒性較氧化石墨烯低，但現(xiàn)有的還原方法存在產(chǎn)率低、成本高的問題；而成本低的還原方法，其使用的還原劑通常具有強毒性或強酸堿度，且其產(chǎn)物分散性差，阻礙了其在生物醫(yī)學中的應用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種具有高負載率、可被細胞內(nèi)吞，且對癌細胞有特異性作用的藥物組合物。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種可選擇性的在癌細胞內(nèi)釋放藥物的藥物組合物。

本發(fā)明的又一個目的是提供一種利用茶多酚修飾生物載體材料，以增進抗抗癌治療效果的方法。

本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點可以從本發(fā)明所揭露的技術(shù)特征中得到進一步的了解。

為達上述之一或部份或全部目的或是其他目的，本發(fā)明一方面提供了一種藥物組合物，其以茶多酚修飾的還原氧化石墨烯作為載體，吸附鹽酸阿霉素所組成。

優(yōu)選地，所述的藥物組合物的平面厚度為17.42±6.26nm。

優(yōu)選地，所述的藥物組合物的X射線粉末衍射特征峰包含2θ＝26°、32°和46°。

優(yōu)選地，所述的藥物組合物的紅外光譜特征峰包含3410cm^-1、1724cm^-1、1052cm^-1和1750cm^-1。

優(yōu)選地，所述的載體可選擇性的對癌細胞產(chǎn)生細胞毒性。

優(yōu)選地，所述的載體可促進阿霉素進入及富集于癌細胞核。

優(yōu)選地，所述的載體可促進癌細胞的細胞凋亡。

優(yōu)選地，所述的載體可應用于制備抗癌藥物。

優(yōu)選地，所述的藥物組合物可應用制備抗癌藥物。

優(yōu)選地，所述的癌細胞包括口腔癌細胞。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明采用茶多酚作為還原劑和功能化試劑來修飾氧化石墨烯，制各茶多酚修飾的還原氧化石墨烯(簡稱茶多酚石墨烯)。相較于現(xiàn)有的還原氧化石墨烯，本發(fā)明的茶多酚石墨烯在水溶液和生理條件下都較為穩(wěn)定，水分散性和生物相容性良好，且可選擇性的對癌細胞產(chǎn)生毒性，對正常體細胞則表現(xiàn)出友好的性質(zhì)。此外，利用本發(fā)明的茶多酚石墨烯負載鹽酸阿霉素，可顯著提高阿霉素的對癌細胞的穿透性和細胞核富集量，并能促進癌細胞的細胞凋亡。因此，本發(fā)明在藥物傳遞、癌癥治療領(lǐng)域有廣泛的應用前景。

為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉優(yōu)選實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的氧化石墨烯(GO)和茶多酚石墨烯(TPG)的紫外可見光(UV-Vis)光譜圖。

圖2本發(fā)明的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯的拉曼(Raman)光譜圖。

圖3a～3d分別為本發(fā)明的氧化石墨烯、阿霉素石墨烯(GO-DOX)、茶多酚石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的掃描電子顯微鏡(SEM)影像。

圖4a～4d分別為本發(fā)明的氧化石墨烯、茶多酚石墨烯、阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯的原子力顯微鏡(AFM)影像。

圖5a為本發(fā)明的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯的X射線粉末衍射(XRD)圖。

圖5b分別為商購阿霉素(DOX)與本發(fā)明的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯的X射線粉末衍射圖。

圖5c為商購阿霉素與本發(fā)明的氧化石墨烯、茶多酚石墨烯、阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯的紅外光譜(FT-IR)圖。

圖5d為商購阿霉素與本發(fā)明的氧化石墨烯、茶多酚石墨烯、阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯在pH＝7.4下的ζ電位圖。

圖6a～6e分別為本發(fā)明的氧化石墨烯、茶多酚石墨烯、阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯與商購阿霉素的親水角圖。

圖7繪示pH值對本發(fā)明的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯的阿霉素負載效果的影響。

圖8繪示反應時間對本實施例的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯的阿霉素負載效果的影響，以及其吸附動力學。

圖9繪示阿霉素初始濃度對本實施例的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯的負載效果的影響，以及其吸附等溫線。

圖10繪示不同pH值和時間對本發(fā)明的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯的釋放效果的影響。

圖11繪示本發(fā)明的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯對成纖維細胞(L929)和腺樣囊性癌(ACC2)細胞的細胞存活率的影響。

圖12繪示本發(fā)明的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯對ACC2細胞的存活率的影響。

圖13為本發(fā)明的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯對ACC2細胞的穿透效果的細胞流式圖。

圖14為本實施例的氧化石墨烯、茶多酚石墨烯、阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯對ACC2細胞的凋亡促進效果的二維細胞流式圖。

具體實施方式

有關(guān)本發(fā)明的前述及其它技術(shù)內(nèi)容、特點與功效，在以下配合參考附圖中的一個優(yōu)選實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現(xiàn)。

除非另外說明，本文中的術(shù)語“氧化石墨烯”指的是剝離后的單層或多層氧化石墨，附圖中以縮寫“GO”表示。

除非另外說明，本文中的術(shù)語“茶多酚石墨烯”指的是茶多酚修飾的還原氧化石墨烯，附圖中以縮寫“TPG”表示。

除非另外說明，本文中的術(shù)語“阿霉素”指的是鹽酸阿霉素，為蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤抗生素阿霉素(doxorubicin)的鹽酸鹽，附圖中以縮寫“DOX”表示。

