本發(fā)明涉及醫(yī)藥材料技術領域，具體涉及一種骨修復材料及其制備方法。

背景技術：

目前，每年我國的各種骨缺損病例可達到300萬例，且每年以10％的比例在增加，而其中骨缺損修復一直為骨科領域的難點，因此骨修復材料是解決這一問題的研究重點。

在各種骨移植支架材料中，顆粒狀或者塊狀的支架材料居多，這些材料不僅手術操作不便，而且在填充后與缺損之間的縫隙不易控制，彌合性差，最終延長骨缺損愈合的時間。

而以天然高分子材料為載體制備的骨修復材料具有可塑形、不松散、貼合性好的特點，其中透明質酸(HA)即是這樣一種理想的天然高分子材料。透明質酸是存在于生物組織中細胞外基質內的一種聚陰離子粘多糖，在空間上呈剛性的螺旋柱狀結構，其獨特的分子結構和理化性質在機體內顯示出多種良好的生理功能，具有潤滑關節(jié)、調節(jié)血管壁的通透性、調節(jié)蛋白質、水電解質擴散、促進細胞分化、促進創(chuàng)傷愈合等功能。由于其具有良好的生物安全性，近年來其在骨修復材料方面的應用逐漸受到人們的關注。

一般來說，理想的骨組織修復支架材料應該具備高孔隙率和較高的抗壓強度，生物大分子透明質酸的加入可以增加材料的孔隙率，在植入初期透明質酸快速降解，形成大量的孔隙，但是會影響材料的力學強度，使其抗壓強度不能滿足使用需求。目前，利用透明質酸制備兼具良好孔隙率和較高力學強度的骨修復材料是本領域的重點和難點。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種骨修復材料及其制備方法，以解決現(xiàn)有技術中的骨修復材料不能同時兼顧孔隙率和力學強度的問題。

第一方面，本發(fā)明提供一種骨修復材料的制備方法，所述方法包括：

將第一透明質酸鈉溶液與聚乙烯醇溶液混合，得到透明質酸鈉紡絲原液；

根據(jù)靜電紡絲法處理所述透明質酸鈉紡絲原液，得到一次交聯(lián)納米纖維膜；

將所述一次交聯(lián)納米纖維膜置于EDC溶液中反應，得到二次交聯(lián)納米纖維膜；

將所述二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆?；旌暇鶆蚝?，再與第二透明質酸鈉溶液混合，混合均勻后經(jīng)塑形、凍干和滅菌后，制備得到骨修復材料。

作為本發(fā)明第一方面的優(yōu)選方式，所述得到透明質酸鈉紡絲原液的步驟中，將濃度為1％的所述第一透明質酸鈉溶液與濃度為2％的所述聚乙烯醇溶液按照質量比為3:1～1:3的比例混合，得到濃度為1％的所述透明質酸鈉紡絲原液。

作為本發(fā)明第一方面的優(yōu)選方式，所述第一透明質酸鈉溶液中透明質酸鈉的分子量為60萬～120萬。

作為本發(fā)明第一方面的優(yōu)選方式，所述得到一次交聯(lián)納米纖維膜的步驟中，將所述透明質酸鈉紡絲原液加入到溶液供給裝置中，設置電紡電壓為15～25kV，溫度為30～50℃，流速為0.5～1.5mL/h，紡絲口與接收裝置之間的紡絲距離為15～25cm，接收裝置為平面銅箔板，啟動裝置進行靜電紡絲，經(jīng)過4～10小時后得到厚度為0.5～1mm的一次交聯(lián)納米纖維膜。

作為本發(fā)明第一方面的優(yōu)選方式，所述得到二次交聯(lián)納米纖維膜的步驟中，所述EDC溶液的濃度為0.01％～0.1％，所述一次交聯(lián)納米纖維膜與所述EDC溶液的質量比為1:20～1:1，反應時間為0.5～1.5小時。

