本發(fā)明涉及一種三維打印生物墨水材料的制作方法，尤其涉及一種含有生物細(xì)胞和生長因子的三維打印生物墨水材料的制作方法，屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

三維打印技術(shù)從概念的提出到現(xiàn)在已經(jīng)有30多年的發(fā)展歷史，它是運(yùn)用打印材料，通過逐層堆疊累積的方式來構(gòu)造物體的技術(shù)，又稱增材制造技術(shù)，實(shí)際上是快速成型領(lǐng)域的一種新興技術(shù)，是一種以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，通過逐層打印的方式來構(gòu)造物體的技術(shù)。由于三維打印無需原胚和模具，就能直接根據(jù)計算機(jī)圖形數(shù)據(jù)生成任何形狀的物體，簡化產(chǎn)品的制造程序，縮短產(chǎn)品的研制周期，提高效率并降低成本。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，三維打印的應(yīng)用也逐漸廣泛，而對生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域而言，三維打印技術(shù)可以獲得仿真度更高的醫(yī)療模型、更符合人體工學(xué)的醫(yī)療設(shè)備、應(yīng)用場景更廣泛生物醫(yī)療器械，個性化程度更高的人工組織或器官。人工組織或者器官往往結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由多種不同的細(xì)胞組成，并相互交錯組成功能單元，從而發(fā)揮各種功能。因此，在制作人工組織或器官時，需要考慮將生物細(xì)胞置于仿生度最佳的位置，達(dá)到即時制作即時能使用的要求。

基于生物大分子的水凝膠含水量高，力學(xué)性質(zhì)與軟組織相似，具有良好的生物相容性、輸送養(yǎng)分和排泄代謝物的高效性以及包裹細(xì)胞的強(qiáng)大能力，這些特點(diǎn)使其被廣泛地用于構(gòu)建組織工程支架、藥物緩釋體系等。但作為生物墨水，僅僅有溶劑是不夠的，為了生物細(xì)胞在局部能短時間內(nèi)發(fā)揮生物功能，還需要有各種營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子為其提供物質(zhì)支持和保證。

為了實(shí)現(xiàn)三維打印人工組織器官的即打即用，構(gòu)建多細(xì)胞復(fù)合的功能組織器官單元，簡化構(gòu)建流程，提高構(gòu)建效率，需要設(shè)計配置簡單方便又能滿足上述要求的生物墨水。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有生物打印材料的不足，提供一種由生物細(xì)胞、細(xì)胞生長因子、親水性高分子物質(zhì)及去離子水組成的生物墨水。經(jīng)三維打印后獲得的人工組織或器官具備可發(fā)揮生物效應(yīng)的功能單元。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：這種三維打印生物墨水材料的制作方法，包括如下步驟：

1)在2-4℃環(huán)境下，將細(xì)胞生長因子、親水性高分子物質(zhì)及去離子水依序加入容器；質(zhì)量百分比為去離子水45-75％、親水性高分子物質(zhì)20-50％、細(xì)胞生長因子1-2％；

2)磁力攪拌器攪拌10-20min，得到水凝膠液；

3)再加入經(jīng)計數(shù)的生物細(xì)胞制成懸液。

作為優(yōu)選：步驟1)中，親水性高分子物質(zhì)為：瓊脂糖、海藻酸、透明質(zhì)酸、膠原、甲基纖維素、絲蛋白、角蛋白中的一種或幾種。

作為優(yōu)選：步驟1)中，細(xì)胞生長因子為：神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、骨骼生長因子、造血生長因子、內(nèi)皮生長因子、膠質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、多肽生長因子中的一種或任意幾種。

作為優(yōu)選：步驟3)中，所述生物細(xì)胞為：動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌或細(xì)菌，單獨(dú)凍存在液氮罐中，需要時解凍復(fù)蘇，復(fù)蘇后用PBS洗滌2-4次，離心去除PBS，用水凝膠重懸并計數(shù)。

本發(fā)明具有以下的特點(diǎn)和有益效果：1)生物墨水的水凝膠液所用材料為天然高分子，生物相容性好，降解產(chǎn)物安全無毒，不存在過敏反應(yīng)或者毒性反應(yīng)的潛在危險；2)生物墨水與機(jī)體組織的力學(xué)性質(zhì)相仿，不存在異物感；3)生物墨水在打印過程中，可通過打印參數(shù)的調(diào)節(jié)，控制打印密度和打印形態(tài)，實(shí)現(xiàn)個性化打印；4)生物墨水打印完成后，可在短時間內(nèi)具備生物功能，提高了打印效率；5)本發(fā)明的生物墨水配置過程簡單，降低了操作人員的培訓(xùn)難度。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的再生神經(jīng)橫截面的單位面積軸突數(shù)比較圖；

圖2為實(shí)施例2的再生神經(jīng)橫截面的單位面積軸突數(shù)比較圖；

圖3為實(shí)施例3的再生神經(jīng)橫截面的單位面積軸突數(shù)比較圖；

圖4為實(shí)施例4的再生神經(jīng)橫截面的單位面積軸突數(shù)比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。下述實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