除非另外說明，本文中的術(shù)語“阿霉素石墨烯”指的是使用上述的氧化石墨烯作為藥物載體，負載了阿霉素的氧化石墨烯，附圖中以縮寫“GO-DOX”表示。

除非另外說明，本文中的術(shù)語“阿霉素茶多酚石墨烯”指的是使用上述的茶多酚修飾的還原氧化石墨烯作為藥物載體，負載了阿霉素的茶多酚石墨烯，附圖中以縮寫“TPG-DOX”表示。

除非另外說明，本文中的術(shù)語“細胞的異常增殖”指的是細胞的生長、分化和凋亡偏離細胞正常的生長周期。

除非另外說明，本文中的術(shù)語“細胞異常增殖有關(guān)的疾病”指的是為再生性障礙性貧血或惡性腫瘤，如口腔癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、肺癌、骨髓癌、前列腺癌或胃癌等。

實施例一

茶多酚石墨烯(TPG)的制備

步驟一：由氧化石墨制備氧化石墨烯。將10mg的氧化石墨在400W的超聲情況下超聲1h，使其分散于20mL的超純水中，繼續(xù)超聲一段時間，使其形成膠狀分散液。然后4000rpm離心20min，以分離沒有剝離開的氧化石墨和剝離完成的氧化石墨烯，去除沉淀、收集上清液。

步驟二：由氧化石墨烯制備茶多酚石墨烯。以茶多酚作為還原劑和功能化試劑，使用原位水熱合成法進行制備。首先，將60mg茶多酚溶于20mL的超純水中，然后慢慢加入20mL 0.5mg/mL的氧化石墨烯溶液中，強烈攪拌形成均勻的溶液。經(jīng)過10min的超聲處理后，將溶液轉(zhuǎn)入50mL的高溫反應釜中，在80℃下反應8h。最終得到的產(chǎn)物在11000rpm下離心，去掉上清液，使用超純水洗滌3次，然后置于透析袋中透析1周，以去除游離的茶多酚。

茶多酚石墨烯的表征

請參照圖1，圖1為本實施例的氧化石墨烯(GO)和茶多酚石墨烯(TPG)的紫外可見光(UV-Vis)光譜圖。如圖1所示，氧化石墨烯由于C＝C的π-π*轉(zhuǎn)變，在228nm處出現(xiàn)吸收峰；在使用茶多酚作為還原劑，修飾還原氧化石墨烯而生成茶多酚石墨烯后，228nm的吸收峰紅移到271nm，且208nm處出現(xiàn)了茶多酚的吸收峰，表明了茶多酚分子成功負載到氧化石墨烯上。

請參照圖2，圖2為本實施例的氧化石墨烯(GO)和茶多酚石墨烯(TPG)的拉曼(Raman)光譜圖。如圖2所示，氧化石墨烯和茶多酚石墨烯都呈現(xiàn)明顯的D峰和G峰。氧化石墨烯的G峰出現(xiàn)在1590cm^-1處，而茶多酚石墨烯的G峰藍移到1588cm^-1處，與純石墨的G峰(1587cm^-1)波長相近，表明了茶多酚成功還原了氧化石墨烯。此外，茶多酚石墨烯的D峰和G峰的強度比值(I_D/I_G)為0.99，高于氧化石墨烯的比值0.90，也表明了使用茶多酚還原后，石墨烯結(jié)構(gòu)的恢復。

請參照圖3a和3c。圖3a和3c分別為本實施例的氧化石墨烯(GO)和茶多酚石墨烯(TPG)的掃描電子顯微鏡(SEM)影像。其中，圖3a和3c中可觀察到分子團聚而產(chǎn)生的皺褶，且相較于圖3a中所示的氧化石墨烯的表面，圖3c中所示的茶多酚石墨烯的表面較為光滑，顯示茶多酚不但可作為石墨烯的還原劑，還可作為一種功能性修飾分子，插入石墨烯的層狀結(jié)構(gòu)中，可降低分子團聚現(xiàn)象。

請參照圖4。圖4a和4b分別為本實施例的氧化石墨烯(GO)和茶多酚石墨烯(TPG)的原子力顯微鏡(AFM)影像，其顯示了氧化石墨烯和茶多酚石墨烯的三維形貌。經(jīng)儀器自帶軟件量測，兩者的厚度分別約為1.02±0.07nm和1.91±0.04nm。

請參照圖5a。圖5a為本實施例的氧化石墨烯(GO)和茶多酚石墨烯(TPG)的X射線粉末衍射(XRD)圖，其橫坐標為峰位(即衍射峰的2θ衍射角)、縱坐標為峰高。如圖5a所示，氧化石墨烯的XRD特征峰為2θ＝10°，在氧化石墨烯的含氧官能團被負載的茶多酚取代后，得到的茶多酚石墨烯的XRD特征峰紅移為2θ＝26°。