作為本發(fā)明第一方面的優(yōu)選方式，所述二次交聯(lián)納米纖維膜碎片為在30～40℃下、經(jīng)真空烘干后裁切成的邊長為1mm的正方形碎片，所述無機骨顆粒的粒徑為0.1～2mm。

作為本發(fā)明第一方面的優(yōu)選方式，所述制備得到骨修復材料的步驟中，所述二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與所述無機骨顆粒按照質量比為1:1～1:10的比例混合，并在轉速為10～30r/min的條件下攪拌10分鐘至均勻。

作為本發(fā)明第一方面的優(yōu)選方式，所述制備得到骨修復材料的步驟中，將濃度為0.5～2％的所述第二透明質酸鈉溶液與所述二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和所述無機骨顆粒的混合物按照質量比為1:1～5:1的比例混合，并在轉速為30～60r/min的條件下攪拌20分鐘至均勻。

作為本發(fā)明第一方面的優(yōu)選方式，所述第二透明質酸鈉溶液中透明質酸鈉的分子量為60萬～120萬。

第二方面，本發(fā)明提供一種骨修復材料，其由第一方面所述的制備方法制備得到。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下有益效果：

(1)對由靜電紡絲法得到的一次交聯(lián)納米纖維膜進行二次交聯(lián)，二次交聯(lián)后得到的二次交聯(lián)納米纖維膜，可有效減緩降解速率，延長保形時間；同時其保持膜片形式，增強效果更好，可以有效減輕納米顆粒的團聚現(xiàn)象，使其在骨顆粒中分散的更均勻；

(2)未經(jīng)修飾的透明質酸鈉溶液和二次交聯(lián)納米纖維膜的聯(lián)合應用，相比于單純使用透明質酸鈉溶液，透明質酸鈉溶液在材料內部更能快速降解，在植入初期即可形成更多的內部通道，形成豐富的三維內聯(lián)孔結構，便于細胞營養(yǎng)液的滲入；同時，二次交聯(lián)納米纖維膜又可以滿足植入初期需要較大力學強度的要求；

(3)將具有良好細胞粘附性的透明質酸鈉高分子材料和天然無機骨顆粒復合，既具有良好的可塑性，又具有良好的引導骨組織再生性，還具有良好的手術操作性、細胞相容性和骨再生性。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例制備的骨修復材料的可塑形性照片；

圖2為本發(fā)明實施例制備的二次交聯(lián)納米纖維膜和骨修復材料的SEM照片；其中，圖2-1為二次交聯(lián)納米纖維膜的SEM照片，圖2-2為骨修復材料的SEM照片；

圖3為不同形式的透明質酸鈉對骨修復材料的抗壓強度對比圖；

圖4為本發(fā)明實施例制備的骨修復材料的孔隙結構分析圖；其中，圖4-1為骨修復材料的孔徑分布圖，圖4-2為骨修復材料的孔隙率分析圖；

圖5為本發(fā)明實施例制備的骨修復材料和對照組材料分別進行兔脊柱椎體間融合試驗24周后的試驗結果照片；其中，圖5-1為骨修復材料進行兔脊柱椎體間融合試驗24周后的試驗結果照片，圖5-2為對照組材料進行兔脊柱椎體間融合試驗24周后的試驗結果照片。

具體實施方式

為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權利要求的限制。

本發(fā)明實施例提供一種骨修復材料的制備方法，該方法包括：

S1、將第一透明質酸鈉溶液與聚乙烯醇溶液混合，得到透明質酸鈉紡絲原液；

S2、根據(jù)靜電紡絲法處理透明質酸鈉紡絲原液，得到一次交聯(lián)納米纖維膜；

S3、將一次交聯(lián)納米纖維膜置于EDC溶液中反應，得到二次交聯(lián)納米纖維膜；

S4、將二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆?；旌暇鶆蚝?，再與第二透明質酸鈉溶液混合，混合均勻后經(jīng)塑形、凍干和滅菌后，制備得到骨修復材料。