1)水凝膠液的配置：按照質(zhì)量百分比，取透明質(zhì)酸45％，表皮生長因子1％，離子水54％，在2℃環(huán)境下，將上述物質(zhì)依序加入容器，磁力攪拌器攪拌20min。

2)將生物細(xì)胞解凍復(fù)蘇，用PBS洗滌2次，離心去除PBS，用水凝膠重懸并計數(shù)。

3)在水凝膠液中加入經(jīng)計數(shù)的生物細(xì)胞制成懸液。

實(shí)施例2

1)水凝膠液的配置：按照質(zhì)量百分比，取透明質(zhì)酸25％，膠原20％，表皮生長因子1％，離子水54％，在2℃環(huán)境下，將上述物質(zhì)依序加入容器，磁力攪拌器攪拌20min。

2)將生物細(xì)胞解凍復(fù)蘇，用PBS洗滌2次，離心去除PBS，用水凝膠重懸并計數(shù)。

3)在水凝膠液中加入經(jīng)計數(shù)的生物細(xì)胞制成懸液。

實(shí)施例3

1)水凝膠液的配置：按照質(zhì)量百分比，取透明質(zhì)酸25％，膠原20％，表皮生長因子1％，離子水54％，在2℃環(huán)境下，將上述物質(zhì)依序加入容器，磁力攪拌器攪拌20min。

2)將生物細(xì)胞解凍復(fù)蘇，用PBS洗滌3次，離心去除PBS，用水凝膠重懸并計數(shù)。

3)在水凝膠液中加入經(jīng)計數(shù)的生物細(xì)胞制成懸液。

實(shí)施例4

1)水凝膠液的配置：按照質(zhì)量百分比，取甲基纖維素15％，膠原10％，絲蛋白10％,表皮生長因子0.5％，胰島素樣生長因子0.5％，離子水64％，在2℃環(huán)境下，將上述物質(zhì)依序加入容器，磁力攪拌器攪拌15min。

2)將生物細(xì)胞解凍復(fù)蘇，用PBS洗滌3次，離心去除PBS，用水凝膠重懸并計數(shù)。

3)在水凝膠液中加入經(jīng)計數(shù)的生物細(xì)胞制成懸液。

實(shí)施例1-4的三維打印生物墨水性能測試如下：

實(shí)施例1所配置的生物墨水打印于神經(jīng)導(dǎo)管后，用于修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損，與普通導(dǎo)管及自體神經(jīng)修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損6周后的比較如圖1所示。對再生神經(jīng)橫截面的單位面積軸突數(shù)進(jìn)行計數(shù)并比較。圖1各組再生神經(jīng)橫截面軸突計數(shù)值均存在明顯差異(P<0.05)。實(shí)施例1所配置的生物墨水打印于神經(jīng)導(dǎo)管后，用于修復(fù)神經(jīng)缺損，所得到的再生神經(jīng)橫截面軸突計數(shù)值雖不及自體神經(jīng)組(P<0.05)，但要優(yōu)于與單純導(dǎo)管組(P<0.05)。

實(shí)施例2所配置的生物墨水打印于神經(jīng)導(dǎo)管后，用于修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損，與普通導(dǎo)管及自體神經(jīng)修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損6周后的比較如圖2所示。對再生神經(jīng)橫截面的單位面積軸突數(shù)進(jìn)行計數(shù)并比較。圖2各組再生神經(jīng)橫截面軸突計數(shù)值均存在明顯差異(P<0.05)。實(shí)施例2所配置的生物墨水打印于神經(jīng)導(dǎo)管后，用于修復(fù)神經(jīng)缺損，所得到的再生神經(jīng)橫截面軸突計數(shù)值雖不及自體神經(jīng)組(P<0.05)，但要優(yōu)于與單純導(dǎo)管組(P<0.05)。

實(shí)施例3所配置的生物墨水打印于神經(jīng)導(dǎo)管后，用于修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損，與普通導(dǎo)管及自體神經(jīng)修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損6周后的比較如圖3所示。對再生神經(jīng)橫截面的單位面積軸突數(shù)進(jìn)行計數(shù)并比較。圖3各組再生神經(jīng)橫截面軸突計數(shù)值均存在明顯差異(P<0.05)。實(shí)施例3所配置的生物墨水打印于神經(jīng)導(dǎo)管后，用于修復(fù)神經(jīng)缺損，所得到的再生神經(jīng)橫截面軸突計數(shù)值雖不及自體神經(jīng)組(P<0.05)，但要優(yōu)于與單純導(dǎo)管組(P<0.05)。

實(shí)施例4所配置的生物墨水打印于神經(jīng)導(dǎo)管后，用于修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損，與普通導(dǎo)管及自體神經(jīng)修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損6周后的比較如圖4所示。對再生神經(jīng)橫截面的單位面積軸突數(shù)進(jìn)行計數(shù)并比較。圖4各組再生神經(jīng)橫截面軸突計數(shù)值均存在明顯差異(P<0.05)。實(shí)施例4所配置的生物墨水打印于神經(jīng)導(dǎo)管后，用于修復(fù)神經(jīng)缺損，所得到的再生神經(jīng)橫截面軸突計數(shù)值雖不及自體神經(jīng)組(P<0.05)，但要優(yōu)于與單純導(dǎo)管組(P<0.05)。