本發(fā)明屬藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗腫瘤藥物的仿生納米制劑，具體涉及一種激活的中性粒細(xì)胞膜包覆的仿生納米粒子及制備方法，尤其是一種能包載脂溶性藥物的具有聚合物-細(xì)胞膜核殼結(jié)構(gòu)的仿中性粒細(xì)胞的納米載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

資料顯示，惡性腫瘤是目前危害人類(lèi)健康的主要?dú)⑹?，具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力是其最重要的生理特征。臨床實(shí)踐中，手術(shù)、化學(xué)治療等干預(yù)手段雖然在短期內(nèi)能起到一定作用，但預(yù)后一般較差，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療面臨的最大挑戰(zhàn)。研究顯示腫瘤轉(zhuǎn)移中血管是腫瘤細(xì)胞侵入機(jī)體各個(gè)器官的主要“高速公路”，腫瘤表皮細(xì)胞大量增殖脫落，侵入血管形成具有高侵襲力和運(yùn)動(dòng)能力的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells,ctc)，這種具有內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)的ctc到達(dá)遠(yuǎn)處合適的寄居部位，形成轉(zhuǎn)移灶，成為日后致命的隱患，也是臨床腫瘤治療失敗的根本原因所在。

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了人體白細(xì)胞可分為多種亞群，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞等，研究發(fā)現(xiàn)占白細(xì)胞總數(shù)70％左右的中性粒細(xì)胞對(duì)ctc和轉(zhuǎn)移部位具有天然靶向作用，其分子基礎(chǔ)在于這兩種細(xì)胞表面的粘附分子表達(dá)的改變，即腫瘤微環(huán)境中的炎性因子激活中性粒細(xì)胞，上調(diào)其細(xì)胞膜上的粘附分子表達(dá)，增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞與ctc高表達(dá)的特異性配體親和力從而介導(dǎo)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

基于激活中性粒細(xì)胞對(duì)ctc高效靶向的生物學(xué)基礎(chǔ)，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種激活的中性粒細(xì)胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子，具體涉及一種能包載脂溶性藥物的具有聚合物-細(xì)胞膜核殼結(jié)構(gòu)的仿中性粒細(xì)胞的納米載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)將在血循環(huán)中高度靶向并殺傷ctc，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種表面包覆激活的中性粒細(xì)胞膜的生物可降解的仿生粒子(neutrophillikenanopartiles,簡(jiǎn)稱(chēng)nlp)及其制備方法。

本發(fā)明以聚合物聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，簡(jiǎn)稱(chēng)plga)，或聚乳酸共聚物(polylacticacid，簡(jiǎn)稱(chēng)pla)，或聚己內(nèi)酯共聚物(polycaprolactone，簡(jiǎn)稱(chēng)pcl)為材料制備納米粒作為內(nèi)核并包載模型藥物，將天然激活中性粒細(xì)胞膜作為衣殼包覆于納米粒表面，制成激活的中性粒細(xì)胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子納米載體系統(tǒng)。該納米載體系統(tǒng)中，一方面利用激活的生物膜蛋白，在血液中長(zhǎng)循環(huán)并高度靶向殺傷ctc；另一方面利用中性粒細(xì)胞天然募集至炎癥部位血管的原理，靶向炎癥狀態(tài)的早期微轉(zhuǎn)移病灶并釋放藥物，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明中，采用的模型藥物為卡非佐米、硼替佐米或紫衫烷類(lèi)化療藥物，均為fda批準(zhǔn)的小分子化療藥物；其中，卡非佐米、硼替佐米或紫衫烷類(lèi)化療藥物，能作用于多種與轉(zhuǎn)移、耐藥相關(guān)的通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有一定抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性，將這些化療藥物包載于上述納米載體中，一方面能夠延長(zhǎng)其在血液中的半衰期，誘導(dǎo)循環(huán)腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶和相關(guān)炎癥因子的生成，調(diào)節(jié)早期微轉(zhuǎn)移病灶局部炎癥環(huán)境，遏制腫瘤細(xì)胞的定植和侵襲。

本發(fā)明中，聚合物plga，pla，pcl構(gòu)建的納米粒作為內(nèi)核，能包載疏水性藥物，具有較高的機(jī)械穩(wěn)定性，其分子量為10000-30000da。

本發(fā)明中，所述中性粒細(xì)胞膜囊泡通過(guò)從同種類(lèi)動(dòng)物外周血分離得到中性粒細(xì)胞，將其進(jìn)行體外誘導(dǎo)從而上調(diào)相關(guān)粘附分子的表達(dá)，采用差速離心法提取得到；