本發(fā)明提供的骨修復材料的制備方法，通過二次交聯(lián)的方式得到二次交聯(lián)納米纖維膜，其具有減緩降解速率、延長保形時間的功能，同時由于其具有膜片形式，能在骨顆粒中分散的更均勻。此外，還將未經(jīng)修飾的透明質酸鈉溶液和二次交聯(lián)納米纖維膜進行聯(lián)合應用，從而植入初期即可形成更多的內部通道，從而形成豐富的三維內聯(lián)孔結構，便于細胞營養(yǎng)液的滲入，又可以滿足植入初期需要較大力學強度的要求。

在上述實施例的基礎上，步驟S1中，將濃度為1％的第一透明質酸鈉溶液與濃度為2％的聚乙烯醇溶液按照質量比為3:1～1:3的比例混合，得到濃度為1％的透明質酸鈉紡絲原液。

一般地，得到的透明質酸鈉紡絲原液會在真空干燥器中進行脫泡處理，然后靜置。

該濃度下的透明質酸鈉紡絲原液，有利于后續(xù)的靜電紡絲過程的進行，可增強靜電紡納米纖維的柔順性。

其中，第一透明質酸鈉溶液中透明質酸的分子量為60萬～120萬。優(yōu)選該分子量的透明質酸，是由于該分子量區(qū)間的透明質酸鈉既具有足夠的粘度，又能保證在體內快速降解。本步驟中，第一透明質酸鈉溶液是未經(jīng)修飾的透明質酸鈉溶液。

在上述實施例的基礎上，步驟S2中，根據(jù)靜電紡絲法處理透明質酸鈉紡絲原液的具體過程可按照如下方式實施：將步驟S1中得到的透明質酸鈉紡絲原液加入到溶液供給裝置中，設置電紡電壓為15～25kV，溫度為30～50℃，流速為0.5～1.5mL/h，紡絲口與接收裝置之間的紡絲距離為15～25cm，接收裝置為平面銅箔板，啟動裝置進行靜電紡絲，經(jīng)過4～10小時后得到厚度為0.5～1mm的一次交聯(lián)納米纖維膜。

靜電紡絲技術能夠連續(xù)制備納米級或亞微米級超細纖維，具有比表面積大、連通性好、纖維形式增強、形態(tài)結構與細胞外基質類似等特點，可提供良好的細胞生長環(huán)境，在組織工程支架制備方面具有獨特的優(yōu)勢。

由于透明質酸鈉高分子材料特殊的單螺旋鎖水作用極大地限制了其在靜電紡絲過程中溶劑的揮發(fā)，未揮發(fā)的溶劑在收集板上會使得到的納米纖維相互溶解粘連在一起，不能得到纖維膜片，因此其容易團聚，不能均勻分散在其他材料中。

因此，本發(fā)明中先采用靜電紡絲法得到一次交聯(lián)納米纖維膜，然后進行二次交聯(lián)，得到的二次交聯(lián)納米纖維膜可有效減緩降解速率，延長保形時間，同時其可以保持膜片形式，增強效果更好，可以有效減輕納米顆粒的團聚現(xiàn)象，使其在骨顆粒中分散的更均勻。

利用靜電紡絲法處理透明質酸鈉紡絲原液時，嚴格控制溶液供給裝置中的各個參數(shù)，如電紡電壓、溫度、流速、紡絲口與接收裝置之間的紡絲距離等，并將接收裝置設置為平面銅箔板，更有利于獲得連續(xù)的、尺寸均一、缺陷可控的納米纖維，最終可得到厚度為0.5～1mm的一次交聯(lián)納米纖維膜。

在上述實施例的基礎上，步驟S3中，EDC溶液的濃度為0.01％～0.1％，一次交聯(lián)納米纖維膜與EDC溶液的質量比為1:20～1:1，反應時間為0.5～1.5小時。

一般地，在該步驟中，優(yōu)選將一次交聯(lián)納米纖維膜的四角夾持固定，然后浸沒在EDC溶液中進行二次交聯(lián)反應，反應結束后再浸漬在純化水中清洗2～5小時，清洗時每隔1小時需更換清洗液。本發(fā)明中，EDC指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺。

