技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療糖尿病的組合物及其應(yīng)用方法,更詳細(xì)地講是關(guān)于化合物伽馬－氨基丁酸，伽馬－氨基丁酸能分子(GABAergic)的單獨(dú)使用或者是與胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)腸泌素(incretin)及其類似物(如exendin-4)的聯(lián)合使用,以促進(jìn)胰島β-細(xì)胞的增殖，抑制胰島炎癥反應(yīng)，降低胰島β-細(xì)胞的自身免疫并且增強(qiáng)調(diào)節(jié)T-細(xì)胞的功能,并能對(duì)糖尿病患者進(jìn)行預(yù)防和治療的用于治療糖尿病的組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病是引起人類死亡的主要病因之一。I型糖尿病是糖尿病的一種主要類型，特點(diǎn)是發(fā)病年齡早和胰島β-細(xì)胞的自身免疫性破壞，導(dǎo)致胰島素分泌不足和必需依賴外源性胰島素治療。凋亡是I型糖尿病患者胰島β-細(xì)胞死亡的主要形式。在正常情況下，胰島β-細(xì)胞質(zhì)量的維持是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，其增加和減少依賴于β-細(xì)胞存活(如β-細(xì)胞增殖和再生)和β-細(xì)胞死亡(如β-細(xì)胞凋亡和壞死)的比率，可以控制機(jī)體血糖水平在一個(gè)很窄的生理范圍內(nèi)。I型糖尿病病人的胰島β-細(xì)胞持續(xù)受到自身免疫的破壞。β-細(xì)胞凋亡是由于自身免疫破壞造成的，涉及朗格漢斯胰島中T-細(xì)胞的浸潤。胰島β-細(xì)胞的漸進(jìn)性破壞主要是由于胰島中淋巴細(xì)胞的浸潤，細(xì)胞壞死導(dǎo)致胰島素分泌的缺乏。在這個(gè)自身免疫過程中由巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子，包括IL-1β，TNF-α和IFN-γ，是引起β-細(xì)胞破壞的主要分子。在疾病早期，胰島β-細(xì)胞依靠代償作用克服由自身免疫引起的破壞作用，這種代償機(jī)制在維持機(jī)體血糖方面起重要作用。然而當(dāng)β-細(xì)胞死亡的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于β-細(xì)胞生長的速度時(shí)，β-細(xì)胞質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降，胰島素分泌不足導(dǎo)致糖尿病性高血糖發(fā)生。通常胰島素療法是治療I型糖尿病的的主要手段，但是外源胰島素并不能根治I型糖尿病，因?yàn)楹茈y實(shí)現(xiàn)一種血糖敏感性的胰島素給予方式來調(diào)整胰島素的用量使血糖控制在一個(gè)狹窄的生理范圍內(nèi)，外源胰島素不能阻止疾病的進(jìn)展并最終引起糖尿病性并發(fā)癥的發(fā)生。對(duì)于人類I型糖尿病患者的治療，目前除了胰島素注射和胰島移植外尚無其它有效治療方法。胰島素注射治療不能終止I型糖尿病病情的發(fā)展也不能阻滯其并發(fā)癥的最終出現(xiàn)；胰腺胰島移植雖是一種有效的治療方法，但是該方法由于人類胰島來源較少，使胰島移植的供體來源有限，對(duì)于胰島移植的個(gè)體還需要給予免疫抑制劑，受試者需要終身使用免疫抑制劑并且通常在胰島移植后1－2年要再次做移植手術(shù)。目前的治療方法均無有效手段可以逆轉(zhuǎn)I型糖尿病。

II型糖尿病的發(fā)病主要是由于患者自身產(chǎn)生的胰島素不足以維持體內(nèi)的糖代謝平衡。通常是由于胰島素抵抗和β-細(xì)胞代償缺陷造成。在正常的生理?xiàng)l件下，腸泌素激素在維持機(jī)體血糖中起重要作用。重要的腸泌素激素包括GLP-1和腸抑胃肽(血糖依賴性促胰島素分泌激素或者GIP)。GLP-1由小腸L-細(xì)胞在營養(yǎng)物攝取時(shí)分泌。GLP-1以一種血糖依賴性的方式促進(jìn)胰腺胰島β-細(xì)胞再生/增殖和抑制β-細(xì)胞凋亡。GLP-1也可以增加罹患Ⅰ型和II型糖尿病個(gè)體的胰島素分泌及降低血糖。GLP-1的長效類似物exendin-4(Ex4)是一種長效高效的GLP-1的受體競(jìng)爭(zhēng)物。對(duì)II型糖尿病十分有效，但對(duì)于I型糖尿病的療效則微乎其微。因此，研發(fā)具有預(yù)防和治療糖尿病作用的組合物及其應(yīng)用方法是消除和修復(fù)糖尿病病因的關(guān)鍵技術(shù)和迫切需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種能夠消除上述缺點(diǎn)，具有藥性對(duì)癥、修復(fù)性強(qiáng)、方法簡單、單獨(dú)用藥，也可聯(lián)合用藥、可防可治、互惠增強(qiáng)效果好、治愈率高、可集預(yù)防和治療為一體等特點(diǎn)的用于治療糖尿病的組合物及其應(yīng)用。開創(chuàng)了治療糖尿病的新方法和途徑。這個(gè)新方法和途徑是通過施用化合物伽馬－氨基丁酸及其組合物伽馬－氨基丁酸能分子，或者施用組合物的形式即：伽馬－氨基丁酸能分子與腸泌素激素分子的聯(lián)合使用。伽馬－氨基丁酸能分子包括伽馬－氨基丁酸及其變異體或者衍生物、或者是伽馬－氨基丁酸受體激動(dòng)劑，可有效保護(hù)β-細(xì)胞的作用和抑制胰島β-細(xì)胞自身免疫的作用，以使胰腺胰島的β-細(xì)胞不被破壞。選用腸泌素激素包含至少以下多肽中的任一個(gè)：GLP-1，GLP-1的抗DPP-Ⅳ形式(或者DPP-Ⅳ抑制劑)，EX4，GIP，或者是它們的變異體或者衍生物，以有效地促進(jìn)胰島β-細(xì)胞的生長和刺激內(nèi)源性伽馬－氨基丁酸的合成和分泌來達(dá)到對(duì)胰腺胰島β-細(xì)胞的保護(hù)及增強(qiáng)胰島β-細(xì)胞質(zhì)量?？梢源龠M(jìn)β-細(xì)胞的生長和抑制凋亡，促進(jìn)免疫性耐受和阻滯自身免疫。尤其是當(dāng)組合使用時(shí)，包括施用一個(gè)伽馬－氨基丁酸能分子(作為β-細(xì)胞生長因子和自身免疫抑制劑)和一個(gè)腸泌素激素分子(作為β-細(xì)胞生長因子和伽馬－氨基丁酸輔助物)的組合使用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)I型糖尿病的預(yù)防和治療。具體地舉例，伽馬－氨基丁酸能分子與腸泌素的聯(lián)合使用、如伽馬－氨基丁酸與GLP-1/Ex4的聯(lián)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)I型糖尿病的預(yù)防和治療。

本發(fā)明的用于治療糖尿病的組合物，其主要成分構(gòu)成是由足以能抑制β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)β細(xì)胞再生并控制胰島自身免疫的有效給予劑量的化合物伽馬－氨基丁酸(或?yàn)棣?氨基丁酸)及其組合物的伽馬－氨基丁酸能分子，或者是上述分子在一個(gè)配藥學(xué)上可以接受的鹽溶液中。其中γ-氨基丁酸能分子包括伽馬－氨基丁酸及其變異體或者衍生物、或者是伽馬－氨基丁酸受體激動(dòng)劑；所述的組分繼而包含足以能抑制β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)β細(xì)胞再生的有效治療劑量的腸泌素激素(incretin)，其可選自胰高血糖素樣肽(GLP-1)、exendin-4(EX4)多肽，或者變異體或衍生物?；蛘呤峭瑫r(shí)給予伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素激素，其中，

所述的腸泌素激素是有效治療劑量的腸泌素激素(incretin)，其可選自胰高血糖素樣肽(GLP-1)、exendin-4(EX4)多肽，GIP多肽或者是以上所述多肽的變異體或者衍生物，該變異體選自GLP-1(7-37)OH,或GLP-1(7-36)氨?；?1,一個(gè)DPPIV抵抗型GLP-1及其片段和變異體，或DPPIV抵抗型GLP-1或GLP-1的融合蛋白。

更具體地說，所述的γ-氨基丁酸能分子是γ-氨基丁酸，或者是GAD65，或者是GAD67，或者是γ-氨基丁酸的變異體或者衍生物，或者是γ-氨基丁酸受體激動(dòng)劑。伽馬－氨基丁酸能分子是伽馬－氨基丁酸，或者是GAD65，或者是GAD67，或者是伽馬－氨基丁酸受體激動(dòng)劑或及其變異體或者衍生物。所述的γ-氨基丁酸是天然存在形式或者變異體或者衍生物，該變異體或者衍生物包含化學(xué)修飾或者對(duì)γ-氨基丁酸氨基基團(tuán)通過用一個(gè)化學(xué)基團(tuán)的替換，也包含但不限于蛋白融合形式或者化學(xué)耦合，或者化學(xué)修飾或者對(duì)伽馬－氨基丁酸氨基基團(tuán)的替換，該變異體或者衍生物包含化學(xué)修飾或者對(duì)伽馬－氨基丁酸氨基基團(tuán)通過用一個(gè)化學(xué)基團(tuán)的替換。所述的化學(xué)耦合劑是配藥學(xué)上可用的物質(zhì)；N-末端修飾或者替換是通過用一個(gè)化學(xué)基團(tuán)替換。其中，化學(xué)基團(tuán)包含但不限于被一個(gè)鹵素基團(tuán)置換，或者一個(gè)烷基基團(tuán)置換，或者一個(gè)環(huán)烷基基團(tuán)置換，或者一個(gè)甲基基團(tuán)替換，或者一個(gè)烷氧基基團(tuán)置換，或者一個(gè)芳香族基團(tuán)置換，或者一個(gè)雜苯基團(tuán)置換，或者一個(gè)類似化學(xué)基團(tuán)替換。所述的伽馬-氨基丁酸融合蛋白是伽馬-氨基丁酸分子與一個(gè)清蛋白分子、或者一個(gè)IgG分子的融合；所述的融合蛋白是GLP-1或者Ex4分子與一個(gè)清蛋白或者一個(gè)IgG分子融合。其中所述的清蛋白分子即GLP-1-白蛋白是人清蛋白?；蛘?，其中所述的IgG是人IgG，并且人的IgG選自人IgG1、或人IgG2、或人IgG3或者人IgG4；尤其首選IgG2和IgG4。所述的腸泌素激素多肽是天然存在的形式或者一個(gè)融合蛋白的形式，或者化學(xué)耦合型，或者化學(xué)修飾或者氨基酸替換。

