本發(fā)明涉及柳蘭抗HIV-1病毒有效部位及制法和應用，屬于植物提取物技術領域。

背景技術：

柳蘭（Epilobium angustifolium L.）為柳葉菜科（Onagraceae）柳蘭屬多年生粗壯草本植物，是藏醫(yī)傳統(tǒng)藥用植物。其主要生于海拔2800~4250米的山坡林緣、林下及河谷濕草地。分布在我國西南、西北、華北至東北。北溫帶廣布，北美洲、歐洲至日本、小亞細亞至喜馬拉雅等地也有。柳蘭全草味苦，無毒，有消腫利水，下乳，潤腸之功能。主治乳汁不足，氣虛浮腫。格爾?格桑扎西在《實用藏藥名庫》記載其具有清熱利膽、止瀉、殺蟲功能。

艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合癥（又譯：后天性免疫缺陷癥候群）。如今艾滋病己在全球范圍內成為嚴重危害人類生存與發(fā)展的公共衛(wèi)生和社會問題。我國艾滋病的流行經過傳入期、擴散期，目前己進入快速增長期，處于全國低流行和局部地區(qū)及特定人群高流行并存的態(tài)勢。

艾滋病是一種危害性極大的傳染病，由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起。HIV是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒，即“人類免疫缺陷病毒”， 它侵入人體后破壞人體的免疫系統(tǒng)，使人體發(fā)生多種難以治愈的感染和腫瘤，最終導致死亡，現(xiàn)已證實HIV分為兩型：HIV-1型和HIV-2型。HIV-1型為逆轉錄病毒科慢病毒屬，其病毒RNA基因組必須經先行由單鏈RNA逆轉錄為cDNA，形成RNA-DNA雜合體后，水解掉與DNA互補的RNA，再以單鏈的cDNA為模板合成雙鏈DNA，從而可以整合人宿主DNA基因組當中，此過程由逆轉錄酶（RT酶）催化。RT酶功能多樣，它由P66和P51兩個蛋白單體構成異源二聚體，其中P66是酶活性的主要功能部分；除具有逆轉錄酶活性外，還具有DNA聚合酶活性以及RNase酶活性。逆轉錄過程的分子機制亦頗為復雜：逆轉錄過程的起始引物并非來自病毒自身合成，而是利用宿主細胞內的tRNALye-3，與病毒RNA的引物結合位點（PBS）相結合后，再高效啟動逆轉錄過程。其次，逆轉錄酶因為缺泛3'-5'核酸外切酶活性，無法完成校讀功能，復制忠實性差，是HIV病毒高變異性的重要原因之一。人類免疫缺陷病毒１型（即HIV-1型）逆轉錄酶 （RT）一直是重要的抗 HIV感染的靶點，用于開發(fā)治療艾滋病的藥物。蛋白酶是人類免疫缺陷病毒基因編碼中的一種特異天冬酰蛋白酶，其作用是將基因和基因表達所產生的蛋白裂解，成為具有活性的病毒結構蛋白和酶，是HIV病毒復制的關鍵物質。HIV蛋白酶抑制劑主要作用于艾滋病病毒復制的最后階段，由于蛋白酶被抑制，使之從感染的CD4細胞核中形成DNA不能聚集和釋放，導致蛋白前體不能裂解和形成成熟病毒體。

申請人在研究中發(fā)現(xiàn)：目前抗艾滋病藥物的原料較為匱乏?，F(xiàn)有的抗HIV病毒藥物像其他類型的抗艾滋病病毒藥物一樣，隨著 HIV-1逆轉錄酶產生耐藥性突變， 已上市的治療艾滋病的藥物的療效受到限制。目前，迫切需要開發(fā)新一代抗HIV-1型病毒藥物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是：克服現(xiàn)有技術的不足，提供柳蘭抗HIV-1病毒有效部位及制法和應用，該柳蘭抗HIV-1病毒有效部位能有效抑制HIV-1 病毒活性，能夠用于制備抗HIV-1 病毒藥物，適用于開發(fā)成抗艾滋病新藥。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：該柳蘭抗HIV-1病毒有效部位，其特征在于：選自柳蘭正丁醇部位或柳蘭水相萃取部位。

