本發(fā)明涉及一種增加胰島素敏感性的組合物，該組合物由蠶沙10～20％、桑白皮50～55％、桑葉25～40％混合提取。

背景技術(shù)：

桑樹是多年生的?？粕僦参?，在亞洲、歐洲、北美、南美、非洲及印度的熱帶、亞熱帶、溫帶等廣泛分布，在我國東南部浙江、江蘇等省蠶養(yǎng)殖基地多有種植，含有豐富的黃酮類物質(zhì)。桑白皮提取物來自?？粕僦参锏母稍锔?，冬季采挖，洗凈，趁新鮮刮去背棕色栓皮，分離皮部與木心，剝?nèi)“灼?，曬干。多項研究證實，桑白皮提取物(mori cortex extract)具有多種藥用功效，包括抗炎、抗肝癌作用，如通過抑制微管組裝誘導(dǎo)癌細胞凋亡，消除包括支氣管炎在內(nèi)的肺部炎癥。桑白皮提取物通過糖皮質(zhì)激素受體的雙向磷酸化對海馬具有抗抑郁作用。桑白皮提取物桑黃酮G還可作為口腔致齲菌的抗菌劑。

桑白皮的主要化學(xué)成分有黃酮類、香豆素類、多糖類、以及其它化合物。黃酮類主要包括桑素、環(huán)桑色烯素、桑皮素、環(huán)桑皮素、桑色烯、羥基二氫桑根皮素、桑酮A～V、桑皮根素氫過氧化物、桑根皮素-4-葡萄糖、環(huán)桑色醇、二氫黃酮類桑根酮化合物A、桑苷A-D、桑根皮醇、5，7-二羥基色酮、摩查爾酮A等。香豆素包括東莨菪素、5，7-羥基香豆素、東莨菪內(nèi)酯(6-甲氧基-7-羥基-香豆素)、傘形花內(nèi)脂。多糖類包括殼聚糖、甲殼素、粘液素、桑多糖。其它化合物還包括桑糖苷元A、1-脫氧野尻霉素、二苯乙烯苷類化合物、桑辛素(A、B、C、D、F、G)、丁醇、苷類衍生物、鞣質(zhì)、谷甾醇、樺皮酸、揮發(fā)油、胡蘿卜苷、齊墩果酸、熊果酸、3-甲氧基-4-羥基-苯甲醛等。

劉曉雯等研究報道，桑白皮的醇提液能抑制腸上皮的蔗糖酶活性，延緩單糖的吸收，從而降低餐后血糖的迅速升高；Hikino等研究發(fā)現(xiàn)了桑白皮具有降糖活性另一成分moran A的糖蛋白可以明顯降低正常小鼠和四氧嘧啶誘導(dǎo)所致糖尿病小鼠的血糖水平；周鋒等用高脂飲食配以腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，探討桑白皮總黃酮的降糖作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑白皮總黃酮能降低2型糖尿病大鼠的血糖和甘油三酯水平，具有抗糖尿病和調(diào)節(jié)血脂的作用；鐘國連等用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，灌胃給藥桑白皮水提取液研究它對糖尿病大鼠糖脂代謝的影響，發(fā)現(xiàn)對實驗性糖尿病大鼠具有降血糖作用，但對血脂無影響；汪寧等研究發(fā)現(xiàn)，桑白皮水提取液在沒有胰島素作用的情況下，促進HepG₂肝細胞對葡萄糖的消耗，對低劑量胰島素接到的HepG₂細胞糖攝取有輔助增強的作用。馬松濤等用桑白皮提取物灌胃給四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，給藥一段時間后，結(jié)果顯示對糖尿病大鼠的神經(jīng)病變有明顯的改善作用，可增加神經(jīng)髓鞘周圍橫斷面的面積，減輕水腫，并可降低MDA含量，增加SOD活性，緩解糖尿病大鼠周圍神經(jīng)早期的病變；同時發(fā)現(xiàn)，桑白皮提取物可增加坐骨神經(jīng)突觸素含量，改善或增加大鼠坐骨神經(jīng)的感覺及運動傳導(dǎo)速度，縮短潛伏期；另外，桑白皮提取物可提高鈉鉀泵酶的活性，增加坐骨神經(jīng)cGMP、cAMP的含量，對糖尿病神經(jīng)病變具有一定的防治作用。