所述的DPPIV抵抗型GLP-1可選用GLP-1A8X，其中X是任何除A以外的氨基酸，可任意選自GLP-1A8G,N-乙?；?GLP-1,N-甲基化-GLP-1(N-me-GLP-1),α-甲基化-GLP-1(α-me-GLP-1),脫氨基-GLP-1(desamino-GLP-1)及咪唑-乳酸置換的GLP-1(imi-GLP-1),或者所述的N-端修飾的GLP-1如與脂肪酸鏈的共價(jià)結(jié)合，或所述的GLP-1融合蛋白包含與IgG Fc或白蛋白的融合蛋白形成GLP-1-IgGFc或GLP-1-白蛋白。

所述的GLP-1多肽變異體包括與序列號(hào)NO.1的GLP-1序列有約70％-95％的同源性；Ex4多肽變異體包括與序列號(hào)NO.2的Ex4序列有約70％-95％的同源性。

所述的伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素激素是單獨(dú)的分子，或者融合成為一個(gè)單一的伽馬－氨基丁酸能分子/腸泌素激素融合肽分子。也就是說，所述的伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素是單獨(dú)的個(gè)體、或是由伽馬－氨基丁酸能分子(如伽馬－氨基丁酸)和腸泌素GLP-1或Ex4化合耦連形成的一個(gè)伽馬－氨基丁酸能融合物、或者是該伽馬－氨基丁酸能融合物的變量或者衍生物。上述的組分還包括一個(gè)輔助劑，其中該輔助劑是一種佐劑。

本發(fā)明的藥用組合物是由含上述的組分組成，是由可藥用載體搭載，用于1型或II型糖尿病的治療以及糖尿病的預(yù)防。它可通過經(jīng)由局部、或口服、或氣霧劑、或腹膜內(nèi)注射、或靜脈注射或肌肉注射的方式施用。上述的組合物的給予方式包括肌肉注射其編碼的核苷酸，其中該核苷酸載體是一個(gè)非病毒載體，或是一個(gè)病毒性的載體，或者用于細(xì)菌或者真核表達(dá)的載體。

用于治療糖尿病的組合物的應(yīng)用是由伽馬－氨基丁酸能分子給予劑量是0.01-10mmol/kg，腸泌素激素0.02to 1000nmol/kg(如伽馬－氨基丁酸:GLP-1/Ex4)或者是0.002-2mg/kg的伽馬－氨基丁酸能分子和0.2-1000nmol/kg的腸泌素激素等配制而成的藥用載體搭載；其中所述的伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素激素最好選自伽馬－氨基丁酸和GLP-1/Ex4。該組合物可選用基因治療的方式給予，分別編碼組合物中復(fù)合物的DNA的使用量是1μg/kg體重至10μg/kg體重；DNA疫苗的合適劑量是0.1至1000μg DNA。

本發(fā)明揭示了一種新的治療I型糖尿病的組合物及其應(yīng)用方法，其作用機(jī)理包括兩方面內(nèi)容：促進(jìn)胰島β-細(xì)胞再生和同時(shí)抑制胰島β-細(xì)胞自身免疫。其組合物的重要的部分是伽馬－氨基丁酸能分子或者是伽馬－氨基丁酸能分子結(jié)合腸泌素激素。所述的伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素謹(jǐn)以伽馬－氨基丁酸和GLP-1為例。伽馬－氨基丁酸是一種重要的內(nèi)源性氨基酸，由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(GAD)作用生成。伽馬－氨基丁酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用已被廣泛研究。伽馬－氨基丁酸通過激活它的受體，即A、B及C型伽馬－氨基丁酸受體發(fā)揮作用。伽馬－氨基丁酸一直被認(rèn)為是一種重要的位于哺乳動(dòng)物大腦中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，但是在特定情況下，伽馬-氨基丁酸也可以通過A型伽馬-氨基丁酸受體產(chǎn)生興奮性作用。在大腦的發(fā)育和神經(jīng)元成熟過程中，伽馬－氨基丁酸作為一種營養(yǎng)性因子，調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖，遷移和分化。

在胰腺中，伽馬-氨基丁酸由胰島β-細(xì)胞分泌，作為自分泌或者旁分泌調(diào)節(jié)因子通過其位于α-細(xì)胞和β-細(xì)胞的受體發(fā)揮作用。詳述之，伽馬-氨基丁酸通過激活A(yù)型伽馬－氨基丁酸受體來抑制α-細(xì)胞胰高血糖素的分泌。伽馬－氨基丁酸能同時(shí)調(diào)節(jié)胰島β-細(xì)胞的代謝和胰島素分泌。伽馬－氨基丁酸的受體也在T-淋巴細(xì)胞中表達(dá)，為伽馬－氨基丁酸有可能直接作用于T-細(xì)胞提供了基礎(chǔ)。使用伽馬－氨基丁酸能抑制T-細(xì)胞的促炎作用和預(yù)防NOD 1型糖尿病模型小鼠的發(fā)病。在一種大鼠模型中，伽馬－氨基丁酸對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病模型發(fā)病有一定預(yù)防作用。然而，先前公開的技術(shù)并沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)伽馬－氨基丁酸可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生糖尿病患者的高血糖血癥，即有實(shí)際意義上的治療作用。

預(yù)防和治療在概念上是完全不同的。預(yù)防是指可以降低疾病發(fā)生的任何一種方法。預(yù)防可以在一定程度上阻止疾病的發(fā)生。而且，實(shí)施預(yù)防的過程常常是在一種疾病出現(xiàn)明顯癥狀之前。在自身免疫性疾病中，如1型糖尿病是由于胰島β-細(xì)胞的自身免疫性破壞和繼發(fā)的胰島素不足及高血糖血癥，如果阻止了自身免疫的發(fā)展也即可以有效地阻止1型糖尿病的發(fā)生。相比較，治療是一種能夠解除疾病、有時(shí)能達(dá)到治愈的方法。在多數(shù)情況下，有效的治療是一個(gè)減輕或解除病癥的過程。在1型糖尿病發(fā)生時(shí)，患者體內(nèi)已有超過70-80％的胰島β-細(xì)胞被破壞。由此可見，僅僅抑制胰島的自身免疫不足以緩解疾病的進(jìn)程。顯然在給予特異的免疫抑制劑的同時(shí)，需要一種能夠促進(jìn)胰島β-細(xì)胞再生的方案用于替換或更新已經(jīng)受損的胰島β-細(xì)胞。應(yīng)用不同的小鼠糖尿病模型作為對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療的范例，本發(fā)明揭示了一種預(yù)防和治療糖尿病的組合物和應(yīng)用方法。本發(fā)明的重點(diǎn)是治療即逆轉(zhuǎn)1型糖尿病的病情?？梢灶A(yù)見，一個(gè)有效的治療方法也可能是一種有效的預(yù)防方法。相反，一種有效的預(yù)防方法不一定能夠達(dá)到治療效果。本發(fā)明首次系統(tǒng)揭示了伽馬－氨基丁酸對(duì)已經(jīng)發(fā)生糖尿病性高血糖的糖尿病個(gè)體的治療作用。

本發(fā)明的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示伽馬－氨基丁酸不僅阻止了多次低劑量STZ(MLDS)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的高血糖，更重要的是伽馬－氨基丁酸組合物療法完全逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)病的MLDS誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠的糖尿病性高血糖。通過體外實(shí)驗(yàn)顯示伽馬－氨基丁酸對(duì)MLDS誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠的預(yù)防和治療作用是通過促進(jìn)胰島β-細(xì)胞生長、抑制β-細(xì)胞死亡、增強(qiáng)β-細(xì)胞質(zhì)量及抑制自身免疫和/或炎癥對(duì)β-細(xì)胞的攻擊而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明披露的數(shù)據(jù)還顯示，伽馬－氨基丁酸可以預(yù)防自身免疫性NOD小鼠的糖尿病性高血糖。這與降低NOD小鼠胰島內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤，增加β-細(xì)胞質(zhì)量和提高循環(huán)胰島素水平有關(guān)。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，伽馬－氨基丁酸可以明顯減低MLDS和NOD小鼠糖尿病的發(fā)生，同時(shí)，伽馬－氨基丁酸可以完全逆轉(zhuǎn)由藥物誘導(dǎo)的MLDS小鼠的糖尿病的發(fā)生。但是伽馬－氨基丁酸對(duì)已經(jīng)發(fā)病的自身免疫性NOD小鼠糖尿病的逆轉(zhuǎn)作用雖然顯著但是是暫時(shí)性的。事實(shí)上，這個(gè)暫時(shí)性的逆轉(zhuǎn)作用會(huì)對(duì)人類糖尿病患者有著值得矚目的益處。需要強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明揭示了一個(gè)幾乎完全有效的應(yīng)用方案，即當(dāng)伽馬－氨基丁酸與腸泌素GLP-1/Ex4結(jié)合使用時(shí)可以克服單獨(dú)使用伽馬－氨基丁酸治療時(shí)存在的暫時(shí)性逆轉(zhuǎn)作用的缺陷。正如本發(fā)明提供的實(shí)施例所示，伽馬－氨基丁酸和GLP-1結(jié)合使用可以完全逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)病的NOD 1型糖尿病。值得注意的是，伽馬－氨基丁酸對(duì)db/db 2型糖尿病小鼠的血糖水平?jīng)]有顯著作用(數(shù)據(jù)未提供)。總之，本發(fā)明開拓了開發(fā)1型糖尿病新的治療途徑。概括地，本發(fā)明揭示了一種基于伽馬－氨基丁酸能分子或者是伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素GLP-1/Ex4聯(lián)合用藥對(duì)1型糖尿病有效治療的作用。以前的技術(shù)沒有揭示伽馬-氨基丁酸能分子對(duì)糖尿病逆轉(zhuǎn)的治療作用，也沒有揭示伽馬-氨基丁酸能分子與腸泌素的聯(lián)合使用和這種組合物的作用。