本發(fā)明中，所述激活的中性粒細(xì)胞膜表面相關(guān)粘附分子中，lps脂多糖激活的中性粒細(xì)胞膜上調(diào)β2整合素類(lèi)、l-選擇素、趨化因子受體、β1整合素等膜蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明通過(guò)下述方法構(gòu)建粒子方法仿生粒子納米載體系統(tǒng)：

①?gòu)耐N類(lèi)動(dòng)物外周血分離得到中性粒細(xì)胞，將其進(jìn)行體外誘導(dǎo)從而上調(diào)相關(guān)粘附分子的表達(dá)，差速離心法提取得到細(xì)胞膜分散于水溶液中的囊泡；

②以plga或pla或pcl為材料采用乳化溶媒揮發(fā)法制得粒徑均一的納米粒，同時(shí)包載難溶性小分子模型藥物；

③將預(yù)先制備的中性粒細(xì)胞膜囊泡與plga或pla或pcl納米粒共孵育并往復(fù)過(guò)膜擠壓。

本發(fā)明中，所述外周血細(xì)胞物種來(lái)源是小鼠或者大鼠。

本發(fā)明中，所述聚合物構(gòu)建的納米粒內(nèi)核和細(xì)胞膜囊泡通過(guò)疏水作用以及靜電作用相結(jié)合，在聚合物內(nèi)核表面包被膜-蛋白脂質(zhì)雙分子層，形成核殼結(jié)構(gòu)的納米級(jí)仿生粒子。

本發(fā)明中，所述細(xì)胞膜囊泡平均粒徑為200nm左右，聚合物納米內(nèi)核平均粒徑為80-100nm，包被中性粒細(xì)胞膜之后最終粒徑在100-120nm左右；相比于微米尺度的細(xì)胞，比表面積較大，能更高效地發(fā)揮膜結(jié)構(gòu)的作用。

本發(fā)明采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec細(xì)胞)為早期微轉(zhuǎn)移病灶內(nèi)皮細(xì)胞模型，以改良的椎板粘度計(jì)對(duì)乳腺癌肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞(4t1細(xì)胞)產(chǎn)生一定剪切力為循環(huán)腫瘤細(xì)胞模型，此兩種細(xì)胞均為本領(lǐng)域公認(rèn)且熟知。

本發(fā)明描述了該藥物遞釋系統(tǒng)的制備方案，并提供了該系統(tǒng)體內(nèi)外靶向性的結(jié)果以及藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

本發(fā)明通過(guò)采用改良的錐板粘度計(jì)模擬血液流動(dòng)狀態(tài)，評(píng)價(jià)在一定的血液剪切力作用下nlp對(duì)流動(dòng)狀態(tài)的4t1腫瘤細(xì)胞的靶向功能，并且能夠顯著提高卡非佐米誘導(dǎo)流動(dòng)狀態(tài)的4t1細(xì)胞的凋亡的能力。肺轉(zhuǎn)移模型裸鼠活體近紅外/生物發(fā)光雙模成像實(shí)驗(yàn)證明，該藥物能夠特異性地蓄積至肺轉(zhuǎn)移病灶。體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)顯示，相比于游離藥物和普通納米制劑，該遞藥系統(tǒng)能夠顯著抑制轉(zhuǎn)移病灶的形成，具有明顯的抗腫瘤效果。

本發(fā)明所制得的新型靶向藥物遞釋系統(tǒng)其給藥方式為靜脈注射。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

制得的仿生粒子納米載體系統(tǒng)不同于一種或者多種分子修飾的主動(dòng)靶向納米粒子，該簡(jiǎn)易的中性粒細(xì)胞仿生粒子(neutrophil-likeparticles,nlp)在防治腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：

①激活的中性粒細(xì)胞膜表面相關(guān)粘附分子能高度靶向ctc；

②plga或pla或pcl內(nèi)核載藥能力強(qiáng)，且具緩釋效果；

③納米粒利用中性粒細(xì)胞膜的偽裝，能夠逃避自身單核巨噬細(xì)胞的吞噬，有別于傳統(tǒng)的聚乙二醇修飾，為實(shí)現(xiàn)制劑的長(zhǎng)循環(huán)提供新思路；

④生物相容性和安全性高：nlp表面包覆的中性粒細(xì)胞膜不存在遺傳物質(zhì)以及細(xì)胞器等，免疫原性極低；內(nèi)核為fda所認(rèn)可的生物可降解材料；因此具有較高的安全性和醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化前景。