所述的正丁醇部位含有黃酮苷和酚類化合物；水相萃取部位含有多糖和有機酸類化合物。

該柳蘭抗HIV-1病毒有效部位的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：將柳蘭全草粉碎，加入體積百分比濃度65%~95%乙醇溶液提取，將所得提取液濃縮、干燥，得浸膏；將浸膏分散在蒸餾水中得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，將所得正丁醇萃取液揮去正丁醇，得柳蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得柳蘭水相萃取部位。

所述的回流提取為超聲波輔助回流提取，具體操作為：將粉碎后的柳蘭全草加入體積百分比濃度65%~95%乙醇溶液超聲波提取0.5~3小時，過濾，濾渣加入體積百分比濃度65%~95%乙醇溶液回流提取1~3次，合并提取液，即得。

該柳蘭抗HIV-1病毒有效部位的應用，其特征在于：在制備抗HIV-1 病毒藥物中的應用。

所述抗HIV-1 病毒藥物是通過柳蘭正丁醇部位或柳蘭水相萃取部位，與藥用輔料混合后，制成的口服制劑或注射制劑。

所述的注射制劑為脂質體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑。

所述的口服制劑為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服溶液劑。

申請人對于本發(fā)明的說明如下：

制備方法中，浸膏為粗提取物，采用不同的溶劑萃取浸膏分散液，指的是依次將石油醚加入浸膏分散液萃取分離獲得石油醚萃取液、將乙酸乙酯加入浸膏分散液萃取分離獲得乙酸乙酯萃取液、將正丁醇加入浸膏分散液萃取分離獲得正丁醇萃取液；取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分別揮發(fā)去除溶劑后，所得即選自柳蘭乙酸乙酯部位和柳蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液（溶劑為水），揮發(fā)去除溶劑即得柳蘭水相萃取部位。水相萃取部位也可以稱作水相萃取物，水相萃取部位易溶于水；而相對的，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇為有機相，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位對應易溶于石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。其中，柳蘭正丁醇部位含有皂苷和酚類化合物；柳蘭水相萃取部位含有多糖和有機酸類化合物。揮去溶劑即揮發(fā)去除溶劑。揮去溶劑可以采用常壓加熱使溶劑（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）揮發(fā)。優(yōu)選的，揮去溶劑采用減壓濃縮，該方法效率高，并且能避免熱敏性成分因高溫喪失藥性。

優(yōu)選的劑型為口服制劑或注射制劑。口服制劑和注射制劑口服制劑和注射制劑為最佳給藥途徑。此處所述口服制劑為經腸胃道給藥制劑，優(yōu)選的，口服制劑為緩釋、控釋型口服制劑。膠囊劑包括軟膠囊和硬膠囊。另外，該柳蘭抗HIV-1病毒有效部位的制劑也可以為其他給藥途徑的制劑：如呼吸道給藥制劑（噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑）；皮膚給藥制劑（外用溶液劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、貼劑）；膜給藥制劑（滴眼劑、 滴鼻劑、眼用軟膏、含漱劑、舌下片劑）；腔道給藥制劑（栓劑）。注射制劑可以為常規(guī)注射制劑。根據(jù)藥物傳遞系統(tǒng)進行分類，優(yōu)選的，本發(fā)明的注射制劑為脂質體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑；其他的，本發(fā)明的注射劑還可以為微囊注射劑、聚合物膠束注射劑、微乳或亞微乳注射劑、亞微粒注射劑或凝膠注射劑，以上藥物傳遞系統(tǒng)的注射劑能延長藥物載體在體內的循環(huán)時間、延長載藥微粒在吸收部位的停留時間、控制藥物在釋放初期的突釋效應。藥用輔料包括藥物載體、及溶劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、助懸劑、澄清劑、反絮凝劑、矯味劑、著色劑、防腐劑、化學滅菌劑、吸附劑、助濾劑、抗氧劑、pH調節(jié)劑、等滲調節(jié)劑、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、抗粘著劑、緩釋劑、控釋劑、包衣材料、成膜材料、膠囊材料中的一種或多種。