本發(fā)明提供了一種預(yù)防和治療糖尿病的組合物及其應(yīng)用方法。本發(fā)明的組合物和應(yīng)用方法可以促進(jìn)β-細(xì)胞的生長和抑制凋亡，促進(jìn)免疫性耐受和阻滯自身免疫。本發(fā)明所述的組合物是伽馬－氨基丁酸能分子。本發(fā)明所述的組合物也包括一個(gè)伽馬－氨基丁酸能分子(作為β-細(xì)胞生長因子和自身免疫抑制劑)和一個(gè)腸泌素激素分子(作為β-細(xì)胞生長因子和伽馬－氨基丁酸輔助物)的組合使用。這兩個(gè)組分作為一個(gè)組合物用于1型或者是2型糖尿病的預(yù)防和治療。但該療法尤其是對(duì)1型糖尿病的預(yù)防和治療極其有效。伽馬－氨基丁酸能分子包括伽馬－氨基丁酸及其變異體或者衍生物、或者是伽馬－氨基丁酸受體激動(dòng)劑。其功效包括可以有效保護(hù)β-細(xì)胞的作用和抑制胰島β-細(xì)胞自身免疫的作用，以使胰腺胰島的β-細(xì)胞不被破壞。腸泌素激素包含至少以下多肽中的任一個(gè)：GLP-1，GLP-1的抗DPP-IV形式或DPP-IV抑制劑，EX4，GIP，或是它們的變異體或衍生物，以有效地促進(jìn)胰島β-細(xì)胞的生長和刺激內(nèi)源性伽馬－氨基丁酸的合成和分泌來達(dá)到對(duì)胰腺胰島β-細(xì)胞的保護(hù)及增強(qiáng)胰島β-細(xì)胞質(zhì)量。依據(jù)本發(fā)明的一方面，所述組合物的組分能抑制致糖尿病性CD8+T-細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)。所述組合物的組分包含伽馬－氨基丁酸能分子或者是伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素GLP-1/EX4多肽的組合。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述組合物是一個(gè)伽馬－氨基丁酸能分子與一個(gè)腸泌素激素的融合蛋白。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述組合物包含一個(gè)伽馬－氨基丁酸能分子和GLP-1融合蛋白或者EX4融合蛋白或者前述的腸泌素激素。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述組合物包含編碼-伽馬－氨基丁酸能分子，其變異體或者衍生物，或前述的腸泌素激素或者它們的融合蛋白核酸序列。本發(fā)明的一方面，所述組合物用于受試者的1型糖尿病的預(yù)防和治療。所述組合物包含一個(gè)伽馬－氨基丁酸能分子，來源于伽馬－氨基丁酸、伽馬－氨基丁酸前體GAD65、或者GAD67、或者A型伽馬－氨基丁酸受體激動(dòng)劑或者是它們的變異體或者衍生物；或包含一個(gè)GLP-1或者EX4分子或者其類似物或者變異體或者其的片段。本發(fā)明的一方面，所述組合物的核酸序列編碼一個(gè)伽馬－氨基丁酸能分子的前體，如伽馬－氨基丁酸，伽馬－氨基丁酸前體GAD65或者GAD67，伽馬－氨基丁酸受體激動(dòng)劑或者其變異體或者衍生物；和一個(gè)前述的腸泌素激素分子GLP-1或者EX4或者變異體或者其的片段或者前述腸泌素激素的融合蛋白。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述方法用于1型糖尿病患者的預(yù)防和治療，包含施予患者一個(gè)有效治療量的所述組合物，可以增加患者β-細(xì)胞增殖，降低β-細(xì)胞凋亡和抑制β-細(xì)胞自身免疫性。本發(fā)明的一方面，揭示用以預(yù)防和治療1型糖尿病的化合物的藥劑的制備。本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)也可通過實(shí)施例的描述進(jìn)一步體現(xiàn)。

附圖說明

圖1伽馬－氨基丁酸處理阻止了MLDS CD1小鼠的糖尿病高血糖的發(fā)生。A)每天給予伽馬－氨基丁酸阻止了小鼠的糖尿病高血糖的發(fā)生；B)對(duì)照組小鼠在MLDS注射后7天完全發(fā)生糖尿病高血糖，而伽馬－氨基丁酸處理的STZ小鼠沒有發(fā)生高血糖；C)伽馬－氨基丁酸對(duì)正常小鼠(Crl)的糖耐量沒有影響，未處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐受不良，而伽馬－氨基丁酸處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐受改善，水平與虛線所示的STZ注射前的糖耐量實(shí)驗(yàn)相近；D)伽馬－氨基丁酸處理沒有改變胰島素敏感性；E)伽馬－氨基丁酸顯著改善了MLDS小鼠的胰高血糖素耐受；F)伽馬－氨基丁酸顯著改善了MLDS小鼠的胰高血糖素耐受；G)伽馬-氨基丁酸處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出循環(huán)胰島素水平提高；H)伽馬-氨基丁酸使循環(huán)胰高血糖素水平下降；I)伽馬-氨基丁酸導(dǎo)致胰島素/胰高血糖素比例升高。

圖2伽馬－氨基丁酸明顯改善MLDS小鼠的糖尿病癥狀。A)伽馬－氨基丁酸處理對(duì)體重的影響在未處理組和處理組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；B)伽馬－氨基丁酸處理對(duì)進(jìn)食量的影響在處理與未處理組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；C)伽馬－氨基丁酸處理對(duì)體重指數(shù)的影響在未處理組和處理組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；D)伽馬－氨基丁酸明顯改善了糖尿病的多飲癥狀；E)伽馬－氨基丁酸明顯改善了糖尿病的多尿癥狀。

圖3伽馬－氨基丁酸增進(jìn)MLDS小鼠的胰島β-細(xì)胞質(zhì)量及降低循環(huán)中的炎癥因子。A)免疫組織化學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLDS小鼠的β-細(xì)胞被大面積破壞，而伽馬－氨基丁酸處理的β-細(xì)胞質(zhì)量與正常對(duì)照鼠(Crl)沒有明顯區(qū)別；B)伽馬－氨基丁酸處理顯著逆轉(zhuǎn)了β-細(xì)胞質(zhì)量；C)伽馬－氨基丁酸處理明顯降低了α-細(xì)胞的質(zhì)量；D)伽馬－氨基丁酸處理對(duì)細(xì)胞因子IL-6在2組間沒有顯著差異；E)伽馬－氨基丁酸處理對(duì)Th2細(xì)胞因子IL-10沒有顯著影響；F)伽馬－氨基丁酸使促炎癥細(xì)胞因子IL-1β含量明顯降低；G)伽馬－氨基丁酸處理使MLDS小鼠中的腫瘤壞死因子TNF-α明顯降低；H)伽馬－氨基丁酸明顯降低了循環(huán)中的炎癥因子IL-12；I)伽馬－氨基丁酸明顯降低了循環(huán)中的炎癥因子TNF-γ。

圖4伽馬－氨基丁酸逆轉(zhuǎn)藥物誘導(dǎo)的MLDS糖尿病性高血糖，改善糖耐受及提高循環(huán)胰島素水平。A)伽馬－氨基丁酸使已經(jīng)發(fā)病的NLDS小鼠血糖水平開始下降，注射后74天，小鼠血糖水平恢復(fù)到幾近正常的范圍內(nèi)；B)葡萄糖耐量也基本和正常小鼠一致；C)經(jīng)過伽馬－氨基丁酸治療，MLDS小鼠的糖尿病被完全逆轉(zhuǎn)。D)胰島組織化學(xué)的研究結(jié)果顯示正常的對(duì)照組小鼠；E)未處理MLDS小鼠的β-細(xì)胞被廣泛破壞，胰島被大量的胰島α-細(xì)胞填充，周圍可見大量的淋巴細(xì)胞；F)伽馬－氨基丁酸處理MLDS小鼠表現(xiàn)基本正常的胰島形態(tài)并顯著保存了β-細(xì)胞質(zhì)量和降低了α-細(xì)胞質(zhì)量；G)伽馬－氨基丁酸處理小鼠的β-細(xì)胞質(zhì)量明顯提高；H)處理組的α-細(xì)胞質(zhì)量降低；I)處理組循環(huán)胰島素水平升高；J)處理組循環(huán)胰高血糖素水平下降；K)處理組循環(huán)胰高血糖素與胰島素的比值也顯著下降。

圖5伽馬－氨基丁酸治療能完全逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的經(jīng)STZ誘導(dǎo)的MLDS糖尿病。A)伽馬－氨基丁酸治療的第7天，IP伽馬TT的檢測(cè)結(jié)果顯示葡萄糖耐量已經(jīng)顯著改善；B)MLDS小鼠經(jīng)伽馬－氨基丁酸注射后2周后檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)見有改善；C)MLDS小鼠經(jīng)伽馬－氨基丁酸注射8周后檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)都見有改善；D)注射后顯示飲水量明顯降低表明代謝狀態(tài)的正?；籈)顯示體重沒有發(fā)生變化；F)注射后顯示排尿量明顯減少，也佐證MLDS小鼠糖尿病的逆轉(zhuǎn)。

圖6伽馬－氨基丁酸阻止和預(yù)防了NOD糖尿病模型小鼠的糖尿病發(fā)生。A)胰島組織化學(xué)分析顯示對(duì)照PBS-NOD小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的胰島炎，大約90％的胰島區(qū)域都被淋巴細(xì)胞所占據(jù)；B)伽馬－氨基丁酸處理的NOD小鼠中>70％的胰島表現(xiàn)為正常形態(tài)且沒有淋巴細(xì)胞浸潤；C)淋巴細(xì)胞只占到胰島面積的20-30％，被影響的胰島也多是周邊的，也未見嚴(yán)重的胰島炎；D)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示治療的NOD小鼠的β-細(xì)胞凋亡下降；E)18周齡后，未處理NOD小鼠發(fā)展出嚴(yán)重的高血糖血癥，但是伽馬－氨基丁酸處理的NOD小鼠仍保持較低的血糖水平；F)伽馬－氨基丁酸治療的小鼠保持相對(duì)穩(wěn)定的血糖，未見糖尿病癥狀；G)伽馬－氨基丁酸治療的小鼠保持近乎正常的葡萄糖耐量。H)伽馬-氨基丁酸治療的小鼠循環(huán)C-肽降低；I)未經(jīng)伽馬-氨基丁酸治療的小鼠保持信號(hào)胰高血糖素升高：J)伽馬－氨基丁酸療法顯著提高胰島素/胰高血糖素比例，提示伽馬－氨基丁酸能顯著阻止NOD小鼠發(fā)展為嚴(yán)重的糖尿病性高血糖。

圖7顯示伽馬－氨基丁酸對(duì)已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠的逆轉(zhuǎn)作用。A)伽馬－氨基丁酸顯著降低NOD小鼠的血糖并保持低血糖水平近2周。之后伽馬－氨基丁酸處理小鼠的血糖開始上升并最終出現(xiàn)高血糖。B)伽馬－氨基丁酸處理小鼠未見嚴(yán)重的癥狀，處理組攝食量顯著降低；C)飲水量也顯著降低；D)排尿量也顯著降低：E)伽馬－氨基丁酸療法顯著改善已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠的代謝狀態(tài)。

圖8伽馬－氨基丁酸通過抑制CD8+T-細(xì)胞介導(dǎo)的胰島損害，阻止了TCR-NOD小鼠的糖尿病發(fā)生。A)伽馬－氨基丁酸處理完全阻止了8.3-TCR NOD小鼠的糖尿病性高血糖的發(fā)展；B)胰島組織學(xué)研究顯示PBS處理的糖尿病模型小鼠有嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞浸潤胰腺胰島；C)而伽馬－氨基丁酸療法顯著阻止了這個(gè)過程；D－E)伽馬－氨基丁酸處理小鼠的胰島數(shù)量和質(zhì)量都被大幅度逆轉(zhuǎn)和提高，提示伽馬－氨基丁酸可以抑制CE8+細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的致糖尿病作用。

圖9伽馬－氨基丁酸能保留TCR-NOD小鼠的胰島素和GAD65/67含量。對(duì)TCR轉(zhuǎn)基因的NOD小鼠的胰腺進(jìn)行GAD染色。結(jié)果顯示在正常鼠胰島β-細(xì)胞中高表達(dá)GAD65(上)；在所有未處理的發(fā)生糖尿病高血糖的NOD小鼠中，整個(gè)胰腺均未檢測(cè)到GAD65(中)，而在伽馬－氨基丁酸處理的小鼠中，胰島β-細(xì)胞質(zhì)量提高并與高含量GAD65相關(guān)(下)。