請參照圖5c。圖5c為商購阿霉素(DOX)與本實施例的氧化石墨烯(GO)、茶多酚石墨烯(TPG)、阿霉素石墨烯(GO-DOX)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的紅外光譜(FT-IR)圖，其橫坐標為波數(shù)、縱坐標為透射率。如圖5c所示，氧化石墨烯和茶多酚石墨烯的FT-IR特征峰均包括：3410cm^-1的羥基O-H伸縮振動峰、1724cm^-1的羧基C＝O伸縮振動峰、1052cm^-1的環(huán)氧基C-O振動峰。此外，相較于氧化石墨烯，茶多酚石墨烯在1724cm^-1和3410cm^-1處的峰強度有所降低，說明了石墨烯加入茶多酚還原后，含氧量有所下降。

請參照圖5d。圖5d為商購阿霉素(DOX)與本實施例的氧化石墨烯(GO)、茶多酚石墨烯(TPG)、阿霉素石墨烯(GO-DOX)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)在pH＝7.4下的ζ電位圖，其中的長條柱分別代表上述的五種材料，縱坐標顯示電位值。如圖5d所示，氧化石墨烯由于表面含有較多的含氧官能團，顯示了較強的負電位(-52.97mV)；使用茶多酚還原后，茶多酚石墨烯的表面含氧官能團減少，負電位提高到-35.57mV。

請參照圖6。圖6a～6e分別為與本實施例的氧化石墨烯(GO)、茶多酚石墨烯(TPG)、阿霉素石墨烯(GO-DOX)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的與商購阿霉素(DOX)親水角圖。如圖6所示，氧化石墨烯和茶多酚石墨烯的親水角分別為37.8°±1.3°和34.8°±0.0°。

實施例二

阿霉素石墨烯(GO-DOX)的制備

步驟1：將1mL 0.5mg/mL的氧化石墨烯(依照前述方法制備)和1mL 200ppm的商購阿霉素，分別溶解于pH 2～11的磷酸緩沖液(PBS)溶液中。

步驟2：負載。將上述兩者在黑暗條件下進行混合，并在37℃、200rpm搖擺的條件下，反應0.5～30小時。

步驟3：分離純化。10000rpm離心30min，再使用PBS洗滌3次直至上清液變成無色。

阿霉素石墨烯的表征

請參照圖3a和3b。圖3a和3b分別為氧化石墨烯(GO)和阿霉素石墨烯(GO-DOX)的掃描電子顯微鏡(SEM)影像。其中，相較于圖3a中所示的氧化石墨烯的表面，圖3b中所示的阿霉素石墨烯的表面發(fā)生了明顯的團聚。

請參照圖4a和4c。圖4a和4c分別為氧化石墨烯(GO)和阿霉素石墨烯(GO-DOX)的原子力顯微鏡(AFM)影像，其顯示了氧化石墨烯和阿霉素石墨烯的三維形貌。如圖所示，當氧化石墨烯載入阿霉素后，鹽酸阿霉素顆粒像種子般灑在了氧化石墨烯的表面，且厚度也有明顯的增加。經(jīng)儀器自帶軟件量測，氧化石墨烯在負載了鹽酸阿霉素后，厚度由1.02±0.07nm增加至16.52±10.87nm。

請參照圖5b。圖5b為商購阿霉素(DOX)與本實施例的阿霉素石墨烯(GO-DOX)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的X射線粉末衍射(XRD)圖，其橫坐標為峰位(即衍射峰的2θ衍射角)、縱坐標為峰高。如圖5b所示，阿霉素的XRD特征峰為2θ＝32°和46°；而氧化石墨烯在負載了阿霉素后，氧化石墨烯的原XRD特征峰2θ＝10°沒有發(fā)生位移，并增加了阿霉素的兩個XRD特征峰2θ＝32°和46°。也就是說，阿霉素石墨烯的XRD特征峰包含2θ＝10°、32°和46°。此外，負載阿霉素后沒有新特征峰的出現(xiàn)，表明了氧化石墨烯和阿霉素之間可能通過簡單的作用力，如π-π作用力、范德華作用力和/或氫鍵作用力，進行物理吸附。

請再次參照圖5c。如圖5c所示，氧化石墨烯(GO)的FT-IR特征峰包括：3410cm^-1的羥基O-H伸縮振動峰、1724cm^-1的羧基C＝O伸縮振動峰、1052cm^-1的環(huán)氧基C-O振動峰。在成功負載了阿霉素而形成阿霉素石墨烯后，除了可觀察到上述的石墨烯特征峰，在1750cm^-1處還顯示了阿霉素的特征峰。

請再次參照圖5d。如圖5d所示，商購鹽酸阿霉素(DOX)帶正電荷，電位為9.86mV；氧化石墨烯(GO)則帶負電荷，電位為-52.97mV。當氧化石墨烯負載阿霉素形成阿霉素石墨烯后，電位由負載前的-52.97mV提高到-16.33mV，表明了阿霉素是通過靜電作用力負載到氧化石墨烯的表面。

請再次參照圖6。如圖6所示，氧化石墨烯(GO)和阿霉素石墨烯(GO-DOX)的親水角分別為37.8°±1.3°和64.9°±0.9°，表明氧化石墨烯在負載了阿霉素后，表面含氧官能團減少，導致親水性降低。

pH值對負載效果的影響

將本實施例的氧化石墨烯和阿霉素分別溶解于不同pH2.0、pH4.0、pH7.4、pH9.0和pH11.0的PBS溶液，避光混合24h后，離心取上清液，采用超高壓液相色譜(UPLC)測量上清液中阿霉素的濃度。并根據(jù)公式1和公式2計算負載效率(E)和負載容量(q_e)：