制備方法中：所述的超聲波提取為常溫下進行。所述的濃縮和干燥為減壓濃縮、真空干燥，以避免具有揮發(fā)性的柳蘭有效部位的散失。所述的回流提取1~3次是指：向回流加熱裝置中加入超聲提取后的濾渣和乙醇溶液，加熱、回流提取，放冷過濾得一次提取液和藥渣；向藥渣中加入乙醇溶液，加熱、進行第二次回流提取，放冷過濾得二次提取液和藥渣；合并多次提取液，即得回流提取的提取液。優(yōu)選的，每次回流提取0.5~2小時；每次回流提取時所加乙醇溶液沒過藥材表面1~2cm。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的柳蘭抗HIV-1病毒有效部位及制法和應用所具有的有益效果是：

1、該柳蘭抗HIV-1病毒有效部位能有效抑制HIV-1 病毒活性，能夠用于制備抗HIV-1 病毒藥物，適用于開發(fā)成抗艾滋病新藥。申請人通過在研究中發(fā)現(xiàn)：現(xiàn)有技術中僅具有利水滲濕、活血調經之功的柳蘭，還具有抗艾滋病的功效。申請人首次在HIV-1 病毒上進行藥效篩選，并通過大量研究確定：柳蘭正丁醇部位、柳蘭水相萃取部位通過結合逆轉錄酶蛋白及抑制HIV蛋白酶可以明顯抑制HIV-1病毒，細胞毒性隨給藥濃度增大而增強，適用于制備成抗艾滋病新藥。申請人在發(fā)現(xiàn)柳蘭的新功效，設計制備方法，通過研究確定其最優(yōu)的有效部位和該有效部位所抑制的酶的種類，在以上過程中付出了大量的創(chuàng)造性勞動。

2、該柳蘭抗HIV-1病毒有效部位的制備方法提取方便，是申請人經研究確定的方法。本發(fā)明制備方法中溶劑的萃取順序是申請人經研究確定的，順序不能顛倒替換，采用以上溶劑萃取順序所得的柳蘭正丁醇部位和柳蘭水相萃取部位具有較好的抑制HIV-1 病毒的效果。

3、本發(fā)明拓展了抑制HIV-1 病毒的原料渠道，擴大了柳蘭的用途，使柳蘭發(fā)展成為抑制HIV-1 病毒藥物的新原料，可顯著提高柳蘭的附加值。

附圖說明

圖1柳蘭正丁醇部位的HIV-1 R3A野生病毒感染抑制率結果。

圖2柳蘭水相萃取部位的HIV-1 R3A野生病毒感染抑制率結果。。

圖3柳蘭正丁醇部位假病毒單周期感染。

圖4柳蘭水相萃取部位假病毒單周期感染。

圖5柳蘭正丁醇部位CCK8法細胞毒性。

圖6柳蘭正丁醇部位和柳蘭水相萃取部位 HIV-1抑制逆轉錄酶活性的影響對比圖。

圖7柳蘭正丁醇部位和柳蘭水相萃取部位對 HIV-1 病毒活性的影響對比圖。

具體實施方式

實施例1~3是本發(fā)明的柳蘭抗HIV-1病毒有效部位及制法的具體實施方式，其中實施例1為最佳實施例。

實施例1

制備方法，包括下述步驟：將柳蘭全草粉碎，采用體積百分比濃度75%~85%乙醇溶液超聲波提取1~2時，然后過濾獲得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質量百分比濃度75%~85%乙醇水溶液回流提取3次，每次0.5小時，合并超聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，分別得各溶劑的萃取液，將所得正丁醇萃取液揮去正丁醇，得柳蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得柳蘭水相萃取部位。

實施例2

制備方法，包括下述步驟：將柳蘭全草粉碎，采用體積百分比濃度85%~95%乙醇溶液超聲波提取2~3小時，然后過濾獲得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質量百分比濃度85%~95%乙醇水溶液回流提取2次，每次1小時，合并超聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，分別得各溶劑的萃取液，將所得正丁醇萃取液揮去正丁醇，得柳蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得柳蘭水相萃取部位。