圖10伽馬－氨基丁酸刺激β-細(xì)胞增殖及胰島素的分泌。A)伽馬－氨基丁酸(100μM)處理提高了3H-胸苷嵌入到分泌胰島素的INS-1細(xì)胞中的水平；B-C)其嵌入過程以一種時(shí)間依賴性的方式進(jìn)行，提示與細(xì)胞有絲分裂檢測(cè)結(jié)果相一致；D)伽馬－氨基丁酸以劑量依賴性的方式刺激INS-1胰島細(xì)胞分泌胰島素，提示伽馬－氨基丁酸促進(jìn)胰島β-細(xì)胞增加并能預(yù)防和逆轉(zhuǎn)I型糖尿病模型的糖尿病。

圖11給已經(jīng)發(fā)生糖尿病的動(dòng)物模型每天聯(lián)合使用伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4，可以增強(qiáng)已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，達(dá)到了完全逆轉(zhuǎn)糖尿病的目的。

具體實(shí)施方式

結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容：

如圖1所示，由MLDS(i.p.40mg/kg BW，連續(xù)4天)在小鼠誘導(dǎo)的糖尿病模型可以被每天注射伽馬－氨基丁酸的治療所阻斷。MLDS嚙齒類模型是常用的1型糖尿病模型，在MLDS模型中由于STZ破壞了胰島β-細(xì)胞導(dǎo)致胰島素不足。在一定程度上，T-細(xì)胞介導(dǎo)的β-細(xì)胞炎癥(胰島炎)也在MLDS誘導(dǎo)的糖尿病高血糖模型中見到。然而，單次高劑量(如200-250mg/kg BW)給予STZ不一定會(huì)引起胰島炎，因?yàn)檫@時(shí)的胰島β-細(xì)胞會(huì)被很快地破壞掉。所以，MLDS是一個(gè)β-細(xì)胞損傷模型，有一定的胰島炎，但不是一個(gè)理想的自身免疫疾病模型。每天腹腔內(nèi)給予伽馬－氨基丁酸(2mg/鼠)阻止了MLDS CD1小鼠的糖尿病高血糖的發(fā)展(圖1A)。在目前的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)照小鼠在MLDS注射后7天100％(8/8)發(fā)生糖尿病高血糖，但是伽馬-氨基丁酸處理的STZ小鼠只有1只發(fā)生嚴(yán)重的高血糖，這也使整組的血糖水平較給藥前有輕微的提高(圖1A)。伽馬－氨基丁酸對(duì)正常小鼠的糖耐量沒有影響，檢測(cè)的是STZ注射前7天的腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)。當(dāng)未處理MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐受不良時(shí)，伽馬-氨基丁酸處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐受改善，水平與紅線所示的STZ注射前的IPGTT相近(圖1B，1C)。伽馬－氨基丁酸治療雖然沒有改變胰島素敏感性(圖1D)，但是顯著改善了MLDS小鼠的胰高血糖素耐受(圖1E,1F)。這些結(jié)果提示伽馬－氨基丁酸優(yōu)先作用于胰島素生成部位而不是外周的胰島素作用部位。伽馬－氨基丁酸處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出循環(huán)胰島素水平提高(圖1G)和血液胰高血糖素水平下降(圖1H)，導(dǎo)致胰島素/胰高血糖素比例升高(圖1I)?？偟膩碚f，每天注射伽馬－氨基丁酸阻止了糖尿病高血糖的發(fā)生，并在STZ注射后的53天內(nèi)MLDS小鼠始終維持在正常糖耐量水平。伽馬－氨基丁酸治療對(duì)體重和進(jìn)食量的影響在未處理組和伽馬－氨基丁酸組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A-C)，但是伽馬－氨基丁酸明顯改善了糖尿病癥狀，如多尿和多飲(圖2D,2E)。以上結(jié)果也被進(jìn)一步證實(shí)，如生理鹽水處理MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的病癥，而伽馬－氨基丁酸處理組在整個(gè)飼養(yǎng)過程中沒有任何一只小鼠發(fā)生糖尿病性病癥。為了確認(rèn)伽馬－氨基丁酸阻止糖尿病高血糖發(fā)生和提高循環(huán)胰島素水平及降低胰高血糖素水平的機(jī)制，我們做了MLDS小鼠胰腺的免疫組織化學(xué)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未處理MLDS小鼠的β-細(xì)胞被大面積破壞，而剩下的胰島被大量的胰島α-細(xì)胞填充(圖3A)。然而，伽馬－氨基丁酸治療相比未處理MLDS小鼠顯著逆轉(zhuǎn)β-細(xì)胞質(zhì)量，并明顯降低α-細(xì)胞質(zhì)量(圖A-C)。伽馬－氨基丁酸處理的MLDS小鼠的β-細(xì)胞逆轉(zhuǎn)與胰島炎顯著下降有關(guān)，利用HE染色可評(píng)價(jià)胰島中浸潤的淋巴細(xì)胞(結(jié)果未標(biāo)出)。考慮到細(xì)胞因子在自身免疫性糖尿病中起重要作用，我們接下來檢測(cè)了伽馬－氨基丁酸處理和未處理MLDS小鼠的循環(huán)細(xì)胞因子水平。血清學(xué)檢測(cè)顯示IL-6和Th2細(xì)胞因子IL-10在2組間沒有顯著差異(DE)，促炎因子IL-1β(F)和TNF-α在伽馬－氨基丁酸處理的MLDS小鼠中明顯降低。伽馬－氨基丁酸療法也明顯降低了循環(huán)中炎癥因子IL-12(H)和INF-γ(I)的水平。這些結(jié)果提示伽馬－氨基丁酸通過阻斷炎癥因子達(dá)到對(duì)MLDS小鼠的抗炎作用，并且通過降低胰島的免疫細(xì)胞浸潤阻止MLDS誘導(dǎo)的糖尿病發(fā)生。為了觀察伽馬－氨基丁酸是否可以逆轉(zhuǎn)糖尿病，我們每天給予已經(jīng)發(fā)病的NLDS小鼠(血糖>30mM)一次伽馬－氨基丁酸。顯然，在伽馬－氨基丁酸注射后幾天就看到血糖水平開始下降(圖4A)。在觀察期內(nèi)血糖水平穩(wěn)步降低伴隨葡萄糖耐量的改善。在每天注射伽馬－氨基丁酸后74天，血糖水平恢復(fù)到幾近正常的范圍內(nèi)(圖4A)，葡萄糖耐量也基本和正常小鼠一致(圖4B)，說明經(jīng)過2個(gè)多月的伽馬－氨基丁酸治療，MLDS小鼠的糖尿病被完全逆轉(zhuǎn)。利用胰島組織化學(xué)來研究伽馬－氨基丁酸是否對(duì)已經(jīng)發(fā)病的糖尿病小鼠的胰島有保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組小鼠(圖4D)相比，未處理MLDS小鼠的β-細(xì)胞被廣泛破壞，而剩下的胰島被大量的胰島α-細(xì)胞填充，周圍可見大量的淋巴細(xì)胞(圖4E)。相反，伽馬－氨基丁酸處理MLDS小鼠表現(xiàn)基本正常的胰島形態(tài)并顯著保存了β-細(xì)胞質(zhì)量和降低了α-細(xì)胞質(zhì)量(圖4F-H)。而且，伽馬－氨基丁酸處理的MLDS小鼠的胰島中很少見到淋巴細(xì)胞(圖4F)。伽馬－氨基丁酸處理小鼠的β-細(xì)胞質(zhì)量提高和α-細(xì)胞質(zhì)量降低與循環(huán)胰島素水平升高(圖4I)和循環(huán)胰高血糖素水平下降(圖4J)相關(guān)。這些結(jié)果提示伽馬－氨基丁酸逆轉(zhuǎn)MLDS小鼠糖尿病的作用與減輕胰島炎癥，這與伽馬－氨基丁酸增加β-細(xì)胞質(zhì)量和增強(qiáng)β-細(xì)胞功能提高有關(guān)。伽馬-氨基丁酸對(duì)MLDS小鼠的治療是速效的，這在經(jīng)伽馬-氨基丁酸治療的MLDS小鼠的葡萄糖耐量改善中得到證實(shí)。在伽馬－氨基丁酸注射后的第7天，IPGTT的檢測(cè)結(jié)果顯示葡萄糖耐量已經(jīng)顯著改善(圖5A，5A’)。MLDS小鼠經(jīng)伽馬-氨基丁酸注射后2周和8周的所有時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)都見有穩(wěn)定改善的葡萄糖耐量(圖5B,5C)。代謝實(shí)驗(yàn)中代謝狀態(tài)的正?；部梢宰糇CMLDS小鼠糖尿病的逆轉(zhuǎn)(圖5D-5F)。這些結(jié)果提示伽馬－氨基丁酸阻止和逆轉(zhuǎn)NLDS誘導(dǎo)的小鼠糖尿病性高血糖可能是通過其擴(kuò)大β-細(xì)胞質(zhì)量和抑制β-細(xì)胞自身免疫的雙重作用有關(guān)。考慮到MLDS不是一個(gè)自身免疫性疾病和MLDS誘導(dǎo)的糖尿病性高血糖可能是因?yàn)樗幬镏苯訉?duì)β-細(xì)胞的毒性作用引起β-細(xì)胞凋亡和壞死，我們利用NOD小鼠觀察伽馬－氨基丁酸對(duì)糖尿病的阻止和治療作用。因?yàn)镹OD小鼠自發(fā)自身免疫型糖尿病，在組織化學(xué)，血清學(xué)和臨床癥狀上與人類1型糖尿病相似。為了觀察伽馬－氨基丁酸對(duì)NOD小鼠糖尿病發(fā)展的作用，5周齡小鼠開始每天給予腹腔內(nèi)注射伽馬－氨基丁酸，PBS作為對(duì)照。對(duì)未出現(xiàn)明顯糖尿病性高血糖的13周齡的小鼠做胰島組織化學(xué)分析，顯示對(duì)照PBS-NOD小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的胰島炎，胰島炎評(píng)分結(jié)果是僅有10％的胰島表現(xiàn)正常形態(tài)，而>70％的胰島有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤，其中20％的胰島有嚴(yán)重的胰島炎，大約90％的胰島區(qū)域都被淋巴細(xì)胞所占據(jù)(圖6A)。相反，伽馬－氨基丁酸處理的NOD小鼠中>70％的胰島表現(xiàn)為正常形態(tài)且沒有淋巴細(xì)胞浸潤(圖6B)；在該組中也未見嚴(yán)重的胰島炎，被影響的胰島也多是周邊的，并且只有15％的胰島發(fā)生胰島炎，即淋巴細(xì)胞只占到胰島面積的20-30％(圖6C)。這些結(jié)果顯示伽馬－氨基丁酸有抗炎作用，阻止了NOD小鼠的胰島炎發(fā)展。利用抗-caspase-3抗體的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，伽馬－氨基丁酸處理NOD小鼠的β-細(xì)胞凋亡下降(圖6D)。18周齡后，未處理NOD小鼠發(fā)展出嚴(yán)重的高血糖血癥，但是伽馬－氨基丁酸處理的NOD小鼠仍保持較低的血糖水平(圖6E)。在這個(gè)年齡之后，生理鹽水處理的NOD小鼠的高血糖水平也就超出了檢測(cè)范圍(圖6G，紅箭頭所示)。這些非處理NOD小鼠發(fā)展糖耐受不良(圖6F，6G)，伴隨循環(huán)C-肽降低和信號(hào)胰高血糖素升高(圖6I)。另外，這些非處理NOD小鼠表現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀需要必須每天給予胰島素來維持生命。相反，伽馬－氨基丁酸的治療小鼠保持相對(duì)穩(wěn)定的血糖(圖6E)，伽馬－氨基丁酸治療的小鼠呈現(xiàn)正常的形態(tài)學(xué)，并未見糖尿病癥狀和近乎正常的葡萄糖耐量(圖6F,6G)。循環(huán)C-肽和循環(huán)胰高血糖素水平接近它們低齡時(shí)(5周齡)的水平(圖6E，6F)。伽馬－氨基丁酸療法顯著提高胰島素/胰高血糖素比例(圖6J)。這些結(jié)果提示伽馬－氨基丁酸能顯著阻止NOD小鼠發(fā)展為嚴(yán)重的糖尿病性高血糖。為了探討伽馬－氨基丁酸是否對(duì)已經(jīng)發(fā)病的NOD小鼠有作用，將已經(jīng)發(fā)生糖尿病性高血糖的NOD小鼠分為2組，分別給予伽馬－氨基丁酸和PBS。如圖所示(圖7A)，PBS處理NOD小鼠的血糖水平在飼養(yǎng)期內(nèi)持續(xù)增加，但是伽馬－氨基丁酸處理NOD小鼠在開始治療后血糖水平很快就降低、并保持在一個(gè)較低的水平。PBS-NOD小鼠的血糖水平已經(jīng)超出檢測(cè)范圍(圖7，如紅色箭頭所示)，如果不是每天給予胰島素的話，小鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的癥狀并導(dǎo)致死亡。相反，伽馬－氨基丁酸顯著降低NOD小鼠的血糖并保持低血糖水平近2周。之后伽馬－氨基丁酸處理小鼠的血糖開始上升并最終出現(xiàn)高血糖。然而，伽馬－氨基丁酸處理小鼠未見嚴(yán)重的癥狀。伽馬－氨基丁酸療法顯著改善已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠的代謝狀態(tài)(圖7B-E)。這些結(jié)果提示單獨(dú)伽馬－氨基丁酸對(duì)已經(jīng)存在的NOD小鼠的高血糖的逆轉(zhuǎn)作用是顯著的但時(shí)間持續(xù)性上而言是暫時(shí)性的。但是，在整個(gè)試驗(yàn)過程中伽馬－氨基丁酸對(duì)糖尿病癥狀的減輕作用是明顯而持續(xù)的。我們繼而用TCR NOD小鼠來研究伽馬-氨基丁酸對(duì)T細(xì)胞功能的潛在作用。8.3-TCRNOD小鼠是一種嚴(yán)重的1型糖尿病模型，通常在其11周齡時(shí)發(fā)生糖尿病性高血糖。NOD小鼠的自身免疫性糖尿病是由T淋巴細(xì)胞破壞胰腺β-細(xì)胞引起的。CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是最初引起糖尿病中β-細(xì)胞損傷的原因。這個(gè)過程起始于Fas-依賴方式的β-細(xì)胞死亡過程。8.3-TCR NOD小鼠的單克隆T細(xì)胞存在T細(xì)胞受體(8.3-TCR)，以TCRs為代表，從NOD小鼠的早期胰島炎損傷部位繁殖的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。以前的研究顯示致糖尿病型CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是典型的參與自身免疫型糖尿病起始的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。與生理鹽水處理小鼠相比，伽馬－氨基丁酸療法完全阻止了8.3-TCR NOD小鼠的糖尿病性高血糖的發(fā)展(圖8A)。胰島組織學(xué)研究顯示PBS處理小鼠有嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞浸潤胰腺胰島(圖8B)，而伽馬－氨基丁酸療法顯著阻止了這個(gè)過程。伽馬－氨基丁酸處理小鼠的胰島數(shù)量和質(zhì)量都被大幅度逆轉(zhuǎn)和提高(圖8D，8E)。這些數(shù)據(jù)提示伽馬－氨基丁酸可以抑制CE8+細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的致糖尿病作用。GAD65被認(rèn)為是引起1型糖尿病發(fā)病的主要抗原?；谫ゑR－氨基丁酸對(duì)糖尿病模型糖尿病發(fā)展中的保護(hù)作用，我們假設(shè)，伽馬－氨基丁酸合成的限速酶GAD作為伽馬－氨基丁酸的前體在調(diào)節(jié)胰島功能中起重要作用。為了確定伽馬－氨基丁酸是否對(duì)GAD65的表達(dá)水平有影響，我們對(duì)TCR轉(zhuǎn)基因的NOD小鼠的胰腺進(jìn)行GAD染色。結(jié)果顯示在糖尿病發(fā)病前，胰島β-細(xì)胞中高表達(dá)GAD65(圖9上)；相反，在所有未處理的發(fā)生糖尿病高血糖的NOD小鼠中，整個(gè)胰腺均未檢測(cè)到GAD65(圖9中)，而在伽馬－氨基丁酸處理的小鼠中，胰島β-細(xì)胞質(zhì)量提高并與高含量GAD65相關(guān)(圖9下)。這些結(jié)果說明內(nèi)源性GAD65的表達(dá)水平與胰島β-細(xì)胞質(zhì)量呈正相關(guān)。這些結(jié)果揭示在正常情況下，內(nèi)源性伽馬－氨基丁酸是重要的調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞功能的因子。這些動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)清楚地顯示-伽馬－氨基丁酸對(duì)1型糖尿病的預(yù)防和治療作用可能是通過兩種方式：自身免疫調(diào)節(jié)(例如特異性地抑制致糖尿病性T細(xì)胞)和胰島β-細(xì)胞增殖和再生。為了確認(rèn)伽馬－氨基丁酸是否確實(shí)促進(jìn)β-細(xì)胞生長，體外試驗(yàn)采用胰島素分泌性β-細(xì)胞系INS-1。伽馬－氨基丁酸(100μM)處理提高了³H-胸苷嵌入到分泌胰島素的INS-1細(xì)胞中(圖10A)，嵌入過程以一種時(shí)間依賴性的方式進(jìn)行。這些結(jié)果與分離細(xì)胞有絲分裂檢測(cè)結(jié)果是一致的(圖10B,10C)。另外，伽馬－氨基丁酸以劑量依賴性的方式刺激INS-1胰島細(xì)胞分泌胰島素(圖10D)。這些結(jié)果與我們所做的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，-伽馬－氨基丁酸促進(jìn)胰島β-細(xì)胞增加并能預(yù)防和逆轉(zhuǎn)1型糖尿病模型的糖尿病。我們的實(shí)驗(yàn)表明，在糖尿病性高血糖發(fā)生后伽馬－氨基丁酸的單獨(dú)治療是不能完全逆轉(zhuǎn)NOD小鼠的病癥的。考慮到絕大部分病人在診斷為I型糖尿病時(shí)已經(jīng)有超過70％的胰島β-細(xì)胞遭到破壞，因此，單純運(yùn)用胰島自身免疫抑制藥物的治療方案是不足以完全逆轉(zhuǎn)疾病的。我們以此設(shè)計(jì)了一種能夠使β-細(xì)胞再生和自身免疫抑制得以同時(shí)發(fā)生的組合應(yīng)用方案，以達(dá)到對(duì)糖尿病的全面逆轉(zhuǎn)。如圖所示，給已經(jīng)發(fā)生糖尿病的模型每天注射伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4，可以明顯提高治療效果，此時(shí)的患病率顯著低于伽馬－氨基丁酸單獨(dú)治療組(圖11)。所以，同時(shí)給予伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4可以完全逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD的糖尿病。在NOD小鼠中，這種聯(lián)合應(yīng)用的效果與伽馬－氨基丁酸或者GLP-1/EX4單獨(dú)應(yīng)用結(jié)果相比較有著非常顯著的優(yōu)點(diǎn)(圖7A,圖11)。其不單是伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4效果的疊加，正如前文中提到的GLP-1/EX4對(duì)NOD的糖尿病發(fā)生幾乎是沒有作用的。而伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4的聯(lián)合使用能達(dá)到一種獨(dú)特的增強(qiáng)效果。