進行二次交聯(lián)反應，有利于提高納米纖維膜的保形性，膜片形式的納米纖維可以更好的提升增強效果。

在上述實施例的基礎上，步驟S4中，所用的二次交聯(lián)納米纖維膜碎片為在30～40℃下、經(jīng)真空烘干后裁切成的邊長為1mm的正方形碎片，所用的無機骨顆粒的粒徑為0.1～2mm。

將二次交聯(lián)納米纖維膜真空干燥后裁切成邊長為1mm的正方形碎片，與無機骨顆粒的粒徑范圍保持一致，從而能更好地與無機骨顆?；旌?，降低團聚現(xiàn)象。

在上述實施例的基礎上，步驟S4中，所述二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆粒按照質量比為1:1～1:10的比例混合，并在轉速為10～30r/min的條件下攪拌10分鐘至均勻。

在此質量比下，既能充分保證骨修復所需的有效成分無機骨顆粒所占的比例，同時又可保證無機骨顆粒之間充填充足的具有良好力學增強作用的二次交聯(lián)納米纖維膜碎片，降解較慢的二次交聯(lián)納米纖維膜，起到持續(xù)增強的作用。將二者混合時，控制轉速為10～30r/min，能夠防止較大的剪切力使無機骨顆粒和二次交聯(lián)納米纖維膜碎片發(fā)生破碎，同時又能夠使二者充分混合。

在上述實施例的基礎上，步驟S4中，將濃度為0.5～2％的第二透明質酸鈉溶液與二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和無機骨顆粒的混合物按照質量比為1:1～5:1的比例混合，并在轉速為30～60r/min的條件下攪拌20分鐘至均勻。

本步驟中，第二透明質酸鈉溶液也是未經(jīng)修飾的透明質酸鈉溶液。在此質量比下，有利于發(fā)揮第二透明質酸鈉溶液的塑形作用，增強手術操作的便捷性，并促進在植入初期形成適宜的孔隙率，增強細胞營養(yǎng)液的滲入。將二者混合時，控制轉速為30～60r/min，能夠使得第二透明質酸鈉溶液充分地填入二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和無機骨顆粒之間，使得未經(jīng)修飾的第二透明質酸鈉溶液將二者充分包裹。

在上述實施例的基礎上，步驟S4中，第二透明質酸鈉溶液中透明質酸鈉的分子量為60萬～120萬。

第二透明質酸鈉溶液的濃度優(yōu)選為0.5～2％，可以使得其中的透明質酸鈉具有較佳的流動性，混合更加充分。并且，其中透明質酸鈉的分子量優(yōu)選為60萬～120萬，其目的在于在特定的添加比例范圍內，最大程度發(fā)揮其粘性，并在植入體內后快速降解。

步驟S4中，三者混合均勻后，裝進不銹鋼多孔塑形模具中塑形。然后將該塑形模具放入凍干機中，再在-80℃下預凍2小時，經(jīng)過18小時的冷凍干燥后通過環(huán)氧乙烷滅菌，即制備得到塊狀骨修復材料。

本發(fā)明實施例提供一種骨修復材料，其由上述實施例中所述的制備方法制備得到。

制備得到的骨修復材料參照圖1所示，該骨修復材料具有良好的可塑性，又具有良好的引導骨組織再生性，還具有良好的手術操作性、細胞相容性和骨再生性，其孔隙率和強度均可以滿足要求。

為了進一步理解本發(fā)明，下面結合具體實施例對本發(fā)明提供的骨修復材料及其制備方法進行具體描述。

實施例一

(1)將濃度為1％的第一透明質酸鈉溶液與濃度為2％的聚乙烯醇溶液按照質量比為3:1的比例混合，配制成濃度為1％的透明質酸鈉紡絲原液，并利用真空干燥器進行脫泡處理，靜置；其中，第一透明質酸鈉溶液中所用的透明質酸鈉的分子量為60萬；

(2)將上述步驟中得到的透明質酸鈉紡絲原液加入到10ml的溶液供給裝置中，設置電紡電壓為25kV，溫度為30℃，流速為0.5mL/h，紡絲口與接收裝置之間的距離為25cm，接收裝置為平面銅箔版，啟動裝置進行靜電紡絲，經(jīng)過4小時后得到厚度為0.5mm的一次交聯(lián)納米纖維膜；

(3)將上述步驟中得到的一次交聯(lián)納米纖維膜的四角夾持固定，并浸沒在濃度為0.01％的EDC溶液中進行二次交聯(lián)反應，其中一次交聯(lián)納米纖維膜與EDC溶液的質量比為1:20，反應0.5小時，然后浸漬在純化水中清洗5小時，清洗時每隔1小時需更換清洗液，得到二次交聯(lián)納米纖維膜；

(4)將上述步驟中得到的二次交聯(lián)納米纖維膜在30～40℃條件下，經(jīng)真空烘干后，裁切成邊長為1mm的正方形碎片；

(5)篩選粒徑為0.1～2mm的無機骨顆粒，將二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆粒按照質量比為1:1的比例混合，并在轉速為10r/min的條件下攪拌10分鐘至均勻；

(6)將濃度為2％的第二透明質酸鈉溶液與二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和無機骨顆粒的混合物按照質量比為5:1的比例混合，并在轉速為30r/min的條件下攪拌20分鐘至均勻；其中，第二透明質酸鈉溶液中所用的透明質酸鈉的分子量為120萬；

(7)將上述步驟中得到的混合物裝進不銹鋼多孔塑形模具中塑形，然后將該塑形模具放入凍干機中，再在-80℃下預凍2小時，經(jīng)過18小時的冷凍干燥后通過環(huán)氧乙烷滅菌，即制備得到塊狀骨修復材料。

實施例二

(1)將濃度為1％的第一透明質酸鈉溶液與濃度為2％的聚乙烯醇溶液按照質量比為1:3的比例混合，配制成濃度為1％的透明質酸鈉紡絲原液，并利用真空干燥器進行脫泡處理，靜置；其中，第一透明質酸鈉溶液中所用的透明質酸的分子量為120萬；

(2)將上述步驟中得到的透明質酸鈉紡絲原液加入到10ml的溶液供給裝置中，設置電紡電壓為15kV，溫度為50℃，流速為1.5mL/h，紡絲口與接收裝置之間的距離為15cm，接收裝置為平面銅箔版，啟動裝置進行靜電紡絲，經(jīng)過10小時后得到厚度為1mm的一次交聯(lián)納米纖維膜；

(3)將上述步驟中得到的一次交聯(lián)納米纖維膜的四角夾持固定，并浸沒在濃度為0.1％的EDC溶液中進行二次交聯(lián)反應，其中一次交聯(lián)納米纖維膜與EDC溶液的質量比為1:10，反應1.5小時，然后浸漬在純化水中清洗2小時，清洗時每隔1小時需更換清洗液，得到二次交聯(lián)納米纖維膜；

(4)將上述步驟中得到的二次交聯(lián)納米纖維膜在30～40℃條件下，經(jīng)真空烘干后，裁切成邊長為1mm的正方形碎片；

(5)篩選粒徑為0.1～2mm的無機骨顆粒，將二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆粒按照質量比為1:10的比例混合，并在轉速為30r/min的條件下攪拌10分鐘至均勻；

(6)將濃度為2％的第二透明質酸鈉溶液與二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和無機骨顆粒的混合物按照質量比為1:1的比例混合，并在轉速為60r/min的條件下攪拌20分鐘至均勻；其中，第二透明質酸鈉溶液中透明質酸鈉的分子量為60萬；

(7)將上述步驟中得到的混合物裝進不銹鋼多孔塑形模具中塑形，然后將該塑性模具放入凍干機中，再在-80℃下預凍2小時，經(jīng)過18小時的冷凍干燥后通過環(huán)氧乙烷滅菌，即制備得到塊狀骨修復材料。

實施例三

(1)將濃度為1％的第一透明質酸鈉溶液與濃度為2％的聚乙烯醇溶液按照質量比為2.5:1的比例混合，配制成濃度為1％的透明質酸鈉紡絲原液，并利用真空干燥器進行脫泡處理，靜置；其中，第一透明質酸鈉溶液中所用的透明質酸的分子量為80萬；

(2)將上述步驟中得到的透明質酸鈉紡絲原液加入到10ml的溶液供給裝置中，設置電紡電壓為18kV，溫度為45℃，流速為0.8mL/h，紡絲口與接收裝置之間的距離為20cm，接收裝置為平面銅箔版，啟動裝置進行靜電紡絲，經(jīng)過6小時后得到厚度為0.85mm的一次交聯(lián)納米纖維膜；

(3)將上述步驟中得到的一次交聯(lián)納米纖維膜的四角夾持固定，并浸沒在濃度為0.04％的EDC溶液中進行二次交聯(lián)反應，其中一次交聯(lián)納米纖維膜與EDC溶液的質量比為1:20，反應1小時，然后浸漬在純化水中清洗3.5小時，清洗時每隔1小時需更換清洗液，得到二次交聯(lián)納米纖維膜；

(4)將上述步驟中得到的二次交聯(lián)納米纖維膜在30～40℃條件下，經(jīng)真空烘干后，裁切成邊長為1mm的正方形碎片；

(5)篩選粒徑為0.1～2mm的無機骨顆粒，將二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆粒按照質量比為1:2的比例混合，并在轉速為25r/min的條件下攪拌10分鐘至均勻；

(6)將濃度為0.8％第二透明質酸鈉溶液與二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和無機骨顆粒的混合物按照質量比為1:3的比例混合，并在轉速為42r/min的條件下攪拌20分鐘至均勻；其中，第二透明質酸鈉溶液中透明質酸鈉的分子量為95萬；

(7)將上述步驟中得到的混合物裝進不銹鋼多孔塑形模具中塑形，然后將該塑形模具放入凍干機中，再在-80℃下預凍2小時，經(jīng)過18小時的冷凍干燥后通過環(huán)氧乙烷滅菌，即制備得到塊狀骨修復材料。

實施例四

(1)將濃度為1％的第一透明質酸鈉溶液與濃度為2％的聚乙烯醇溶液按照質量比為1:1的比例混合，配制成濃度為1％的透明質酸鈉紡絲原液，并利用真空干燥器進行脫泡處理，靜置；其中，第一透明質酸鈉溶液中所用的透明質酸的分子量為80萬；

(2)將上述步驟中得到的透明質酸鈉紡絲原液加入到10ml的溶液供給裝置中，設置電紡電壓為20kV，溫度為30℃，流速為1.0mL/h，紡絲口與接收裝置之間的距離為20cm，接收裝置為平面銅箔版，啟動裝置進行靜電紡絲，經(jīng)過7小時后得到厚度為0.8mm的一次交聯(lián)納米纖維膜；

(3)將上述步驟中得到的一次交聯(lián)納米纖維膜的四角夾持固定，并浸沒在濃度為0.05％的EDC溶液中進行二次交聯(lián)反應，其中一次交聯(lián)納米纖維膜與EDC溶液的質量比為1:1，反應0.7小時，然后浸漬在純化水中清洗4小時，清洗時每隔1小時需更換清洗液，得到二次交聯(lián)納米纖維膜；

(4)將上述步驟中得到的二次交聯(lián)納米纖維膜在30～40℃條件下，經(jīng)真空烘干后，裁切成邊長為1mm的正方形碎片；

(5)篩選粒徑為0.1～2mm的無機骨顆粒，將二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆粒按照質量比為1:5的比例混合，并在轉速為20r/min的條件下攪拌10分鐘至均勻；

(6)將濃度為1.0％第二透明質酸鈉溶液與二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和無機骨顆粒的混合物按照質量比為3:1的比例混合，并在轉速為40r/min的條件下攪拌20分鐘至均勻；其中，第二透明質酸鈉溶液中透明質酸鈉的分子量為80萬；