蠶沙富含葉綠素、果膠、類黃酮、粗蛋白，以及部分人體必需的微量元素等有效成分。有關(guān)蠶沙化學(xué)成分的研究一直在不斷的深入《中華本草》記載：蠶沙含葉綠素衍生物，包括脫鎂葉綠素a及b，13-羥基脫鎂葉綠素a及b，10-羥基脫鎂葉綠素a等?！吨兴幋筠o典》歸納：蠶沙含有機物83.77～90.44％，灰分9.56～16.23％，總氮量1.91～3.60％，植物醇0.25～0.29％。還含有葉綠素，游離氨基酸，不皂化成分β-谷甾醇、膽甾醇、麥角甾醇和廿四醇、蛇麻脂醇，β-谷甾醇-β-葡萄糖甙，銅元素，大量胡蘿卜素和維生素B以及植物生長激素-雜茁長素。顏新培等總結(jié)：蠶沙含70粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、無氮浸出物、灰分、水等，還含葉綠素、類胡蘿卜素、果膠、葉蛋白等；蠶沙中還含有三十烷醇，維生素A、B、D，茄呢醇，蠶沙酮，β-谷甾-D-葡萄糖，羽扁豆醇，麥角甾醇，谷甾醇，膽甾醇，二十四醇，蛇麻脂醇，游離氨基酸13種，植物生長激素、雜茁長素及銅等人體必需的微量元素。魏克民等報道：蠶沙中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，現(xiàn)代研究表明，風(fēng)干后的春蠶沙中含有13.6％的粗蛋白、3.7％的脂肪、12.5％的粗纖維、75無氮浸出物48.7％，灰分12.6％，鈣3.2％。蠶沙中除含豐富的的葉綠素外，還有類胡蘿卜素、果膠、葉蛋白等成分以及磷、鉀、硅、鎂等營養(yǎng)元素。崔錫強等從60％乙醇提取物的醋酸乙酯部位中，首次分離出scopoletin、umbelliferone、二氫尿嘧啶、尿嘧啶、blumenol-A、loliolide、苯甲酸、9，16-dioxo-10，12，14-octadecatrienoicacid。周光雄等應(yīng)用大孔樹脂、離子交換樹脂、葡聚糖凝膠等多種柱層析手段分離純化生物堿成分，用質(zhì)譜和核磁等光譜方法確定化合物的結(jié)構(gòu)，首次分離出1-脫氧野尻霉素、fagomine和3-epifagomine生物堿成分。崔錫強等應(yīng)用色譜技術(shù)分離純化技術(shù)，首次從蠶沙95％乙醇提取物中醋酸乙酯部分，分離出3S，5R-dihydroxy-6R，7-megstigmadien-9-one，3S，5R-dihydroxy-6S，7-megstigmadien-9-one，(6R，9R)-3-oxo-α-ionolβ-D-glucopyranoside，(6R，9S)-3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranoside，blumenol C glucoside，byzantionoside B，alangionoside L等一系列倍半萜及其苷類化合物；在脂溶性部分還分離得到了化合物葉黃素；從水部分分離得到水溶性成分化合物哌可啉酸，甜菜堿，丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸。

自古以來，中醫(yī)就將桑葉作為治療消渴癥(即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的糖尿病)的中藥應(yīng)用于臨床，日本古書《吃茶養(yǎng)生記》也記載桑葉有改善“飲水病”(即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的糖尿病)的作用。國內(nèi)外研究資料證實，生物堿和多糖是桑葉中主要的降血糖成分。

桑葉的降血糖作用是通過兩個途徑實現(xiàn)的：一是通過生物堿DNJ(1-脫氧野尻霉素)對二糖類分解酶活性產(chǎn)生抑制作用，從而抑制小腸對雙糖的吸收，降低食后血糖的高峰值；二是通過桑葉生物堿fagomine及桑葉多糖促進β細胞分必胰島素，而胰島素可以促進細胞對糖的利用、肝糖原合成以及改善糖代謝，最終達到降血糖的效果。

綜上所述，蠶沙、桑白皮以及桑葉都具有降低血糖的作用，但是由于它們的成分復(fù)雜，具體是由哪種成分通過怎樣的機理來發(fā)揮降糖作用并不清楚。然后在治療糖尿病過程中，低血糖通常是治療糖尿病的并發(fā)癥，低血糖對人體是有害的，尤其是對老年病人，低血糖的危害更甚于高血糖。低血糖的危害主要有：1、低血糖時，體內(nèi)的腎上腺素、糖皮質(zhì)激素、胰高血糖素及生長激素等升糖激素增加，導(dǎo)致反應(yīng)性交血糖(蘇木杰效應(yīng))，造成血糖波動，病情加重；2、長期反復(fù)嚴重的低血糖發(fā)作可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損害，引起病人性格變異，精神失常、癡呆等；3、低血糖還可以刺激心血管系統(tǒng)，促發(fā)心律失常、心肌梗塞、腦卒中等；4、低血糖昏迷過久未被發(fā)現(xiàn)可造成死亡。

另外，不同的提取方法，對于從蠶沙、桑白皮以及桑葉中提取的物質(zhì)種類有很大的差異，雖然不同的報道多有顯示蠶沙、桑白皮以及桑葉的提取物都有一定程度的降糖功效，但是對于三者混合后的提取物及提取方法均未有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人經(jīng)過創(chuàng)造性地試驗和堅持不懈地努力，發(fā)現(xiàn)了一種新的提取物對于增加胰島素的敏感性及降低血糖有顯著的效果。本發(fā)明的目的在于提供一種新的增加胰島素敏感性的組合物，所述組合物是由蠶沙10～20％、桑白皮50～55％、桑葉25～40％混合后提取所得。

本發(fā)明的蠶沙是指蠶糞，除沙時混入的桑葉、蛻皮或其它雜物已經(jīng)被分離。本發(fā)明的桑白皮是?？浦参锷orus alba L.的干燥根皮，也可以是桑樹根部的干燥物。本發(fā)明的桑葉同樣來自?？浦参锷orus alba L.的樹葉，采收后曬干備用。

上述原料可從農(nóng)家采購或者自備，上述原料蠶沙、桑白皮、桑葉干燥后，粉碎成干燥粉末。上述干燥粉末的混合比例為蠶沙10～20％、桑白皮50～55％、桑葉25～40％。

一種增加胰島素敏感性的組合物的提取方法，包括以下步驟：

粉碎步驟，將蠶沙、桑白皮、桑葉分別干燥后，粉碎成干燥粉末；

混合步驟，將上述蠶沙10～20％、桑白皮50～55％、桑葉25～40％的干燥粉末攪拌混勻，得到混合物；

浸提步驟，將上述混合物與提取溶液混合，所述提取溶液是含水量40～60％的1，3-丁二醇，將混合液置于水浴中攪拌提取，所述水浴溫度為80～95℃；

過濾步驟，將浸提后的混合液過濾得到濾液，并使用NaOH將pH值調(diào)至10；

濃縮步驟，上述濾液減壓濃縮至原濃度的20～50％；

離子交換樹脂處理步驟，將上述濃縮液通過膜處理或離子交換樹脂，得到組合物原液；

干燥步驟，將上述組合物混合液干燥，得褐色粉末。

附圖說明

圖1各組大鼠血清中總膽固醇TC的比較。

圖2各組大鼠血清中甘油三酯TG的比較。

圖3OGTT實驗在0，30，60，120min時的血糖情況。

圖4OGTT實驗曲線下面積AUC的統(tǒng)計結(jié)果。

具體實施方式

實施例1

本發(fā)明的蠶沙、桑白皮、桑葉來自于浙江省北部地區(qū)的蠶農(nóng)，將從農(nóng)戶處收購的蠶沙、桑白皮、桑葉用去離子水洗凈，置于30℃干燥箱中過夜，得到干燥品后，用研缽或者粉碎機研碎至粉末或微小顆粒。然后分別稱取蠶沙200g、桑白皮500g、桑葉300g混合均勻，加入到裝有5L提取溶液的大燒瓶中，所述提取溶液是含水量50％的1，3-丁二醇。

將水浴溫度設(shè)定到85℃，攪拌浸提48小時，然后用濾紙過濾(whatman公司)，得濾液3.72L。用1M NaOH溶液，將濾液pH值調(diào)至10。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，常溫下將濾液減壓濃縮至800ml。將得到的濃縮液上HPD400A大孔樹脂柱吸附，樹脂柱的填充量為5Kg，徑高比為1：4，反復(fù)上樣3次，靜止吸附60分鐘。

先用4倍柱體積的去離子水淋洗樹脂柱；再用8倍柱體積的20％堿性乙醇(NaOH，pH＝10)淋洗；然后用3倍柱體積的20％乙醇淋洗至中性；用6倍柱體積60％乙醇將樹脂上吸附的提取物洗脫。