體外實(shí)驗(yàn)利用GLP-1分泌和/或胰島素分泌細(xì)胞，結(jié)果顯示腸源細(xì)胞STC-1合成和分泌GLP-1受到伽馬－氨基丁酸的調(diào)節(jié)，而β-細(xì)胞合成和釋放伽馬－氨基丁酸的作用又受到GLP-1的調(diào)節(jié)。這些分析的特異性通過包括使用伽馬－氨基丁酸受體拮抗劑或者GLP-1受體拮抗劑得到確定。GLP-1/EX4對(duì)伽馬-氨基丁酸合成和釋放的調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。胰島β-細(xì)胞GLP-1受體的阻斷通過GLP-1/EX4對(duì)伽馬－氨基丁酸合成和分泌的作用而減輕，提示GLP-1/EX4影響胰島β-細(xì)胞伽馬－氨基丁酸合成和分泌是通過激活β-細(xì)胞上GLP-1受體發(fā)揮作用的。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所示的GLP-1/EX4和伽馬－氨基丁酸的協(xié)同作用可能提供了一種體內(nèi)機(jī)制，GLP-1/EX4和伽馬－氨基丁酸分別激活各自的活性系統(tǒng)并最終引起互惠的“正性-反饋-環(huán)”樣作用。聯(lián)合使用伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素激素治療的機(jī)理在我們的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均非常明確地得到了證明。所以，本發(fā)明提供了一種特殊的組合藥和方法用于1型糖尿病患者的預(yù)防和治療。本組合物用于急需治療的患者，能促進(jìn)β-細(xì)胞的增殖并降低β-細(xì)胞的凋亡和控制特殊免疫，最終提升β-細(xì)胞質(zhì)量以及增強(qiáng)β-細(xì)胞功能和促進(jìn)胰島素分泌。本組合物包括一個(gè)伽馬－氨基丁酸能分子和一個(gè)腸泌素激素。伽馬－氨基丁酸能分子包括伽馬－氨基丁酸或者它的變異體或者衍生物或者它的前體，或者伽馬－氨基丁酸受體拮抗劑，可以有效保護(hù)β-細(xì)胞和抑制自身免疫，使胰腺胰島細(xì)胞不再被破壞。伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4的共同作用所引起的增強(qiáng)效應(yīng)能產(chǎn)生其各自單獨(dú)作用而無法達(dá)到的效果。因?yàn)镚LP-1/EX4對(duì)1型糖尿病是幾乎沒有療效的，因此，這種聯(lián)合應(yīng)用伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4而增強(qiáng)的生物效應(yīng)也非簡單的“1+1＝2”的疊加。這種同時(shí)發(fā)生的伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4的協(xié)同作用對(duì)分別調(diào)節(jié)內(nèi)源性伽馬－氨基丁酸和GLP-1的合成及分泌顯然起到一個(gè)互惠和效果倍增的作用。所以本發(fā)明對(duì)1型糖尿病個(gè)體的胰腺胰島β-細(xì)胞有很好的保護(hù)和擴(kuò)增作用。因此，對(duì)于患有I型糖尿病的患者同時(shí)給予伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4能對(duì)其胰島β-細(xì)胞施加獨(dú)特的保護(hù)和取得功能增強(qiáng)的效果。本發(fā)明的一個(gè)具體化體現(xiàn)是，組合物包含伽馬－氨基丁酸和配制其的鹽溶液。本發(fā)明另一個(gè)具體化體現(xiàn)是組合物包含伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4多肽。其中所述的，可以通過多種不同的化合物的組成來完成，包括伽馬－氨基丁酸/GLP-1多肽或者伽馬－氨基丁酸前體GAD65/67和GLP-1或者它的類似物如EX4或DPP-Ⅳ抑制劑。發(fā)明的另一個(gè)具體化體現(xiàn)是，腸泌素激素至少包括下列多肽中的任一個(gè)：GLP-1,GLP-1的抗DPP4型(或者DPP-Ⅳ抑制劑)，EX4，GIP，他們的變異體或者衍生物，以使有效地阻止β-細(xì)胞死亡和促進(jìn)胰島β-細(xì)胞增殖和再生及抑制β-細(xì)胞自身免疫性。本發(fā)明的另一個(gè)具體化體現(xiàn)是，治療性組合物含伽馬－氨基丁酸能分子和GLP-1或GLP-1樣腸泌素,能有效地增加β-細(xì)胞質(zhì)量、增強(qiáng)β-細(xì)胞功能，同時(shí)又能特異性地抑制致糖尿病的T－細(xì)胞依賴的胰島β-細(xì)胞的自身免疫，從而有效地預(yù)防并逆轉(zhuǎn)胰島β-細(xì)胞在I型糖尿病發(fā)展過程中受到的破壞。本發(fā)明的另一個(gè)具體化體現(xiàn)是，治療性組合物能抑制致糖尿病性T-細(xì)胞依賴性對(duì)胰島β-細(xì)胞的免疫破壞。所述的致糖尿病性T-細(xì)胞是CD8+T-細(xì)胞。目前已知在I型糖尿病患者中，持續(xù)的T-細(xì)胞依賴性對(duì)胰島β-細(xì)胞的特異性攻擊引起1型糖尿病患者的β-細(xì)胞破壞和減少繼而發(fā)生糖尿病性高血糖。伽馬－氨基丁酸能作用主要是通過激活伽馬－氨基丁酸受體而實(shí)現(xiàn)的。在胰腺胰島中，伽馬－氨基丁酸是由β-細(xì)胞特異合成的，而伽馬－氨基丁酸受體在β-細(xì)胞和α-細(xì)胞中均有表達(dá)的。重要的是伽馬－氨基丁酸受體在T-淋巴細(xì)胞中也有表達(dá),這解釋了為什么伽馬－氨基丁酸能抑制T-細(xì)胞自身免疫的一個(gè)重要機(jī)制。GLP-1受體主要在胰島β-細(xì)胞中表達(dá)，在腸和腦中也有一定的表達(dá)。盡管未見GLP-1受體在T-淋巴細(xì)胞的報(bào)道，GLP-1對(duì)T-淋巴細(xì)胞的潛在作用很可能是通過調(diào)節(jié)胰島β-細(xì)胞的伽馬－氨基丁酸受體生成和分泌或者是通過周圍GLP-1敏感性組織的作用而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的另一個(gè)具體化體現(xiàn)是，組合物的組分可以全都以合適的載體及核酸序列的形式提供。相關(guān)核酸序列可以在組合物中以DNA載體的形式提供。通過注射DNA載體，組合物中的相關(guān)核酸序列可以在被注射個(gè)體中通過細(xì)胞機(jī)制被表達(dá)。質(zhì)粒的核酸序列編碼一個(gè)或者多個(gè)多肽可以誘導(dǎo)伽馬－氨基丁酸能分子和GLP-1的作用，用于提高胰島β-細(xì)胞的功能和耐受，以及抑制自身免疫的識(shí)別。根據(jù)質(zhì)粒編碼伽馬－氨基丁酸和GLP-1分子或編碼一個(gè)伽馬－氨基丁酸前體GAD65/67和一個(gè)腸泌素激素GLP-1或者EX4。本發(fā)明的伽馬－氨基丁酸能分子包括伽馬－氨基丁酸，GAD65/67和伽馬－氨基丁酸受體激動(dòng)劑。伽馬－氨基丁酸能分子的融合形式，如伽馬－氨基丁酸與清蛋白或者其他化學(xué)配體融合來發(fā)揮伽馬－氨基丁酸能的作用，也是可行的。根據(jù)發(fā)明，編碼腸泌素激素的質(zhì)粒包括至少以下多肽中的一個(gè)：GLP-1，GLP-1(7-37)OH或者GLP-1(7-36)氨?；?，以及GLP-1的抗DPP4形式(或DPP-Ⅳ抑制劑)，EX4,GIP,它們的變異體或者衍生物，可以有效地促進(jìn)胰島β-細(xì)胞的生長和刺激內(nèi)源性伽馬－氨基丁酸的合成和分泌，最終提高胰腺胰島細(xì)胞的質(zhì)量與功能。本發(fā)明中，組合物中腸泌素激素多肽包括活性GLP-1分子和IgG重鏈恒定區(qū)(GLP-1/IgG-Fc)。GLP-1與IgG-Fc分子以融合蛋白形式形成一個(gè)新的分子，同時(shí)擁有增強(qiáng)的GLP-1作用和IgG-Fc分子的優(yōu)勢(shì)，如增加配體親和力和免疫耐受性。GLP-1多肽是天然的或者DPP-Ⅳ抵抗的。IgG是人源或者鼠源的。一個(gè)鼠IgG是IgG1。人IgG是來源于IgG1，IgG2，IgG3或者IgGE或者IgGM。GLP-1多肽可能是天然序列的變異體或者一個(gè)片段。GLP-1多肽可能是GLP-1(7-37)OH或者GLP-1(7-36)氨?；＿@樣的GLP-1/EX4融合蛋白可以與一個(gè)人白蛋白或者其他化學(xué)配體融合來延長GLP-1/EX4或者它的變異體或者衍生物在循環(huán)中的半衰期，以提高GLP-1的作用。

實(shí)驗(yàn)技術(shù)描述本發(fā)明還提供了在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中用到的方法。CD1小鼠，NOD小鼠和轉(zhuǎn)基因TCR NOD小鼠飼養(yǎng)在圣米高醫(yī)院動(dòng)物部，恒溫，每天12小時(shí)光照，自由飲水飲食(正常飲食)。小鼠每天腹腔注射2mg/鼠伽馬－氨基丁酸，使其循環(huán)濃度達(dá)到100－200μM，PBS作為對(duì)照。在60天的試驗(yàn)期內(nèi)每天都要給予藥物處理。伽馬－氨基丁酸和PBS處理后1周，腹腔內(nèi)注射低劑量鏈脲霉素(streptozotocin，STZ，Sigma，40mg/kg BW)連續(xù)5天。STZ注射后每3天從尾靜脈取血檢測(cè)血糖觀察高血糖發(fā)展，儀器為Ascensia的血糖儀。STZ誘導(dǎo)且伽馬－氨基丁酸未處理的發(fā)生嚴(yán)重糖尿病小鼠分為2組：一組開始腹腔給予2mg的伽馬－氨基丁酸，而另一組給予PBS。處理持續(xù)75天。NOD小鼠的處理除了不給予STZ外與CD1小鼠處理相似。NOD小鼠是自發(fā)性自身免疫性1型糖尿病模型。TCR轉(zhuǎn)基因8.3-NOD小鼠是重癥自發(fā)性自身免疫性1型糖尿病模型。腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(Intra-peritoneal Glucose tolerance test，IPGTT)：在處理前，處理后1周，3周，5周，和處死前動(dòng)物檢測(cè)IPGTT。IPGTT檢測(cè)，小鼠禁食過夜約15h，腹腔注射1.5g糖/kg BW。尾靜脈取血，注射后0，10，20，30，60，90和120分檢測(cè)血糖。胰島素，胰高血糖素耐量實(shí)驗(yàn)(Insulin/glucagon tolerance assays):ITT實(shí)驗(yàn)小鼠不需要禁食，腹腔注射2.5unit胰島素/kg BW。尾靜脈取血，注射后0，20，30，40，60，90和120分檢測(cè)血糖。胰高血糖素耐量實(shí)驗(yàn)(GTT)的小鼠禁食15h，腹腔注射50ng胰高血糖素/g BW。尾靜脈取血，注射后0，10，20，30，60，90和120分檢測(cè)血糖。代謝檢測(cè)：在給予伽馬－氨基丁酸和PBS前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)在代謝籠中檢測(cè)小鼠進(jìn)食量，飲水量和尿量。為了檢測(cè)脂質(zhì)分布，分離并稱重腹腔內(nèi)脂墊，腹腔后，腸系膜和附睪周圍脂肪。同時(shí)也檢測(cè)了皮下脂肪。生化檢測(cè)：在所示時(shí)間點(diǎn)隱靜脈采血200μL和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)心臟采血1mL用于檢測(cè)胰島素，胰高血糖素和細(xì)胞因子譜。離心后取血清存于-80℃待使用。利用胰島素ELISA試劑盒和胰高血糖素RIA試劑盒檢測(cè)血清中胰島素和胰高血糖素的濃度。通過GLP-1RIA試劑盒檢測(cè)GLP-1循環(huán)水平。通過多重磁珠法檢測(cè)樣本血清中細(xì)胞因子濃度。胰腺摘取和組織處理：胰腺摘取和組織處理方法可簡述為：動(dòng)物麻醉后心臟穿刺，迅速將胰腺組織和周圍組織分離，去掉脂肪和淋巴結(jié)，吸干胰腺上附著的水分并承重，之后放到備好的福爾馬林-乙酸溶液中。從心臟穿刺到將胰腺放到固定液中，整個(gè)過程要在5分鐘內(nèi)完成。固定過夜后，胰腺用冷的流水沖洗并切割成10-12塊。之后在乙醇和二甲苯中脫水，同一個(gè)胰腺中的所有小塊都要包埋在同一個(gè)石蠟塊中，用萊卡(Leica)RM2145半自動(dòng)旋轉(zhuǎn)顯微切割機(jī)切成5-μm厚的切片。這樣，一個(gè)切面即可以用于分析整個(gè)胰腺。

β-細(xì)胞和α-細(xì)胞質(zhì)量分析：切片經(jīng)過脫蠟，脫水后，在0.3％H₂O₂水溶液中孵育30分鐘，以滅活切片中的內(nèi)源性過氧化物酶活性，之后在Ph6.010mM乙酸鈉溶液中于70℃加熱30分鐘以恢復(fù)抗原性。10％的正常山羊血清PBS溶液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，之后用鼠抗胰島素多克隆抗體4℃孵育過夜，用于胰島素染色；另外，兔抗人胰高血糖素抗體(1:800；DAKO)室溫孵育2小時(shí)，用于胰高血糖素染色。PBS洗滌5分鐘后，切片在生物素標(biāo)記的小鼠抗豬IgG或者生物素標(biāo)記的大鼠抗兔IgG中室溫孵育1小時(shí)。PBS洗滌5分鐘，之后在抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物中室溫孵育30分鐘，DAB顯色，蘇木精-伊紅(HE)中復(fù)染。ScanScope CS下觀察，利用ImageScope程序分析。畫出整個(gè)胰腺的面積，利用Positive Pixel Count Algorithm(Aperio technologies)計(jì)數(shù)整個(gè)區(qū)域內(nèi)強(qiáng)陽性信號(hào)(Nsp)，代表胰島素或者胰高血糖素染色。Algorithm也用于檢測(cè)陽性和陰性信號(hào)的總數(shù)，代表整個(gè)胰腺的面積。每個(gè)胰腺的β-細(xì)胞質(zhì)量通過計(jì)數(shù)總的代表性β-細(xì)胞面積(Nsp)與總的胰腺面積和固定前胰腺的質(zhì)量的比例表示。β-細(xì)胞凋亡檢測(cè)：胰腺胰島β-細(xì)胞凋亡是通過檢測(cè)caspase-3染色(Cell Signaling)來評(píng)價(jià)的。caspase-3是一個(gè)常用的胰島β-細(xì)胞凋亡標(biāo)記。為了確認(rèn)研究對(duì)象是胰島β-細(xì)胞，同時(shí)使用胰島素雙染色，方法如前所述。用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒和TMR紅(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)于石蠟包埋的胰腺切片定量進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物素UTP剪切和標(biāo)記。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4'-6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)進(jìn)行核染色，DAPI染色時(shí)，胰腺切片先用小鼠抗胰島素IgG(1：1000)和Cy3-耦連的抗小鼠IgG(1:500)染色，之后用DAPI(1μg/ml PBS溶液,5min,Sigma,密蘇里州,美國)孵育。凋亡的β-細(xì)胞具有典型的形態(tài)學(xué)改變，包括染色質(zhì)濃縮和片段化。TUNEL檢測(cè)時(shí)，胰腺切片先用豬抗胰島素IgG染色，和FITC標(biāo)記的二抗與TUNEL反應(yīng)混合物孵育(60分鐘，RT，暗室)。胰腺切片在共聚焦檢測(cè)前先用DAPI染色。³H-胸腺嘧啶嵌入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：在12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，80-85％的匯合度，血清饑餓24小時(shí)后，用不同濃度的伽馬－氨基丁酸和3mM的葡萄糖處理。一些細(xì)胞在處理前先用伽馬－氨基丁酸受體拮抗劑孵育20小時(shí)。37kg/ml ³H-胸腺嘧啶孵育4小時(shí)用于DNA合成。之后用冰預(yù)冷的PBS液洗滌細(xì)胞2次，1ml 5％的三氯乙酸冰上孵育30分鐘用于沉淀DNA。吸出液體層，加入250μl 0.1mol/l NaOH，室溫孵育30分鐘，低速震蕩。溶解的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到5ml的閃爍液中，液體閃爍計(jì)數(shù)用于放射計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞檢測(cè)：FITC-或者PE-標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4,CD25,CD86(B7.1)，CD152(CTLA-4)抗體，和同型IgG購自BD公司。非標(biāo)記和生物素標(biāo)記的小鼠抗人/小鼠LAP-TGFβ來自R&D公司。兔抗大鼠/小鼠神經(jīng)菌毛素1(neuropilin1，Nrp1)多克隆IgG由Oncogene提供?？筁AP-TGFβ和小鼠同型IgG按照說明書用Alexa Fluor488標(biāo)記(Molecular Probes)?？?Nrp1 IgG和兔正常IgG用Alexa 647標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物加到同型抗體中，終濃度0.2％，用于校正標(biāo)記的一種基質(zhì)蛋白-明膠可能結(jié)合到淋巴細(xì)胞上。統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。統(tǒng)計(jì)分析用Student’s-t檢驗(yàn)或者ANOVA檢驗(yàn)，軟件為SAS或者GraphPad Prism 3.0。糖尿病發(fā)病率用Kaplan-Meier法繪制，用log-rank進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。胰島炎評(píng)分的顯著性差異通過Chi-squared分析確定。體外試驗(yàn)和細(xì)胞因子釋放分析的組間差異使用ANOVA分析。p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本發(fā)明包括使用所有前述組合物來制備用于預(yù)防和治療糖尿病的藥物，其中1型糖尿病更為適宜。本發(fā)明還包括一個(gè)藥物組合物，如一個(gè)預(yù)防藥物，用于所有前述的用途中。對(duì)于化學(xué)當(dāng)量或者化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在結(jié)構(gòu)和序列上與伽馬－氨基丁酸或者GLP-1/EX4相同的聯(lián)合治療藥物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，而且可能易于檢測(cè)以確定它們是否適合用于發(fā)明的方法中。GLP-1的衍生物和變異體。本發(fā)明多肽的變異體可能是自然突變，或者人為突變，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如在替代氨基酸中常用的定點(diǎn)突變技術(shù)。例如，一個(gè)疏水基團(tuán)，如甘氨酸可能被另一個(gè)疏水氨基酸丙氨酸代替。丙氨酸也可能被一個(gè)更加疏水的基團(tuán)亮氨酸，纈氨酸或者異亮氨酸代替。一個(gè)帶負(fù)電的氨基酸如天門冬氨酸可能被谷氨酸代替。一個(gè)帶正電的氨基酸如賴氨酸可能被另一個(gè)帶正電的氨基酸如精氨酸所代替。

伽馬－氨基丁酸是一個(gè)氨基酸，分子式是C₄H₉NO₂，分子量是103.12g/mol。本發(fā)明伽馬－氨基丁酸結(jié)構(gòu)的變異體可能是自發(fā)生成的，或用化學(xué)修飾或者其他常用于氨基酸修飾的相關(guān)方法。例如，氨基基團(tuán)可能被其他的化學(xué)基團(tuán)或者結(jié)構(gòu)所代替，如Fmoc基團(tuán)產(chǎn)生Fmoc伽馬－氨基丁酸或者伽馬－氨基丁酸的N端乙?；纬梢阴；ゑR－氨基丁酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解能用多種技術(shù)來構(gòu)建多肽類似物，該類似物具有所需的與本發(fā)明的相應(yīng)多肽化合物相同或類似的性質(zhì)，但在溶解度、穩(wěn)定性和/或?qū)λ夂兔附獾拿舾行苑矫婢哂懈玫幕钚?。另外，用多種技術(shù)來構(gòu)建多肽類似物，該類似物具有所需的與本發(fā)明的相應(yīng)多肽化合物相同或類似的性質(zhì)，但在溶解度、穩(wěn)定性和/或?qū)λ夂兔附獾拿舾行苑矫婢哂懈玫幕钚?。本發(fā)明多肽類似物可以依據(jù)已知的技術(shù)制備。例如，通過化學(xué)方法改變本發(fā)明中GLP-1/EX4多肽一個(gè)旁側(cè)基團(tuán)的極性如將一個(gè)疏水基團(tuán)轉(zhuǎn)化為另一個(gè)親水或者氨基基團(tuán)。類似物包括組成完整氨基酸的序列或者包括氨基酸和修飾的氨基酸或者其他有機(jī)分子的雜交序列。本發(fā)明也包括伽馬－氨基丁酸能分子與腸泌素激素的雜交產(chǎn)物，例如一個(gè)氨基酸序列與一個(gè)核苷酸序列連接。本發(fā)明的一個(gè)具體體現(xiàn)是，氨基基團(tuán)可以被鹵素基團(tuán)置換，包括但不限于氟，氯，溴，碘等。本發(fā)明的另一個(gè)具體體現(xiàn)，氨基基團(tuán)可以被烷基基團(tuán)置換，包括但不限于甲基化基團(tuán)，乙烷基團(tuán)，丙烷基團(tuán)，異丙烷基團(tuán)，丁烷基團(tuán)，t-丁烷基團(tuán)，戊烷基團(tuán)，己烷基團(tuán)，庚烷基團(tuán)等。本發(fā)明的一個(gè)具體體現(xiàn)，氨基基團(tuán)可以被環(huán)烷基基團(tuán)置換，包括但不限于環(huán)戊烷，環(huán)己烷等。