(7)將上述步驟中得到的混合物裝進不銹鋼多孔塑形模具中塑形，然后將該塑形模具放入凍干機中，再在-80℃下預凍2小時，經(jīng)過18小時的冷凍干燥后通過環(huán)氧乙烷滅菌，即制備得到塊狀骨修復材料。

實施例五

(1)將濃度為1％的第一透明質酸鈉溶液與濃度為2％的聚乙烯醇溶液按照質量比為1:2.2的比例混合，配制成濃度為1％的透明質酸鈉紡絲原液，并利用真空干燥器進行脫泡處理，靜置；其中，第一透明質酸鈉溶液中所用的透明質酸的分子量為60萬；

(2)將上述步驟中得到的透明質酸鈉紡絲原液加入到10ml的溶液供給裝置中，設置電紡電壓為21kV，溫度為35℃，流速為1.2mL/h，紡絲口與接收裝置之間的距離為18cm，接收裝置為平面銅箔版，啟動裝置進行靜電紡絲，經(jīng)過5小時后得到厚度為0.9mm的一次交聯(lián)納米纖維膜；

(3)將上述步驟中得到的一次交聯(lián)納米纖維膜的四角夾持固定，并浸沒在濃度為0.0.02％的EDC溶液中進行二次交聯(lián)反應，其中一次交聯(lián)納米纖維膜與EDC溶液的質量比為1:5，反應0.5小時，然后浸漬在純化水中清洗3小時，清洗時每隔1小時需更換清洗液，得到二次交聯(lián)納米纖維膜；

(4)將上述步驟中得到的二次交聯(lián)納米纖維膜在30～40℃條件下，經(jīng)真空烘干后，裁切成邊長為1mm的正方形碎片；

(5)篩選粒徑為0.1～2mm的無機骨顆粒，將二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆粒按照質量比為1:8的比例混合，并在轉速為15r/min的條件下攪拌10分鐘至均勻；

(6)將濃度為1.5％第二透明質酸鈉溶液與二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和無機骨顆粒的混合物按照質量比為4:1的比例混合，并在轉速為35r/min的條件下攪拌20分鐘至均勻；其中，第二透明質酸鈉溶液中透明質酸鈉的分子量為60萬；

(7)將上述步驟中得到的混合物裝進不銹鋼多孔塑形模具中塑形，然后將該塑形模具放入凍干機中，再在-80℃下預凍2小時，經(jīng)過18小時的冷凍干燥后通過環(huán)氧乙烷滅菌，即制備得到塊狀骨修復材料。

實施例六

(1)將濃度為1％的第一透明質酸鈉溶液與濃度為2％的聚乙烯醇溶液按照質量比為1:1.5的比例混合，配制成濃度為1％的透明質酸鈉紡絲原液，并利用真空干燥器進行脫泡處理，靜置；其中，第一透明質酸鈉溶液中所用的透明質酸的分子量為95萬；

(2)將上述步驟中得到的透明質酸鈉紡絲原液加入到10ml的溶液供給裝置中，設置電紡電壓為17kV，溫度為40℃，流速為0.9mL/h，紡絲口與接收裝置之間的距離為15cm，接收裝置為平面銅箔版，啟動裝置進行靜電紡絲，經(jīng)過9小時后得到厚度為0.75mm的一次交聯(lián)納米纖維膜；

(3)將上述步驟中得到的一次交聯(lián)納米纖維膜的四角夾持固定，并浸沒在濃度為0.08％的EDC溶液中進行二次交聯(lián)反應，其中一次交聯(lián)納米纖維膜與EDC溶液的質量比為1:0，反應0.5小時，然后浸漬在純化水中清洗3小時，清洗時每隔1小時需更換清洗液，得到二次交聯(lián)納米纖維膜；

(4)將上述步驟中得到的二次交聯(lián)納米纖維膜在30～40℃條件下，經(jīng)真空烘干后，裁切成邊長為1mm的正方形碎片；

(5)篩選粒徑為0.1～2mm的無機骨顆粒，將二次交聯(lián)納米纖維膜碎片與無機骨顆粒按照質量比為1:2.5的比例混合，并在轉速為15r/min的條件下攪拌10分鐘至均勻；