負載效率(％)＝(W_加入-W_游離)/W_加入×100％--公式1

負載容量(mg/g)＝(W_加入-W_游離)/W_材料×100％--公式2

其中，W_加入為阿霉素的初始濃度、W_游離為上清液中阿霉素的濃度、W_材料為氧化石墨烯的加入量。

請參照圖7a，圖7a繪示pH值對本實施例的氧化石墨烯(GO)的阿霉素負載效果的影響，其橫坐標為溶液的pH值，縱坐標為負載效率以及負載容量。如圖7a所示，過酸(pH2.0)或過堿(pH11.0)的條件均不利于阿霉素的負載；而在pH＝7.4時，氧化石墨烯對阿霉素的負載效率和負載容量都達到最高。

時間對負載效果的影響

將本實施例的氧化石墨烯和阿霉素分別溶解于pH7.4的PBS溶液中，避光混合后，反應10min、20min、30min、1h、1.5h、2h、2.5h、5h、10h、24h和30h，離心取上清液，采用UPLC測量上清液中阿霉素的濃度，并根據(jù)上述公式1和公式2計算負載效率(E)和負載容量(q_e)。

請參照圖8a，圖8a繪示反應時間對本實施例的氧化石墨烯(GO)的阿霉素負載效果的影響，以及氧化石墨烯和阿霉素之間的吸附動力學研究，其橫坐標為反應時間，縱坐標分別為負載效率以及負載容量。如圖8a所示，隨著反應時間的增加，氧化石墨烯對阿霉素的吸附效率和吸附容量都有所增加；其中，吸附效率在反應2min時便達到83.50％，而反應24h后，吸附效率達到95.06％，呈現(xiàn)吸附平衡狀態(tài)。因此，本實施例中，氧化石墨烯負載阿霉素的最佳反應時間為24h。

此外，基于典型的準一級動力學模型(公式3)和準二級動力學模型(公式4)的吸附動力學研究發(fā)現(xiàn)，本實施例的氧化石墨烯具有很高的準一級和準二級相關(guān)系數(shù)(R²均大于0.98)，表明了阿霉素主要是靠化學作用力負載在氧化石墨烯上。

阿霉素初始濃度對負載效果的影響

將本實施例的氧化石墨烯與25ppm、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm、250ppm、400ppm、500ppm、750ppm和800ppm的阿霉素，分別溶解于pH7.4的PBS溶液，避光混合24h后，離心取上清液，采用UPLC測量上清液中阿霉素的濃度，并根據(jù)上述公式1和公式2計算負載效率(E)和負載容量(q_e)。

請參照圖9a，圖9a繪示阿霉素初始濃度對本實施例的氧化石墨烯(GO)的負載效果的影響，以及氧化石墨烯和阿霉素之間的吸附等溫線研究，其橫坐標為阿霉素的濃度，縱坐標分別為負載效率和負載容量。如圖9a所示，隨著阿霉素濃度的增加，本實施例的氧化石墨烯的負載效率逐漸減低、負載容量逐漸升高。其中，在阿霉素濃度為25-250ppm時，氧化石墨烯的負載效率達到98.69％，基本處于平衡狀態(tài)；當阿霉素濃度高于250ppm時，氧化石墨烯的吸附效率有所下降；阿霉素濃度為800ppm時，氧化石墨烯的吸附效率降至45.10％，表明了在此濃度下，氧化石墨烯需要更多的活性位點來容納過多的阿霉素。因此，在本實施例中，等體積的0.5mg/mL的氧化石墨烯復合200ppm的阿霉素，為較佳的混合配比，能達到較高的吸附效率。

此外，如表1所示，基于典型的Langmuir吸附等溫線模型(公式5)和Freundlich吸附等溫線模型(公式6)的吸附等溫線研究發(fā)現(xiàn)，本實施例的氧化石墨烯能符合上述兩種模型(R²均大于0.97)，說明單層吸附和多相吸附均發(fā)生在氧化石墨烯的表面，且氧化石墨烯對阿霉素的最大吸附容量能達到1.289×10⁴mg/g。

表1

pH值和時間對釋放效果的影響

將本實施例的阿霉素氧化石墨烯分別溶解于不同pH的PBS緩沖溶液中，包括pH＝7.4(正常生理pH)，pH＝6.8(癌組織內(nèi)的pH)，pH＝5.0(癌細胞胞漿內(nèi)的pH)，37℃避光混合后，200rpm搖擺反應1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和168h，離心取上清液，采用UPLC測量上清液中阿霉素的濃度。

請參照圖10a，圖10a繪示不同pH值和時間對阿霉素石墨烯(GO-DOX)的釋放效果的影響，其橫坐標為時間(h)，縱坐標為阿霉素的釋放效率(％)。如圖10a所示，本實施例的阿霉素石墨烯具有一定的緩釋能力，釋放效率在6天后基本處于平穩(wěn)。此外，阿霉素石墨烯在168h后在pH＝7.4、pH＝6.8和pH＝5.0的條件下，釋放效率分別達到了9.81％、21.14％和38.72％，pH＝5.0的條件下釋放效率遠遠高于pH＝6.8和pH＝7.4，表明阿霉素石墨烯的釋放與氫離子濃度相關(guān)，阿霉素在癌組織環(huán)境中能更有效的釋放。