附圖說(shuō)明：

圖1是納米遞藥系統(tǒng)的粒徑和電位表征圖，

圖中a,b,c分別是幾種納米制劑的粒徑分布，平均粒徑和zeta電位。

圖2是納米遞藥系統(tǒng)的透射電鏡圖，

圖中a,b,c分別是裸露的plga納米粒，中性粒細(xì)胞膜囊泡和包被中性粒細(xì)胞膜的plga納米粒透射電鏡放大圖，d是包被中性粒細(xì)胞膜的plga納米粒分散于水溶液中。

圖3是納米粒表面粘附和趨化蛋白的定性檢測(cè)結(jié)果，

圖中a是免疫印跡法測(cè)定l-selectin,cxcr4,lfa-1,β1intergrin等幾類(lèi)蛋白在樣品中的表達(dá)情況；(a)中性粒細(xì)胞,(b)中性粒細(xì)胞膜，(c)包被中性粒細(xì)胞膜的納米粒，(d)經(jīng)過(guò)lps刺激后的中性粒細(xì)胞，(e)經(jīng)過(guò)lps刺激后的中性粒細(xì)胞膜，(f)經(jīng)過(guò)lps刺激后的中性粒細(xì)胞膜包被的納米粒；b是考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定經(jīng)過(guò)lps刺激后的中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞膜，納米粒表面的總體蛋白印記。

圖4是免疫印跡法測(cè)定粘附和趨化分子表達(dá)的半定量結(jié)果，

圖中^***p<0.001，是指與未經(jīng)過(guò)lps刺激的中性粒細(xì)胞相比顯著增加。

圖5是納米遞藥系統(tǒng)在靜止和流動(dòng)狀態(tài)中的4t1乳腺癌細(xì)胞中的攝取定性和定量結(jié)果，

圖中a是包載香豆素-6(熒光探針)的相同濃度的np和nlp在靜止和流動(dòng)的4t1乳腺癌細(xì)胞中的熒光顯微鏡攝取圖，b是在靜止?fàn)顟B(tài)下平均單個(gè)4t1細(xì)胞攝取不同濃度np和nlp高內(nèi)涵掃描結(jié)果，c是在剪切力為188s^-1的流動(dòng)狀態(tài)下平均單個(gè)4t1細(xì)胞攝取不同濃度的np和nlp高內(nèi)涵掃描結(jié)果；^**p<0.01，^*p<0.05，是指與37℃靜止?fàn)顟B(tài)下的np相比，在4t1細(xì)胞中的攝取相比顯著增加；^###p<0.001，^#p<0.05，是指與37℃流動(dòng)狀態(tài)下的np相比，在4t1細(xì)胞中的攝取相比顯著增加。

圖6是納米粒分散在流動(dòng)血液中后在huvec細(xì)胞上的攝取定性和定量結(jié)果，其中，

a是未經(jīng)過(guò)tnf-α刺激的huvec細(xì)胞對(duì)np攝取的共聚焦圖，b是未經(jīng)過(guò)tnf-α刺激的huvec細(xì)胞對(duì)nlp攝取的共聚焦圖，c是經(jīng)過(guò)tnf-α刺激的huvec細(xì)胞對(duì)np攝取的共聚焦圖，d是經(jīng)過(guò)tnf-α刺激的huvec細(xì)胞對(duì)nlp攝取的共聚焦圖，e是各種情況下的攝取定量結(jié)果。

圖7是游離cfz，np-cfz和nlp-cfz納米粒誘導(dǎo)流動(dòng)狀態(tài)下的4t1細(xì)胞凋亡情況。

圖8是采用近紅外成像檢測(cè)np和nlp納米粒在小鼠肺轉(zhuǎn)移模型上的組織分布。

圖9是納米制劑和游離藥物在尾靜脈注射luc-4t1細(xì)胞的小鼠肺轉(zhuǎn)移模型的藥效結(jié)果，

圖中a是尾靜脈注射相同量的luc-4t1細(xì)胞后給予裸鼠游離cfz，np-cfz和nlp-cfz納米粒三次(第1天，第7天，第14天)后的生物發(fā)光活體成像檢測(cè)。b是在第16天獲取裸鼠各個(gè)主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)后進(jìn)行活體成像檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1激活的中性粒細(xì)胞膜的制備和表征