(6)將濃度為2.5％的第二透明質酸鈉溶液與二次交聯(lián)納米纖維膜碎片和無機骨顆粒的混合物按照質量比為2.8:1的比例混合，并在轉速為55r/min的條件下攪拌20分鐘至均勻；其中，第二透明質酸鈉溶液中透明質酸鈉的分子量為95萬；

(7)將上述步驟中得到的混合物裝進不銹鋼多孔塑形模具中塑形，然后將該塑形模具放入凍干機中，再在-80℃下預凍2小時，經(jīng)過18小時的冷凍干燥后通過環(huán)氧乙烷滅菌，即制備得到塊狀骨修復材料。

對上述實施例中制備的骨修復材料及其制備過程中的中間產(chǎn)物的各項性能進行評價，具體如下：

(1)對上述實施例一制備的二次交聯(lián)納米纖維膜和骨修復材料進行電子掃描，參照圖2所示，其中圖2-1為二次交聯(lián)納米纖維膜的SEM照片，圖2-2為骨修復材料的SEM照片。從圖2-1中可以看出，二次交聯(lián)后透明質酸鈉呈纖維狀縱橫網(wǎng)狀分布，并相互纏繞，這種結構有利于力學性能的提高；從圖2-2中可以看出，未經(jīng)修飾的透明質酸鈉及二次交聯(lián)納米纖維膜分布在無機骨顆粒之間，包裹并連接著無機骨顆粒，從而可增強其可塑形性和力學強度，并且未經(jīng)修飾的透明質酸鈉提供了充足的疏松網(wǎng)狀結構，有利于組織液的快速滲入。

(2)對不同形式的透明質酸鈉對骨修復材料的抗壓強度的影響進行分析，參照圖3所示。從圖3中可以看出，單純的未經(jīng)修飾的透明質酸鈉溶液與無機骨顆?；旌虾螅箟簭姸容^低；交聯(lián)透明質酸鈉與無機骨顆?；旌虾?，抗壓強度有所提高，但是效果有限；未經(jīng)修飾的透明質酸鈉凝膠經(jīng)靜電紡絲處理后與無機骨顆粒混合，微觀的納米結構有助于材料力學性能的提高，但其呈凝膠狀，增強效果仍然不佳；上述實施例二制備的骨修復材料，充分利用了納米纖維膜的優(yōu)點，纖維間相互作用力增加，增強了無機相和有機相之間的結合，使得抗壓強度大幅度提高。

(3)對上述實施例一制備的骨修復材料的孔隙結構進行分析，參照圖4所示，其中圖4-1為骨修復材料的孔徑分布圖，圖4-2為骨修復材料的孔隙率分析圖。從圖4-1中可以看出，該骨修復材料具有天然骨的二級孔分布，分別為微米級和納米級，其中微米級孔有利于細胞遷移，納米級孔有利于組織液滲入；從圖4-2中可以看出，該骨修復材料具有較高的孔面積，其孔面積達89％，孔隙率高達80％，與天然骨組織的孔隙率十分接近，較高的孔隙率得益于疏松的未經(jīng)修飾的透明質酸鈉、網(wǎng)狀的二次交聯(lián)納米纖維膜和多孔結構的無機骨顆粒三者的復合。

(4)將上述實施例一制備的骨修復材料應用于兔脊柱椎體間融合，以人工羥基磷灰石顆粒作為對照組，術后24周取材Masson三色染色。參照圖5所示，其中圖5-1為骨修復材料進行兔脊柱椎體間融合試驗24周后的試驗結果照片，圖5-2為對照組材料進行兔脊柱椎體間融合試驗24周后的試驗結果照片。從圖5中可以看出，試驗組材料周圍的新生骨的礦化程度遠高于對照組，試驗組形成了大面積的成熟的板層骨，說明本發(fā)明制備的骨修復材料具有優(yōu)異的骨修復性能，且生物相容性良好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。