實施例三

阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的制備

步驟1：將1mL 0.1mg/mL的茶多酚石墨烯(依照前述方法制備)和1mL 200ppm的商購阿霉素，分別溶解于pH2～11的磷酸緩沖液(PBS)溶液中。

步驟2：負載。將上述兩者在黑暗條件下進行混合，并在37℃、200rpm搖擺的條件下，反應0.5～30小時。

步驟3：分離純化。10000rpm離心30min，再使用PBS洗滌3次直至上清液變成無色。

阿霉素茶多酚石墨烯的表征

請參照圖3c和d。圖3c和d分別為茶多酚石墨烯(TPG)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的掃描電子顯微鏡(SEM)影像。其中，相較于圖13c中所示的茶多酚石墨烯的表面，圖13d中所示的阿霉素茶多酚石墨烯的表面發(fā)生了明顯的團聚。

請參照圖4b和4d。圖4b和4d分別為茶多酚石墨烯(TPG)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的原子力顯微鏡(AFM)影像，其顯示了茶多酚石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯的三維形貌。如圖所示，當茶多酚石墨烯載入阿霉素后，鹽酸阿霉素顆粒像種子般灑在了茶多酚石墨烯的表面，且厚度也有明顯的增加。經(jīng)儀器自帶軟件量測，石墨烯在負載了鹽酸阿霉素后，平面厚度由1.91±0.04nm增加至17.42±6.26nm。

請再次參照圖5b。如圖5b所示，阿霉素(DOX)的XRD特征峰為2θ＝32°和46°；而茶多酚石墨烯在負載了阿霉素后，茶多酚石墨烯的原XRD特征峰2θ＝26°沒有發(fā)生位移，并增加了阿霉素的兩個XRD特征峰2θ＝32°和46°。也就是說，阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的XRD特征峰包含2θ＝26°、32°和46°。且，阿霉素XRD特征峰的相對強度，阿霉素茶多酚石墨烯高于阿霉素石墨烯，表明了茶多酚石墨烯有更高的阿霉素負載量。此外，負載阿霉素后沒有新特征峰的出現(xiàn)，表明了茶多酚石墨烯和阿霉素之間可能通過簡單的作用力進行物理吸附，如π-π作用力、范德華作用力和/或氫鍵作用力。

請再次參照圖5c。如圖5c所示，茶多酚石墨烯的FT-IR特征峰包括：3410cm^-1的羥基O-H伸縮振動峰、1724cm^-1的羧基C＝O伸縮振動峰、1052cm^-1的環(huán)氧基C-O振動峰。在成功負載了阿霉素而形成阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)后，除了可觀察到上述的特征峰外，在1750cm^-1處還顯示了阿霉素的特征峰。

請再次參照圖5d。如圖5d所示，商購鹽酸阿霉素(DOX)帶正電荷，電位為9.86mV；茶多酚石墨烯則帶負電荷，電位為-35.57mV。當茶多酚石墨烯負載阿霉素形成阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)后，電位由負載前的-35.57mV提高到-2.72mV，表明了阿霉素是通過靜電作用力負載到茶多酚石墨烯的表面。

請再次參照圖6。如圖6所示，茶多酚石墨烯(TPG)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的親水角分別為34.8°±0.0°和35.5°±0.0°，兩者的親水角相似，且對比阿霉素石墨烯的親水角(64.9°±0.9°)，阿霉素茶多酚石墨烯顯示了較好的親水性，有利于阿霉素在體液中的滲透及傳遞。

pH值對負載效果的影響

將本實施例的茶多酚石墨烯和阿霉素分別溶解于不同pH2.0、pH4.0、pH7.4、pH9.0和pH11.0的PBS溶液，避光混合24h后，離心取上清液，采用超高壓液相色譜(UPLC)測量上清液中阿霉素的濃度。并根據(jù)前述公式1和公式2計算負載效率(E)和負載容量(q_e)。

請參照圖7b，圖7b繪示pH值對本實施例的茶多酚石墨烯(TPG)的阿霉素負載效果的影響，其橫坐標為溶液的pH值，縱坐標為負載效率以及負載容量。如圖7b所示，過酸(pH2.0)或過堿(pH11.0)的條件均不利于阿霉素的負載；而在pH＝7.4時，氧化石墨烯對阿霉素的負載效率和負載容量都達到最高。

時間對負載效果的影響

將本實施例的茶多酚石墨烯和阿霉素分別溶解于pH7.4的PBS溶液中，避光混合后，反應10min、20min、30min、1h、1.5h、2h、2.5h、5h、10h、24h和30h，離心取上清液，采用UPLC測量上清液中阿霉素的濃度，并根據(jù)前述公式1和公式2計算負載效率(E)和負載容量(q_e)。

請參照圖8b，圖8b繪示反應時間對本實施例的茶多酚石墨烯(TPG)的阿霉素負載效果的影響，以及茶多酚石墨烯和阿霉素之間的吸附動力學研究，其橫坐標為反應時間，縱坐標分別為負載效率以及負載容量。如圖8b所示，隨著反應時間的增加，茶多酚石墨烯對阿霉素的吸附效率和吸附容量都有所增加；其中，吸附效率在反應2min時便高達到94.50％，且在反應10h后，吸附效率達到95.52％，呈現(xiàn)吸附平衡狀態(tài)。因此，本實施例中，茶多酚石墨烯負載阿霉素的最佳反應時間為10h；相較于氧化石墨烯在反應24h后，才達到95.06％的吸附效率，茶多酚石墨烯具有更為顯著的負載效果。

此外，基于前述的準一級動力學模型(公式3)和準二級動力學模型(公式4)的吸附動力學研究發(fā)現(xiàn)，本實施例的茶多酚石墨烯的準二級動力學系數(shù)(R²＝1.000)遠高于準一級系數(shù)(R²＝0.5592)，表明茶多酚石墨烯的負載行為，包括阿霉素和茶多酚石墨烯之間通過電子共享或交換形成的化學吸附，屬于限速步驟。

阿霉素初始濃度對負載效果的影響

將本實施例的茶多酚石墨烯與25ppm、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm、250ppm、400ppm、500ppm、750ppm和800ppm的阿霉素，分別溶解于pH7.4的PBS溶液，避光混合10h后，離心取上清液，采用UPLC測量上清液中阿霉素的濃度，并根據(jù)前述的公式1和公式2計算負載效率(E)和負載容量(q_e)。

請參照圖9b，圖9b繪示阿霉素初始濃度對本實施例的茶多酚石墨烯(TPG)的負載效果的影響，以及茶多酚石墨烯和阿霉素之間的吸附等溫線研究，其橫坐標為阿霉素的濃度，縱坐標分別為負載效率和負載容量。如圖9b所示，隨著阿霉素濃度的增加，本實施例的氧化石墨烯的負載效率逐漸減低、負載容量逐漸升高。其中，在阿霉素濃度為25-250ppm時，茶多酚石墨烯的負載效率達到90.16％，基本處于平衡狀態(tài)；當阿霉素濃度高于250ppm時，茶多酚石墨烯的吸附效率有所下降；阿霉素濃度為800ppm時，茶多酚石墨烯的吸附效率降至44.68％，表明了在此濃度下，茶多酚石墨烯需要更多的活性位點來容納過多的阿霉素。因此，在本實施例中，等體積的0.1mg/mL的茶多酚石墨烯復合200ppm的阿霉素，為較佳的混合配比，能達到較高的吸附效率。

此外，如前述表1所示，基于前述的Langmuir吸附等溫線模型(公式5)和Freundlich吸附等溫線模型(公式6)的吸附等溫線研究發(fā)現(xiàn)，本實施例的茶多酚石墨烯能符合上述兩種模型(R²均大于0.99)，說明單層吸附和多相吸附均發(fā)生在茶多酚石墨烯的表面，且茶多酚石墨烯對阿霉素的最大吸附容量能達到1.293×10⁶mg/g。相較于氧化石墨烯的1.289×10⁴mg/g，茶多酚石墨烯對阿霉素具有更顯著的吸附力，可能是由于茶多酚的插入減少了石墨烯的團聚，使其具有更大的比表面積。

pH值和時間對釋放效果的影響

將本實施例的阿霉素茶多酚石墨烯分別溶解于不同pH的PBS緩沖溶液中，包括pH＝7.4(正常生理pH)，pH＝6.8(癌組織內(nèi)的pH)，pH＝5.0(癌細胞胞漿內(nèi)的pH)，37℃避光混合后，200rpm搖擺反應1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和168h，離心取上清液，采用UPLC測量上清液中阿霉素的濃度。

請參照圖10b，圖10b繪示不同pH值和時間對阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)的釋放效果的影響，其橫坐標為時間(h)，縱坐標為阿霉素的釋放效率(％)。如圖10b所示，本實施例的阿霉素茶多酚石墨烯具有一定的緩釋能力，釋放效率在6天后基本處于平穩(wěn)。此外，阿霉素茶多酚石墨烯在168h后在pH＝7.4、pH＝6.8和pH＝5.0的條件下，釋放效率分別達到了6.49％、11.64％和27.49％。其在pH＝5.0的條件下釋放效率遠遠高于pH＝6.8和pH＝7.4，表明阿霉素石墨烯的釋放與氫離子濃度相關(guān)，阿霉素在癌組織環(huán)境中能更有效的釋放。此外，相較于前述的阿霉素石墨烯的釋放效率(參照圖12a)，阿霉素茶多酚石墨烯的釋放效率較低，說明茶多酚石墨烯與阿霉素之間的作用力強于氧化石墨烯。

實施例四

茶多酚石墨烯對癌細胞的異常增殖能力的抑制

分別將成纖維細胞(L929)和腺樣囊性癌(ACC2)細胞以5×10⁴個細胞/孔的密度接種于96孔板中，在37℃、5％的CO₂濃度下過夜培養(yǎng)。將依照前述方法制備的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯分別配制5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和250μg/mL的水溶液，然后與L929和ACC2細胞分別在37℃、5％CO₂濃度的條件下共培養(yǎng)24h、48h和72h。最后，使用細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測檢測細胞的增殖能力。

請參照圖11，圖11繪示本實施例的氧化石墨烯(GO)和茶多酚石墨烯(TPG)分別對L929和ACC2細胞的存活率的影響，其橫坐標為氧化石墨烯或茶多酚石墨烯的濃度，縱坐標為細胞存活率。如圖11a和11c所示，隨著氧化石墨烯的濃度的增加和培養(yǎng)時間的加長，L929細胞(圖11a)和ACC2細胞(圖11c)的存活率有明顯的下降；尤其，當氧化石墨烯為250μg/mL、與細胞共培養(yǎng)72h時，L929和ACC2的細胞存活率分別降至42％和50％。而如圖11b和11d所示，隨著茶多酚石墨烯的濃度的增加和培養(yǎng)時間的加長，L929細胞(圖11b)的存活率幾乎不受影響，而ACC2(圖11d)的存活率則有明顯的下降；尤其，當茶多酚石墨烯為250μg/mL、與細胞共培養(yǎng)72h時，L929細胞的存活率基本為100％，而ACC2細胞的存活率顯著下降至20％。

上述結(jié)果顯示，氧化石墨烯對L929和ACC2兩種細胞都存在有時間和濃度依賴性；而茶多酚石墨烯則是選擇性的對ACC2癌細胞產(chǎn)生細胞毒性，對L929正常體細胞不具明顯的毒性；此表明了茶多酚石墨烯不但具有良好的生物相容性，且可作為一種具有高度選擇性的綠色抗癌藥物。

須注意的是，本實施例雖以腺樣囊性癌細胞為例，但本發(fā)明不以此為限；本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員均能理解，本發(fā)明的茶多酚石墨烯還可用于抑制其他種類的惡性腫瘤細胞或其他與細胞異常增殖有關(guān)的疾病的細胞的異常增殖。此外，茶多酚還可用于修飾其他具有生物相容性的載體材料，同樣可達到抑制細胞異常增殖的效果。

實施例五

阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯對癌細胞的異常增殖能力的抑制

將腺樣囊性癌(ACC2)細胞以5×10⁴個細胞/孔的密度接種于96孔板中，在37℃、5％的CO₂濃度下過夜培養(yǎng)。將商購鹽酸阿霉素以及依照前述方法制備的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯分別配制為阿霉素的終濃度為1μM的水溶液，然后與ACC2細胞分別在37℃、5％CO₂濃度的條件下共培養(yǎng)24h、48h和72h。最后，使用細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測檢測細胞的增殖能力。

請參照圖12，圖12繪示本實施例的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯對ACC2細胞的存活率的影響，其橫坐標長條柱依序表示作為對照組的等滲PBS、阿霉素(DOX)、阿霉素石墨烯(GO-DOX)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)，縱坐標為ACC2細胞的存活率。如圖12所示，相較于對照組和純阿霉素，使用氧化石墨烯或茶多酚石墨烯作為阿霉素的載體時，ACC2的存活率明顯降低；具體而言，在與阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯共培養(yǎng)24h后，ACC2的細胞存活率分別為90％和89％，48h后為62％和59％，72h后則顯著降低至48％和36％。阿霉素茶多酚石墨烯對ACC2的細胞毒性明顯大于阿霉素石墨烯，可能是因為其較好的水溶性以及穿透性促進了細胞的攝入，進而提高了抑制癌細胞增殖的效果。

阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯對癌細胞的穿透效果

將ACC2細胞以1.0×10⁵的密度接種于24孔板中，在37℃、5％CO₂濃度的條件下過夜培養(yǎng)，使用pH＝7.4的PBS洗滌。將商購鹽酸阿霉素以及本實施例的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯分別配制為阿霉素的終濃度為1μM的水溶液，然后與ACC2細胞共培養(yǎng)10min、30min、1h、2h和4h。最后，將細胞使用PBS洗滌，胰蛋白酶消化，2000rpm離心4min收集細胞，采用細胞流式儀選取2×10⁴個細胞，通過觀察阿霉素本身的紅色熒光來分析阿霉素進入ACC2細胞的情況。

請參照圖13，圖13為本實施例的阿霉素石墨烯(GO-DOX)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)對ACC2細胞的穿透效果的細胞流式圖，其橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)。如圖13所示，在共培養(yǎng)10min后，純阿霉素(DOX)的攝入量僅為2.56％，隨著時間的推移，1h后達到25.42％，4h后也僅僅達到48.95％；當使用氧化石墨烯作為阿霉素的載體時，10min達到5.36％，1h提升到59.37％，4h后基本全部攝入，達到98.51％；而使用茶多酚石墨烯作為阿霉素的載體時，則顯著的加速了細胞對藥物的攝入，10min時為7.50％，1h時就已基本全部攝入，攝入量高達99.83％，遠遠高于對阿霉素石墨烯(59.37％)和純阿霉素(25.42％)的效果。此結(jié)果表明，以茶多酚石墨烯作為藥物載體，可加快藥物對癌細胞的穿透，提升藥物攝入量，進而增強對癌細胞的抑制和治療。

阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯的細胞內(nèi)定位

將ACC2細胞以4×10⁵的密度接種于6孔板的玻片中，在37℃、5％的CO₂濃度下過夜培養(yǎng)。將商購鹽酸阿霉素以及本實施例的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯分別配制為阿霉素的終濃度為5μM的水溶液，以1mL/孔的量與ACC2細胞共培養(yǎng)4h。然后，將細胞使用PBS洗滌三次，再使用4％多聚甲醛在室溫下固定5min。使用PBS洗滌后，使用2μg/mL的4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5min。最后，將玻片置于激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下進行觀察。

觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的時間內(nèi)，與純阿霉素的共培養(yǎng)，大部分的阿霉素集中在細胞質(zhì)，只有極少部分圍繞細胞核，而氧化石墨烯作為載體時，大部分釋放出的阿霉素也富集在細胞質(zhì)中，只有少量進入細胞核，細胞形態(tài)也沒有太明顯的變化；上述兩種情況均較不利于對癌細胞的抑制和治療。然而，當使用茶多酚石墨烯作為載體時，富集在細胞核中的阿霉素顯著增加，且可以明顯觀察到細胞大小的萎縮。由此可知，茶多酚石墨烯是一種高效的藥物載體，可促進藥物富集并進入細胞核中，能有效提升癌細胞的抑制和治療效率。

須注意的是，本實施例雖以腺樣囊性癌細胞為例，但本發(fā)明不以此為限；本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員均能理解，本發(fā)明的阿霉素茶多酚石墨烯還可用于抑制其他種類的惡性腫瘤細胞或其他與細胞異常增殖有關(guān)的疾病的細胞的異常增殖。此外，本實施例雖以負載阿霉素為例，但本發(fā)明不以此為限；本發(fā)明的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯還可依照不同的癌癥類型負載其他癌癥治療藥物或輔助藥物，同樣可達到抑制細胞異常增殖的效果。

實施例六

阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯促進癌細胞凋亡的效果

將腺樣囊性癌(ACC2)細胞以5×10⁵個細胞/孔的密度接種于24孔板中，在37℃、5％的CO₂濃度下過夜培養(yǎng)。將商購鹽酸阿霉素以及本實施例的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯分別配制為阿霉素的終濃度為1μM的水溶液，以1mL/孔的量與ACC2細胞共培養(yǎng)48h。然后，在室溫、暗室條件下使用5μL的Annexin V-FITC和5μL的Propidium Iodide(PI)染色細胞15min。最后，使用細胞流式儀分析ACC2細胞死亡和凋亡的狀況。

請參照圖14，圖14為等滲PBS和本實施例的氧化石墨烯(GO)、茶多酚石墨烯(TPG)、阿霉素石墨烯(GO-DOX)和阿霉素茶多酚石墨烯(TPG-DOX)對ACC2細胞的凋亡促進效果的二維細胞流式圖，其橫縱坐標均為熒光強度，R2區(qū)為壞死細胞，R3區(qū)為晚期凋亡細胞，R4區(qū)為活細胞，R5區(qū)為早期凋亡細胞。如圖14所示，在PBS溶液下ACC2基本100％存活(圖14a)；純氧化石墨烯可使ACC2凋亡，凋亡率達到21.10％(圖14b)；純茶多酚石墨烯可使59.00％的ACC2細胞凋亡，顯示優(yōu)異的抗癌性能(圖14c)；純阿霉素對ACC2的作用，死亡率為38.48％、凋亡率為57.89％(圖14d)。此外，阿霉素石墨烯對ACC2的作用，死亡率為52.61％、凋亡率達到47.39％(圖14e)，表明以氧化石墨烯作為藥物載體時，主要是通過提高細胞的死亡來殺死癌細胞的。而阿霉素茶多酚石墨烯對ACC2的作用，顯示了死亡率為28.06％，凋亡率為71.94％(圖14f)，表明以茶多酚石墨烯作為藥物載體時，主要是通過促進細胞凋亡途徑來殺死癌細胞的。

須注意的是，本實施例雖以腺樣囊性癌細胞為例，但本發(fā)明不以此為限；本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員均能理解，本發(fā)明的阿霉素石墨烯和阿霉素茶多酚石墨烯還可用于促進其他種類的惡性腫瘤細胞或其他與細胞異常增殖有關(guān)的疾病的細胞的死亡和凋亡。此外，本實施例雖以負載阿霉素為例，但本發(fā)明不以此為限；本發(fā)明的氧化石墨烯和茶多酚石墨烯還可依照不同的癌癥類型負載其他癌癥治療藥物或輔助藥物，同樣可達到促進異常增殖細胞的死亡和凋亡的效果。

由上述的多個優(yōu)選實施例可知，本發(fā)明采用茶多酚作為還原劑和功能化試劑來修飾氧化石墨烯，制備茶多酚修飾的還原氧化石墨烯。相較于現(xiàn)有的還原氧化石墨烯，本發(fā)明的茶多酚石墨烯在水溶液和生理條件下都較為穩(wěn)定，水分散性和生物相容性良好，且可選擇性的對癌細胞產(chǎn)生毒性，對正常體細胞則表現(xiàn)出友好的性質(zhì)。此外，利用本發(fā)明的茶多酚石墨烯負載鹽酸阿霉素，可顯著提高阿霉素的對癌細胞的穿透性和細胞核富集量，并能促進癌細胞的細胞凋亡。因此，本發(fā)明在藥物傳遞、癌癥治療領(lǐng)域有廣泛的應用前景。

惟以上所述者，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，當不能以此限定本發(fā)明實施的范圍，即，大凡依本發(fā)明申請專利范圍及發(fā)明說明內(nèi)容所作的簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發(fā)明專利涵蓋的范圍內(nèi)。另外本發(fā)明的任一實施例或申請專利范圍無須達成本發(fā)明所揭露的全部目的或優(yōu)點或特點。此外，摘要部分和標題僅是用來輔助專利文件搜尋之用，并非用來限制本發(fā)明的權(quán)利范圍。