本發(fā)明涉及鞣酸的新用途，具體地說是鞣酸在制備具有保護肝臟功效藥物中的用途。

背景技術(shù)：

多元酚類化合物鞣酸(tannic acid)，又名單寧酸、單寧，由五倍子中得到的一種鞣質(zhì)。分子式為C₇₆H₅₂O₄₆，相對分子質(zhì)量為1701.20，淡黃色至淺棕色無定型粉末或松散有光澤的鱗片狀或海綿狀固體，暴露于空氣中能變黑。無臭，微有特殊氣味，具強烈的澀味，露置光和空氣中色變深。溶于水，易溶乙醇、丙酮和甘油，幾乎不溶于乙醚、苯、氯仿和石油醚，CAS號：1401-55-4。

對乙酰氨基酚是典型的劑量依賴性肝毒性藥物，在體內(nèi)經(jīng)氧化反應(yīng)形成高活性的中間代謝產(chǎn)物N－乙酰－對－苯醌亞胺(NAPQI)。在治療劑量時，對乙酰氨基酚在肝臟代謝主要是生物轉(zhuǎn)化的第二相反應(yīng)即與硫酸鹽和葡萄糖醛酸結(jié)合，但有一小部分代謝藥物通過生物轉(zhuǎn)化的第一相反應(yīng)即肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細胞色素P450(CYP)介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，隨后再進行第二相結(jié)合反應(yīng)。在生理狀態(tài)下，氧化反應(yīng)主要通過細胞色素P450酶系統(tǒng)，主要是CYP2E1和CYP3A4兩種同功酶，形成大量的NAPQI，NAPQI與谷胱甘肽結(jié)合無毒的硫醇尿酸而排出。當(dāng)對乙酰氨基酚過量時，硫酸鹽化作用和糖脂化作用的通路飽和，快速生成的NAPQI可導(dǎo)致肝內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)儲備耗竭和降低解毒作用。NAPQI耗盡肝內(nèi)的GSH，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，生成大量活性氧族(ROS)和活性氮族(RNS)并產(chǎn)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致肝小葉中心的壞死。

鞣酸是一種植物來源的水溶性多元酚，紅酒和綠茶中含有豐富的鞣酸。近期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞣酸的心血管保護作用與其抑制L-型鈣離子通道、激活開放Kv7.4/7.5離子通道和降低心肌收縮力有關(guān)。但是至今未見鞣酸對肝臟急性損傷保護作用的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是提供鞣酸的一種新用途，即在制備保護肝臟的藥物中的應(yīng)用，尤其在減輕對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝臟毒性藥物中的應(yīng)用，起到肝細胞保護的作用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備通過抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡作用達到多靶點治療肝臟毒性藥物中的應(yīng)用，尤其在治療乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝臟毒性藥物中的應(yīng)用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備降低丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平藥物中的應(yīng)用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備降低一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)水平藥物中的應(yīng)用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備降低丙二醛(MDA)的水平藥物中的應(yīng)用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性藥物中的應(yīng)用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備減輕肝組織肝竇充血、減少炎性細胞浸潤并且減少肝細胞壞死藥物中的應(yīng)用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備降低c-fos、c-jun、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的表達藥物中的應(yīng)用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備增加細胞凋亡相關(guān)因子bcl-2表達水平藥物中的應(yīng)用。

進一步本發(fā)明提供了一種多元酚類化合物鞣酸的新用途，即鞣酸在制備降低細胞凋亡相關(guān)因子bax、NF-κB(p65)、caspase-3表達水平藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的鞣酸作為肝臟保護藥，與藥學(xué)上允許使用的載體或稀釋劑混合，制備成抑制對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和肝細胞凋亡藥物制劑，可保護肝細胞。

本發(fā)明所述化合物均可從商業(yè)渠道獲得。

本發(fā)明所指藥學(xué)上可以接受的載體或稀釋劑，可選自藥物制劑中常用的賦形劑、輔料或溶劑。如乳糖、蔗糖、糊精、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯樹膠、硬脂酸鎂、硬脂酸、纖維素的低級烷基醚、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、樹膠、糖漿、花生油、橄欖油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、單硬脂酸甘油脂或二硬脂酸甘油脂、著色劑、矯味劑、防腐劑、水、乙醇、丙醇、生理鹽水、葡萄糖溶液等等。