實施例3

制備方法，包括下述步驟：將柳蘭全草粉碎，采用體積百分比濃度65%~75%乙醇溶液超聲波提取0.5~1小時，然后過濾獲得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質量百分比濃度65%~75%乙醇水溶液回流提取2次，每次2小時，合并超聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，分別得各溶劑的萃取液，將所得正丁醇萃取液揮去正丁醇，得柳蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得柳蘭水相萃取部位。

性能測試

以實施例1得到的柳蘭正丁醇部位（標號為L14）和柳蘭水相萃取部位（標號為L14）作為受試藥物，進行如下實驗。

一、HIV-1 R3A野生病毒感染實驗。

分別精密稱定L13、L14各100mg于不同的離心管中，加入1mL DMSO溶解，配制100mg/mL的貯存液。實驗時依次用無血清的培養(yǎng)基稀釋至系列濃度為100μg/mL、33.3μg/mL、11.1μg/mL、3.7μg/mL、1.2 μg/mL，為不同濃度的給藥組。實驗設病毒對照組、細胞對照組和藥物不同劑量組。給藥組于96孔板每孔中加入100μL不同濃度的藥物溶液，每濃度設三復孔。取MT4細胞（5×10⁵/mL）加入HIV-1 R3A病毒1×10³TCID₅₀/mL，37℃，5% CO₂培養(yǎng)2 h，PBS洗滌3次，離心棄去上清，加入完全培養(yǎng)基后于96孔板每個加有藥的孔中加入100μL此感染HIV-1的細胞（5×10⁴/100μL），37℃，5% CO₂培養(yǎng)，三天后半換液體，保持藥物濃度不變，第六天收集各孔取上清，采用ELISA法測定P24抗原量，各孔取上清50μL加入到前1天已鋪板的TZMbl細胞中，37℃、CO₂培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h。采用Promega BrightGlo熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶含量，并計算抑制率， 詳見 圖1~2。

二、HIV-1假病毒單周期感染實驗。

分別精密稱定L13、L14各100mg于不同的離心管中，加入1mL DMSO溶解，配制100mg/mL的貯存液。實驗時依次用無血清的培養(yǎng)基稀釋，L13、L14均為50μg/mL、16.67μg/mL、5.56μg/mL、1.85μg/mL、0.62 μg/mL，為不同濃度的給藥組，僅加入假病毒不加藥組為病毒對照組，加入AZT（齊多夫定）組為陽性對照組。將TZM-bl細胞（Hela細胞表達CD4、CXCR4和CCR5，含Tat啟動的熒光素酶和LacZ基因）接種于96孔板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去上清，加入pSG3假病毒上清，病毒上清中加入DEAE（終濃度10μg/mL），同時加入不同濃度稀釋的藥物，培養(yǎng)48 h后，棄去上清，加入固定液室溫固定5min，PBS清洗后加入顯色液，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50min，PBS清洗，在顯微鏡下計數(shù)藍斑數(shù)，根據(jù)抑制率公式：抑制率=[（病毒對照組－實驗組）/病毒對照組] × 100%，計算得到量效曲線和半數(shù)抑制制濃度（IC50）。結果表明藥物對HIV-1病毒有明顯的抑制作用，詳見圖3~4和表1。

表1 樣品的半數(shù)抑制制濃度IC50

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三、 藥物在細胞水平的CCK-8細胞毒性試驗。

分別精密稱定L13、L14各100mg于不同的離心管中，加入1mL DMSO溶解，配制100mg/mL的貯存液。實驗時依次用無血清的培養(yǎng)基稀釋至系列濃度為250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.63 μg/mL，為不同濃度的給藥組。將TZM-bl細胞接種于96孔板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度梯度的藥物。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用CCK-8細胞增殖檢測試劑（同仁化學），培養(yǎng)45min，酶標儀檢測 450nm 處的吸光度值。計算提取物對正常 TZM-bl 細胞的抑制率，GraphPad Prism 5.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行擬合，得到量效曲線和半數(shù)中毒濃度（TC50）。抑制率公式：抑制率=[（細胞對照組－實驗組）/細胞對照組] ×100%，詳見圖5和表2。