將洗脫也減壓蒸餾回收乙醇，然后進行真空干燥，并將干燥后的固體粉碎過100目篩，得到102.1g提取物，記作組合物A。

實施例2

按照實施例1的方法，分別使用1,000g的蠶沙、桑白皮、桑葉進行提取，最后分別得到78.4g組合物B、104.3g組合物C、以及112.8g組合物D。

實施例3組合物增加胰島素敏感性的效果測定

1.II型糖尿病模型制作

將高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠空腹12h，以30mg/kg的劑量一次性腹腔注射1％鏈脲佐菌素(用pH為4.2～4.4的0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解，使用前配制)，標(biāo)準(zhǔn)飲食組同步于腹腔注射等劑量的檸檬酸鈉緩沖液。72h后STZ注射的大鼠剪尾尖靜脈取血用空腹血糖(FBG，mmol/L)進行評估，一觸式血糖儀測FBG，以血糖值≥13.8mmol/L為大鼠制模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

2.組合物治療

第12～20周治療階段對糖尿病治療組實施本發(fā)明組合物A、B、C、D治療。提取物的灌胃劑量為10g/kg·d。為做好對照，其余大鼠也采用灌胃方式給予等體積生理鹽水。

3.血糖測定

各組動物在實驗期間每周在同一時刻測FBG一次，測FBG前將大鼠禁食不禁水12h，次日鼠尾尖靜脈取血，用一觸式血糖儀測定血糖濃度并做好相關(guān)記錄。

4.口服葡萄糖耐量試驗

于治療階段結(jié)束時進行口服糖耐量試驗(OGTT)。空腹12h大鼠尾尖靜脈采血測空腹血糖值記為0h的血糖值。之后按2.0g/kg劑量用50％糖溶液進行灌胃，分別于30min、60min、120min取尾尖靜脈血測血糖。實驗結(jié)束后繪制5個組大鼠OGTT曲線，橫坐標(biāo)為時間(min)，縱坐標(biāo)為血糖濃度(mmol/L)。并計算曲線下面積(area under curve，AUC)來判斷糖耐量狀態(tài)。

AUC(h.mmol/L)＝1/4×0h+1/2×0.5h+3/4×1h+2h。 (公式1)

實驗過程

30只雄性SD大鼠在動物房自由飲食飲水以適應(yīng)新環(huán)境，為期1周。隨機分成N(正常組)、M(糖尿病組)、M+A(糖尿病治療組，投入本發(fā)明的提取物A)、M+B(糖尿病治療組，投入本發(fā)明的提取物B)、M+C(糖尿病治療組，投入本發(fā)明的提取物C)、M+D(糖尿病治療組，投入本發(fā)明的提取物D)6個實驗組，每組5只。N組全程普通飼料飼養(yǎng)，M(糖尿病組)、M+A(糖尿病治療組)、M+B(糖尿病治療組)、M+C(糖尿病治療組)、M+D(糖尿病治療組)高脂階段持續(xù)12周，然后腹腔注射1％STZ(30mg/kg)，為消除變量影響以同樣方式給N組大鼠注射等量的檸檬酸緩沖液。72h后STZ注射的大鼠剪尾尖靜脈取血用空腹血糖(FBG，mmol/L)進行評估，一觸式血糖儀測FBG，以血糖值≥13.8mmol/L為大鼠制模成功的標(biāo)準(zhǔn)。制模成功后治療組進入治療階段，分別使用提取物A、B、C、D組合物的水溶液(10g/kg·d)進行灌胃，并灌胃給藥持續(xù)8周。第20周實驗結(jié)束時進行OGTT試驗；然后處死大鼠，對血漿進行相關(guān)的生化檢測，病理分析肝臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)情況，Western blot方法檢測脂肪酸合成相關(guān)基因。

實驗結(jié)果

1.提取物A對于降血脂TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)水平具有更好的效果

如圖1和圖2所示，與糖尿病大鼠比，本發(fā)明提取物A、B、C、D治療組的TC、TG，均有下降，但是本發(fā)明提取物A治療組顯著下降(P<0.05)，幾乎達到正常小鼠水平，因此，與提取物B、C、D相比，本發(fā)明的提取物A對于降低血脂具有更好的效果。

2.提取物A對于增加胰島素敏感性顯示更好的效果

為了評估大鼠的在本發(fā)明提取物給藥治療后的糖耐量狀況，在實驗結(jié)束時進行OGTT試驗，如圖3，OGTT實驗在0，30，60，120min時的血糖情況。糖尿病組大鼠AUC顯著高于正常大鼠(P<0.05)，如圖4所示，與糖尿病組比較，本發(fā)明提取物A、B、C、D治療組的AUC均顯著減低，且與提取物B、C、D相比，本發(fā)明的提取物A對于增加胰島素敏感性具有更好的效果。