本發(fā)明提供的鞣酸作為肝臟保護藥的具體制備方法可按照制劑常規(guī)進行。如本發(fā)明所述化合物可以作為活性成份，與水、蔗糖、山梨醇糖、果糖等制備成口服液體制劑；也可以乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇糖等為賦形劑，以淀粉等為崩解劑，以硬脂酸、滑石粉等為潤滑劑，明膠、聚乙烯醇為結(jié)合劑制備成片劑或膠囊劑；還可與生理鹽水、葡萄糖溶液或鹽水與葡萄糖組成的混合載體制備成注射液。還可制成無菌粉針劑以及各種緩釋劑、混懸劑、乳劑等等。

附圖說明

圖1鞣酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2A鞣酸抑制ALT的統(tǒng)計圖；

圖2B鞣酸抑制AST的統(tǒng)計圖；

圖3A鞣酸抑制ET-1的統(tǒng)計圖；

圖3B鞣酸抑制NO的統(tǒng)計圖；

圖4A鞣酸增大SOD活性的統(tǒng)計圖；

圖4B鞣酸增大GSH-Px活性的統(tǒng)計圖；

圖4C鞣酸降低MDA含量的統(tǒng)計圖；

圖4D鞣酸增大CAT活性的統(tǒng)計圖；

圖5A空白組小鼠的病理切片圖(400×)；

圖5B對乙酰氨基酚模型組小鼠的病理切片圖(400×)；

圖5C鞣酸低劑量組(25mg/kg)小鼠的病理切片圖(400×)；

圖5D鞣酸高劑量組(50mg/kg)小鼠的病理切片圖(400×)；

圖5E水飛薊素組(100mg/kg)小鼠的病理切片圖(400×)；

圖6A空白組小鼠肝臟免疫組化切片圖(400×)；

圖6B對乙酰氨基酚模型組小鼠肝臟免疫組化切片圖(400×)；

圖6C鞣酸低劑量組(25mg/kg)小鼠肝臟免疫組化切片圖(400×)；

圖6D鞣酸高劑量組(50mg/kg)小鼠肝臟免疫組化切片圖(400×)；

圖6E水飛薊素組(100mg/kg)小鼠肝臟免疫組化切片圖(400×)；

圖7A鞣酸降低bax表達的Western blot條帶及統(tǒng)計圖；

圖7B鞣酸降低caspase-3表達的Western blot條帶及統(tǒng)計圖；

圖7C鞣酸增大bcl-2表達的Western blot條帶及統(tǒng)計圖；

圖7D鞣酸降低NF-κB(p65)表達的Western blot條帶及統(tǒng)計圖。

具體實施方式

實施例1鞣酸對對乙酰氨基酚所致肝損傷的保護作用。

1材料與方法：

1.1實驗動物

純種清潔級雄性昆明小鼠50只，體重18-22g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2實驗用藥物

鞣酸(Tannic acid，TA)購自Sigma Chemicals(St.Louis,MO,USA)。

對乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)購自Sigma Chemicals(St.Louis,MO,USA)。

水飛薊素(Silymarin，Sily)購自西安一禾生物工程有限公司(Xi'an，China)。

1.3模型制備

實驗動物常規(guī)觀察1周后隨機分為5組，每組各10只。分別為空白對照組(Con)、APAP誘導(dǎo)肝損傷模型對照組(400mg/kg，APAP)、TA低劑量組(25mg/kg，L-TA)、TA高劑量組(50mg/kg，H-TA)和Sily陽性藥對照組(100 mg/kg，Sily)。各組小鼠稱重后，Con及APAP組每天灌胃生理鹽水0.2ml/10g，L-TA、H-TA和Sily組分別灌胃25mg/kg TA，50mg/kg TA和100mg/kg Sily，連續(xù)3天。后除空白組外其余各組于第3天一次性灌胃400mg/kg APAP，復(fù)制小鼠急性肝損傷模型。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1生物化學(xué)方法測定氧化應(yīng)激及器官功能相關(guān)因子：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。

1.4.2病理學(xué)指標(biāo)：光鏡觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.4.3 Western blot測定細胞凋亡相關(guān)因子(bax/bcl-2，NF-κB(p65)，caspase-3)表達水平。

1.4.4免疫組化測定c-fos，c-jun，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的表達。

1.5統(tǒng)計處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TA對ALT和AST的影響

與空白對照組比較，APAP誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的ALT和AST水平明顯升高(P<0.001)，而接受TA(25，50mg/kg)和Sily(100mg/kg)預(yù)處理后ALT和AST水平下降(P<0.001)(詳見圖2A，2B)。

2.2 TA對NO和ET-1的影響

與空白對照組比較，APAP誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的NO和ET-1水平明顯升高(P<0.001)，而接受TA(25，50mg/kg)和Sily(100mg/kg)預(yù)處理后NO和ET-1水平下降(P<0.001)(詳見圖3A，3B)。

2.3 TA對MDA、SOD、CAT和GSH-Px的影響

與空白對照組比較，APAP誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的SOD、CAT和GSH-Px水平明顯降低而MDA水平明顯升高(P<0.001)而接受TA(25，50mg/kg)和Sily(100mg/kg)預(yù)處理后SOD、CAT和GSH-Px水平明顯上升(P<0.001，P<0.005)而MDA水平明顯下降(P<0.001)(詳見圖4A，B，C和D)。

2.4 TA對肝臟組織病理學(xué)變化的影響

本實驗病理學(xué)顯示空白對照組肝臟部分具有正常組織結(jié)構(gòu)(圖5A)。正常對照組具有正常的肝組織結(jié)構(gòu)；APAP模型對照組肝臟組織則造成嚴重的肝竇充血,炎性細胞浸潤和肝細胞退化(圖5B)。經(jīng)TA和Sily預(yù)處理后，肝組織肝竇充血減輕，炎性細胞浸潤減少并且肝細胞保存完好壞死減少(圖5C，D和E)。

2.5 TA對c-fos，c-jun，TNF-α和IL-1β表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示APAP模型對照組(圖6B)中肝臟組織高表達c-fos，c-jun，TNF-α和IL-1β，而在空白對照組(圖6A)中則低表達c-fos，c-jun，TNF-α和IL-1β。與APAP模型對照組相比，TA低(圖6C)、高(圖6D)劑量組和Sily組(圖6E)能夠使小鼠肝臟組織中c-fos，c-jun，TNF-α和IL-1β表達降低(P<0.001 or P<0.005)。2.6TA對細胞凋亡相關(guān)因子bax/bcl-2，NF-κB(p65)，caspase-3表達水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示與空白對照組相比較，APAP模型對照組bax，NF-κB(p65)，caspase-3表達顯著增加(P<0.01)，而bcl-2的表達顯著降低(P<0.001)。與之相反，TA和Sily組的bax，NF-κB(p65)，caspase-3表達顯著降低(P<0.001 or P<0.05)，而bcl-2的表達顯著增加(P<0.05，P<0.005，P<0.001)(詳見圖7A，B，C和D)。

本實驗結(jié)果顯示，TA劑量依賴性地改善過量APAP誘導(dǎo)急性肝損傷導(dǎo)致的肝組織病理學(xué)變化，降低ALT、AST、NO、ET-1、MDA含量，提高SOD、CAT、GSH-Px的活性，抑制c-fos，c-jun，TNF-α，IL-1β，Caspase-3和Bax的過度表達而上調(diào)Bcl-2的表達。本實驗結(jié)果提示TA具有明顯的抗APAP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用，表明TA的肝保護作用機制可能與抗氧化、抗炎、抗凋亡有關(guān)。

實施例2制備口服片劑

按照本領(lǐng)域已知的方法制備片劑，每片含有下述成分：

以上實施例是為了更詳細地說明本發(fā)明，但它不以任何形式限制本發(fā)明。