表2 柳蘭抗HIV-1病毒有效部位的細胞毒性

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四、藥物與逆轉錄酶蛋白體外結合實驗。

采用 BIAcore 3000 生物分子相互作用儀，采用逆轉錄酶蛋白與CM5 芯片偶聯(lián)，采用牛血清蛋白（BSA）作為陰性對照。將L13、L14部位提取物用經 0.45 μm 濾膜過濾的 PBS 稀釋到200 μg/mL，流速 20μL/min，注入量為 60μL 進樣，記錄樣品流經靶蛋白結合期時的 RU 值與流經 BSA 蛋白結合期的 RU 值，二者之差為該樣品與靶蛋白的結合響應值，詳見圖5和表3。

表3 與逆轉錄酶的體外結合RU值

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五、藥物對 HIV-1 逆轉錄酶活性的測定。

采用逆轉錄酶檢測試劑盒體外檢測化合物對 HIV-1 逆轉錄酶活性的影響。奈韋拉平（nevirapine， NVP）作為陽性藥，濃度為2.5 ng/mL，L13、L14部位提取物濃度為200 μg/mL，實驗設2個復孔。 實驗在96孔板內加入含有1 ng HIV-1 RT的裂解液（20μL/孔），并與藥物37℃ 孵育1 h。 將96孔板孔內的溶液轉移到微孔板內，繼續(xù)37℃孵育1h。棄除微孔板內的溶液，洗脫液洗5次后加入 200μL Anti - DIG - POD工作液，37℃孵育1h。棄除微孔板的溶液，洗脫液洗5次，每孔加入 200μL ABTs substrate solution，室溫下孵育 30min，使用酶標儀檢測化合物在405nm處的吸光度值，計算抑制率，詳見圖6和表4。圖6中1為L13，2為L14，3為NVP（奈韋拉平）。

表4 對 HIV-1 逆轉錄酶活性的影響

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六、藥物對 HIV-1 病毒蛋白酶活性的影響。

采用蛋白酶檢測試劑盒體外檢測藥物對 HIV-1 病毒蛋白酶活性的影響。采用Pepstatin A作為陽性對照，濃度為2×10^-3mML，L13、L14部位提取物濃度為200 μg/mL，實驗設2個復孔。 向384孔板中加入用藥物（10μL/孔）和蛋白酶溶液（10μL/孔），溶劑對照組加入藥物和緩沖液，陽性對照孔加入蛋白酶溶液和緩沖液，室溫孵育15min后，每孔加入10μL蛋白酶底物溶液，酶標儀中輕微震蕩60s，室溫下避光孵育30min，檢測340nm/490nm處吸光值，計算樣品對逆轉錄酶的抑制率，詳見圖7和表5。圖7中1為L13，2為L14，3為Popstain A。

表5 體外檢測對 HIV-1 病毒蛋白酶活性的影響

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實施例4

柳蘭有效部位的片劑制備方法為：柳蘭正丁醇部位300mg和淀粉100mg混勻，加質量百分比濃度10%的淀粉糊40mg制成軟材，過篩得濕顆粒，干燥得干顆粒，整粒，加硬脂酸鎂4 mg混勻、壓片，即得。

實施例5

沖劑的制備方法：按重量份配比將柳蘭水相萃取部位5份、蔗糖1份、糊精3份混勻，加入適量體積百分比濃度95%乙醇溶液2~5份，邊加邊攪拌，制得軟材，將軟材干燥、過16目篩，分裝即得。

實施例6

微丸膠囊由以下重量份原料組成：柳蘭正丁醇部位30份、卵磷脂5份、牛黃膽酸鈉5份、微晶纖維素30份；

微丸膠囊的制備方法：按配比將柳蘭正丁醇部位、卵磷脂、牛黃膽酸鈉和微晶纖維素混均，倒入乙醇水溶液攪勻獲得軟材，將軟材倒入擠出機中擠出，經滾圓獲得顆粒，擠出轉速250r/min，滾圓轉速800r/min，滾圓時間20min，干燥、過24~30目篩獲得微丸，將微丸灌裝入膠囊殼內，即得。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術方案內容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍。