本發(fā)明涉及化合物L(fēng)inderolide H的新用途，尤其涉及Linderolide H在制備抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量合成、分泌，而降解絕對或相對不足，使ECM在肝臟內(nèi)彌漫沉積。其起始于肝細(xì)胞(HC)壞死，隨之是炎癥反應(yīng)、纖維生成介質(zhì)釋放，肝星狀細(xì)胞(FSC)激活，最終以肝臟結(jié)締組織成分的合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預(yù)后的重要因素。
過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長足進(jìn)展，證實(shí)肝纖維化與一定程度的肝硬化都是可逆的。近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學(xué)藥、生物制劑、中藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏(劉平.加強(qiáng)抗肝纖維化作用機(jī)制的研究.中華肝病雜志，2005,8(13)：561)。目前防治肝纖維的關(guān)鍵是針對與肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)的環(huán)節(jié)，主要是：減輕肝損傷；抑制星狀細(xì)胞激活，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生；調(diào)節(jié)細(xì)胞因子紊亂，促進(jìn)活化肝星狀細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明涉及的化合物L(fēng)inderolide H是一個(gè)2014年發(fā)表(Qing Liu,et al.,Sesquiterpene lactones from the roots of Lindera strychnifolia.Phytochemistry,87(2013)112–118.)的新化合物，該化合物擁有全新的骨架類型，目前的用途僅僅涉及抗艾滋病毒(Qing Liu,et al.,Sesquiterpene lactones from the roots of Lindera strychnifolia.Phytochemistry,87(2013)112–118.)，對于本發(fā)明涉及的Linderolide H在制備抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖藥物中的用途屬于首次公開，由于屬于全新的結(jié)構(gòu)類型，而且其對于抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖顯然具有顯著的進(jìn)步。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有Linderolide H研究中未發(fā)現(xiàn)其具有抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖活性的報(bào)道的現(xiàn)狀，提供了Linderolide H在制備抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
所述化合物L(fēng)inderolide H結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示：
本發(fā)明對Linderolide H抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖作用進(jìn)行了藥理試驗(yàn)。成纖維細(xì)胞增殖并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，是肝纖維化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)?；罨母涡菭罴?xì)胞(HSC)具有成纖維細(xì)胞特征，NIH/3T3細(xì)胞是研究藥物抗肝纖維化活性常用的細(xì)胞模型。本研究以NIH/3T3成纖維細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察發(fā)明藥物對其增殖的影響。用MTT法檢測的抑制細(xì)胞增殖的試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明藥物對NIH/3T3的細(xì)胞增殖有顯著的抑制活性。
根據(jù)藥理試驗(yàn)結(jié)果證明Linderolide H具有抗肝纖維化作用。
本發(fā)明涉及的Linderolide H在制備抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖藥物中的用途屬于首次公開，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對于肝臟成纖維細(xì)胞增殖抑制活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于抗肝臟成纖維細(xì)胞增殖顯然具有顯著的進(jìn)步。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)inderolide H的制備方法參見文獻(xiàn)(Qing Liu,et al.,Sesquiterpene lactones from the roots of Lindera strychnifolia.Phytochemistry,87(2013)112–118.)
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
實(shí)施例1：本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)inderolide H片劑的制備：
取20克化合物L(fēng)inderolide H，加入制備片劑的常規(guī)輔料180克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成1000片。
實(shí)施例2：本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)inderolide H膠囊劑的制備：
取20克化合物L(fēng)inderolide H，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉180克，混勻，裝膠囊制成1000粒。
下面通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步說明其藥物活性。
實(shí)驗(yàn)例一：采用MTT法評價(jià)化合物L(fēng)inderolide H對肝纖維化的抑制作用
1、方法：NIH/3T3細(xì)胞株購自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫。將對數(shù)生長期的亞融合的NIH/3T3細(xì)胞用0.25％胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)制成1×104cell/ml的細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色鑒定存活率大于95％，按每孔100ul加入96孔板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有不同稀釋濃度藥物的DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。棄去培養(yǎng)液，加入150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀490nm處讀取OD值，結(jié)果以O(shè)D490表示。
2.結(jié)果：
2.1形態(tài)學(xué)觀察
NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細(xì)胞增殖的速度快；而加藥物24h后，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物增多。
表1：MTT法檢測本發(fā)明藥物對NIH/3T3增殖的抑制作用
注：*，與細(xì)胞陰性對照P<0.05；**，與細(xì)胞陰性對照P<0.01
結(jié)果：本發(fā)明藥物在10ug/ml-40ug/ml的濃度范圍內(nèi)對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。表明本發(fā)明藥物體外對纖維細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。
實(shí)驗(yàn)例2：本發(fā)明藥物對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用
TGF-β1是促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原生成的強(qiáng)活性因子，在細(xì)胞中加入TGF-β110ng/ml刺激細(xì)胞增殖，在檢測藥物對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用，以分析判斷本發(fā)明藥物的作用機(jī)理。
表2：MTT法檢測本發(fā)明藥物對TGF誘導(dǎo)NIH/3T3增殖的抑制作用
注：*，與細(xì)胞+TGF對照P<0.05；**，與細(xì)胞+TGF對照P<0.01
結(jié)果：本發(fā)明藥物在10-40ug/ml兩個(gè)濃度區(qū)間內(nèi)對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-β1的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。表明本發(fā)明藥物體外對纖維細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過干預(yù)TGF信號通路實(shí)現(xiàn)的。
由上述實(shí)施例表明，本發(fā)明的：Linderolide H對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用；Linderolide H對成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-β1的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。由此證明，Linderolide H可以明顯抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，可用于制備抗肝纖維化、防治肝硬化的藥物。