本發(fā)明的另一個(gè)具體體現(xiàn)，氨基基團(tuán)可以被烷氧基基團(tuán)置換，包括但不限于烷氧基，甲氧基，乙氧基，丙烷基等。本發(fā)明的另一個(gè)具體體現(xiàn)，氨基基團(tuán)可以被鏈烯基置換,包括但不限于：乙烯基、丙烯基等。本發(fā)明的另一個(gè)具體體現(xiàn)，氨基基團(tuán)可以被芳香族基團(tuán)置換，包括但不限于苯基團(tuán)，萘基團(tuán)，蒽基，聯(lián)苯基團(tuán)，芘基基團(tuán)，二萘嵌苯等。本發(fā)明的一個(gè)具體體現(xiàn)，氨基基團(tuán)可以被雜苯基團(tuán)置換，包括但不限于雜苯基團(tuán)，吡啶基團(tuán)，雙氮苯基團(tuán)，三嗪基團(tuán)，吖啶基團(tuán)，噻吩基團(tuán)，咪唑基團(tuán)，1,3-氧氮雜戊基團(tuán)，噻唑基團(tuán)，三唑基團(tuán)，喹啉基團(tuán)，異喹啉基團(tuán)等。本發(fā)明的另一個(gè)具體體現(xiàn)，碳基基團(tuán)可以被化學(xué)基團(tuán)置換，包括但不限于上述的化學(xué)基團(tuán)。利用化學(xué)工程技術(shù)，如化學(xué)處理是常見的化學(xué)基團(tuán)修飾或者置換方法。本發(fā)明的一方面，通過選擇性定點(diǎn)突變，-伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素激素組合物的活性可能升高也可能降低。一個(gè)DNA質(zhì)?；蛘弑磉_(dá)載體，包括核酸分子或者一個(gè)序列一致的核酸分子也用于這些研究中，利用Pharmacia Biotech的U.S.E(單一位點(diǎn)缺失)突變?cè)噭┖谢蛘咂渌梢再I到的突變?cè)噭┖谢蛘逷CR。一旦突變產(chǎn)生，可通過DNA序列分析證實(shí)，將通過一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)突變的融合蛋白并且檢測(cè)活性。本發(fā)明包括-伽馬－氨基丁酸能和和腸泌素激素的組合物，具體而言，-伽馬－氨基丁酸，-伽馬－氨基丁酸前體GAD65/67和GLP-1或者EX4，與本發(fā)明的序列(或其部分序列)至少約：>20％、>25％、>28％、>30％、>35％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％或>90％更優(yōu)選約>95％、>99％或>99.5％相同的序列的融合蛋白。一致性的檢測(cè)依據(jù)常見方法。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法計(jì)算一致性。最優(yōu)選使用BLAST 2.1程序的高級(jí)搜索評(píng)估序列的一致性,BLAST是一套復(fù)合程序。本發(fā)明中的伽馬－氨基丁酸能分子是指包括但不限于伽馬－氨基丁酸和伽馬－氨基丁酸前體谷氨酸脫羧酶(GAD65)。GAD65是一種酶，主要在胰腺胰島細(xì)胞中生成。在哺乳動(dòng)物，GAD存在2種同型異構(gòu)體，分別由2個(gè)不同的基因編碼-Gad1和Gad2。這些同性異構(gòu)體GAD67和GAD65的分子量分別是67和65kDa。GAD被認(rèn)為是自身免疫反應(yīng)中早期自身反應(yīng)性T細(xì)胞的主要靶點(diǎn)。盡管GAD65長期被認(rèn)為是1型糖尿病自身免疫的一個(gè)主要目標(biāo)抗原，但GAD65在調(diào)節(jié)胰島β-細(xì)胞生長/增殖，分泌和功能方面的作用還不清楚。在本發(fā)明中，通過自身免疫去掉GAD陽性胰島β-細(xì)胞可能降低胰島內(nèi)伽馬－氨基丁酸水平，這將引起β-細(xì)胞破壞的不斷累積。這個(gè)假設(shè)在NOD小鼠中得到支持，高表達(dá)人GAD65的NOD小鼠在發(fā)生糖尿病方面受到保護(hù)，而低表達(dá)GAD65的NOD小鼠不被保護(hù)。本發(fā)明的組合物可以提供一些輔助試劑。具體地，這些輔助試劑可能是佐劑，所述和其它專利中常見的試劑。另外，具體地，本專利的組合物也可以提供細(xì)胞刺激劑，本發(fā)明的組合物可能提供細(xì)胞因子，但不限于趨化因子，干擾素，白介素和其他專利中已知的用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的因子。本發(fā)明中組合物一方面，用于表達(dá)伽馬－氨基丁酸能和腸泌素激素和融合DNA序列疫苗，突變將引起核酸疫苗序列的一部分氨基酸序列改變，這部分并不參與提供活性或者這部分提供活性以致DNA疫苗的活性升高或者降低。通過選擇性位點(diǎn)特異性突變，DNA疫苗的活性可能被升高或者降低。一個(gè)DNA質(zhì)粒或者表達(dá)載體，包括核酸分子或者一個(gè)序列一致的核酸分子也用于這些研究中，利用Pharmacia Biotech的U.S.E(單一位點(diǎn)缺失)突變?cè)噭┖谢蛘咂渌梢再I到的突變?cè)噭┖谢蛘逷CR。一旦突變產(chǎn)生，并通過DNA序列分析證實(shí)，將通過一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)突變的融合蛋白并且檢測(cè)活性。本發(fā)明還包括一個(gè)藥物組合物，如一個(gè)預(yù)防藥物，用于所有前述的用途中。本發(fā)明的藥物組合物做成制劑包括前述的成份或者在一個(gè)DNA載體形式中，并可以通過多種途徑應(yīng)用于人類或動(dòng)物，且并不局限于局部施用，如口服、噴霧、氣管內(nèi)灌輸、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射、肌肉注射和基因療法。施用劑量取決于患者需要，期望取得的效果和施用途徑。例如人類的施用量可以為0.01-10mmol/kg體重或是0.02～1000nmol/kg體重(伽馬－氨基丁酸:GLP-1/Ex4)。當(dāng)使用基因治療時(shí)，人的DNA注射濃度可以為1μg/kg體重或是0.1～100μg/kg體重。使用的DNA疫苗合適濃度是0.1-1000μg DNA。用體內(nèi)脂質(zhì)體或是病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以將融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞。適用于本發(fā)明的多種轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。本發(fā)明的組合物可以每日、每周或是遵醫(yī)囑施用持續(xù)需要的時(shí)間。本發(fā)明的融合蛋白可以單獨(dú)有效使用，也可以在藥物組合物中與其他如藥用載體的成分一起使用。本發(fā)明的藥用組合物可用公知的能施用給患者的可藥用載體的方法制備，從而使有效量的核苷酸或多肽分子與可藥用的載體結(jié)合形成混合物。這些適合的載體，在此基礎(chǔ)上，所述藥用組合物可以包括與一種或多種可藥用的載體或稀釋液相結(jié)合、并存在于具適當(dāng)pH值并與生理液體等滲的緩沖液中的活性化合物或物質(zhì)，例如復(fù)合核酸分子、多肽分子或融合蛋白。結(jié)合活性分子和載體或?qū)烧吲c稀釋劑結(jié)合的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。所述組合物可包括用于運(yùn)送活性化合物到組織內(nèi)特定部位的靶向制劑(targetingagent)。本發(fā)明的組合物可以與已知的I型和/或II型糖尿病的治療措施如使用降糖藥物或結(jié)合胰島素共同進(jìn)行治療。例如，治療糖尿病的藥物可以包括：Actos、Amaryl、avandia、DiaBeta、Diabinese、Dymelor、Glucophage、GlucophageXR、Glucotrol、Glucotrol XL、Glucovance、Glynase、PresTab、Glyset、Micronase、Orinase、Pandin、Precose、Starlix和Tolinase。例如，適合的胰島素包括：Aspart、Insulin Glargine(Lantus)、Lente、Lispro(Humalog)、NPH和Ultralente。本發(fā)明適用于任何需要此類治療的個(gè)體。這些個(gè)體有可能發(fā)展成糖尿病、或新近診斷為糖尿病的患者或是已經(jīng)診斷為糖尿病的患者。本發(fā)明與預(yù)防和治療如本文所述的I型和II型糖尿病相關(guān)。例如，這樣的個(gè)體可以為肥胖的人或有糖尿病遺傳史但尚未發(fā)病的人、或新近診斷為或已經(jīng)診斷為糖尿病的人。世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)定義肥胖。BMI是用Kg體重除以身高米數(shù)的平方得來。BMI為18.5～25則體重正常。個(gè)體的BMI為25～30則為超重，等于或超過30則為肥胖。這些個(gè)體也可以是血糖高于相同年齡與體重的正常值(正常血糖可以是根據(jù)醫(yī)學(xué)參考資料常規(guī)測(cè)定的)的人，盡管還不至于診斷為糖尿病。這些個(gè)體也可以是有糖尿病遺傳史但是還沒有發(fā)展成為糖尿病的人。當(dāng)血糖值高于普遍認(rèn)可的正常范圍時(shí)即可診斷為糖尿病。根據(jù)ADA和CDA的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)個(gè)體的空腹血糖值超過7.0nmol/L，或是隨機(jī)血糖值(任意時(shí)段的血糖值)超過11.1nmol/L可認(rèn)定為始患糖尿病。一旦診斷為糖尿病，任何對(duì)患者進(jìn)行的對(duì)抗高血糖癥的努力/方法都屬于治療措施而不屬于預(yù)防措施。施用本發(fā)明的化合物以預(yù)防或治療I型糖尿病。I型糖尿病是指通常有遺傳性易患病體質(zhì)、或具有胰島β-細(xì)胞損傷、或具有缺乏胰島素反應(yīng)第一期的“前”糖尿病、或是剛剛診斷為糖尿病的個(gè)體。在新近診斷為I型糖尿病的患者中，免疫系統(tǒng)攻擊并破壞產(chǎn)生胰島素的胰島β-細(xì)胞的結(jié)果是他們的胰腺不產(chǎn)生或是產(chǎn)生很少的胰島素。此外，有些人盡管還沒有診斷為糖尿病，但有發(fā)展為II型糖尿病的高風(fēng)險(xiǎn)。為降低或減少其發(fā)展為II型糖尿病的高風(fēng)險(xiǎn)，施用本發(fā)明的化合物同樣適用于預(yù)防和/或治療II型糖尿病。本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的組合物聯(lián)合用藥可以通過基因治療的方法直接在體內(nèi)表達(dá)。這些質(zhì)粒沒有傳染潛質(zhì)，僅能引起局部輕微的炎癥反應(yīng)，也不會(huì)引起插入性突變。這避免了許多病毒載體的缺點(diǎn)。這種非病毒基因治療簡單，便宜，并可以在醫(yī)院外不需要醫(yī)生的情況下使用。-伽馬-氨基丁酸能分子和腸泌素激素一同給予，通過注射裸質(zhì)粒DNA到骨骼肌而不是其他組織中。而且，通常轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間比在其他組織中長，可能因?yàn)榫€性肌細(xì)胞屬于非分裂和長壽命的細(xì)胞。目前還沒有這種技術(shù)在自身免疫性疾病如1型糖尿病中的禁忌癥。

概述地，我們發(fā)明了一種方法，單獨(dú)使用伽馬-氨基丁酸能分子或利用聯(lián)合伽馬－氨基丁酸能和腸泌素激素促進(jìn)β細(xì)胞再生同時(shí)控制免疫原性，用于預(yù)防和治療1型糖尿病。這種聯(lián)合治療提供了一種互惠的協(xié)同效果，包括促進(jìn)β細(xì)胞再生同時(shí)抑制胰島自身免疫。在利用MLDS-誘導(dǎo)的糖尿病CD1小鼠(一種β細(xì)胞破壞模型)和1型糖尿病傾向型的NOD小鼠或者轉(zhuǎn)基因TCR NOD小鼠中，均見到明顯的改善效果。聯(lián)合伽馬－氨基丁酸能分子和腸泌素激素，例如本發(fā)明中聯(lián)合伽馬－氨基丁酸和GLP-1/EX4治療完全改善了NOD小鼠已發(fā)生的高血糖。而在已經(jīng)發(fā)病的1型糖尿病病人中，單純伽馬－氨基丁酸治療或者GLP-1/EX4均不能完全改善糖尿病。所以，本發(fā)明提供了一種預(yù)防和治療發(fā)生糖尿病性高血糖的1型糖尿病患者。可以理解的是：以上涉及優(yōu)選實(shí)施方案的描述僅以實(shí)施例的方式給出。由于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或是由于提呈本發(fā)明專利的方法引起的一些變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，而且這樣明顯的變化無論是否表達(dá)描述都是在本發(fā)明描述和要求保護(hù)的范圍內(nèi)。表1：伽馬－氨基丁酸的分子式和結(jié)構(gòu)，GLP-1/EX4，胰高血糖素，GIP,胰島素，GAD65和其他與本發(fā)明相關(guān)分子的序列，詳見下文：

伽馬－氨基丁酸分子式:C₄H₉NO₂：

分子量:10

分子結(jié)構(gòu):