小鼠5％水合氯醛麻醉后，心臟取血于加入肝素的ep管中。取一支50ml離心管，小心加入15ml小鼠外周血中性粒細(xì)胞分離液。用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500g離心25min。離心后，離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層，上層細(xì)胞為單個(gè)核細(xì)胞層，下層細(xì)胞為中性粒細(xì)胞層。用吸管小心吸取分離液中的中性粒細(xì)胞層，加入3倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解10min，300g離心10min，棄紅色上清。重復(fù)裂解步驟一次，即得中性粒細(xì)胞。向所得細(xì)胞中加入10mlpbs混勻細(xì)胞，250g離心10min，棄上清。重復(fù)清洗步驟，得到純凈的中性粒細(xì)胞。為了刺激中性粒細(xì)胞上調(diào)粘附分子的表達(dá)，加入2μg·ml^-1的lps(一種脂多糖)孵育2h；

采用差速離心法提取中性粒細(xì)胞膜，向上述所得中性粒細(xì)胞中加入15mlib-1溶液重懸，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，冰上勻漿100次。將所得溶液加入50ml離心管中，1000g離心5min。吸取上層清液，10,000g離心20min。吸取上層清液，加入6.5ml離心管中，100,000g離心1h。棄去上層清液，沉淀用三蒸水重懸。溶液-80℃冷凍后，真空凍干得到中性粒細(xì)胞膜，-20℃保存；

將中性粒細(xì)胞和細(xì)胞膜、nlp用十二烷基硫酸鈉sds溶解，page凝膠電泳之后采用經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)膜蛋白的完整性進(jìn)行表征；

采用免疫印跡法(westernblot)對(duì)lps刺激前后的中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞膜和nlp的幾類(lèi)特異性粘附蛋白進(jìn)行表征；

結(jié)果顯示：通過(guò)比較nlp與細(xì)胞膜的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞膜上的蛋白條帶與nlp的蛋白條帶基本一致，說(shuō)明將細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到plga內(nèi)核表面的同時(shí)，膜蛋白也成功轉(zhuǎn)移到plga納米粒表面。完整中性粒細(xì)胞中位于電泳前段20kda以下的小分子量蛋白多為細(xì)胞核結(jié)構(gòu)中的小分子物質(zhì)，細(xì)胞膜和nlp蛋白條帶這類(lèi)物質(zhì)幾乎全部被除去，而整合素類(lèi)，選擇素和趨化蛋白等蛋白分子量多集中在120kda,38kda，300kda左右，在圖上均可觀(guān)察到。通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過(guò)2小時(shí)lps孵育和刺激后，lfa-1(β2整合素類(lèi))、l-選擇素、cxcr4(趨化因子受體)、β1整合素等在各個(gè)樣品中表達(dá)明顯提高。

實(shí)施例2激活的中性粒細(xì)胞膜包被的載卡非佐米納米遞藥系統(tǒng)制備和表征

精密稱(chēng)取10mg的plga聚合物材料，加入卡非佐米的二氯甲烷溶液1ml溶解為有機(jī)相，加入2ml1.0％的膽酸鈉水相溶液，240w，50s超聲乳化，然后立即倒入一定量0.5％膽酸鈉溶液，磁力攪拌5min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)抽盡有機(jī)溶劑，低溫高速離心(14500rpm，4℃，60min)即得載卡非佐米的np納米粒(簡(jiǎn)稱(chēng)cfz-np)；

精密稱(chēng)取中性粒細(xì)胞膜，采用迷你型avanti脂質(zhì)體/納米擠出器，反復(fù)過(guò)孔徑為200nm的聚碳酸酯膜使其在水相中聚集成為小的脂質(zhì)囊泡，與質(zhì)量比為1:1的plga材料所制備的納米粒均勻混合，超聲100hz,60s，即得載卡非佐米的nlp納米粒(cfz-nlp)；

采用粒度/zeta電位測(cè)定儀測(cè)定納米粒的粒徑、多分散性(pdi)和zeta電位。采用透射電鏡觀(guān)察其形態(tài)；

結(jié)果顯示：納米粒包被膜前后粒徑均在150nm以?xún)?nèi)，中性粒細(xì)胞膜的包被使納米粒粒徑增大了約20nm左右，zeta電位由原來(lái)的-39mv左右變?yōu)?34mv左右，與中性粒細(xì)胞膜囊泡相一致。兩種納米粒大小均一，外觀(guān)圓整，經(jīng)過(guò)對(duì)比可以清晰分辨出cfz-nlp的plga內(nèi)核外包被了較暗的中性粒細(xì)胞膜脂質(zhì)層。

實(shí)施例3nlp在靜止和流動(dòng)狀態(tài)的4t1細(xì)胞上攝取的定性和定量研究

定性分析

a.靜止?fàn)顟B(tài)下的孵育過(guò)程：以每孔2×10⁴個(gè)4t1細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中孵育24h貼壁后吸去培養(yǎng)液，分別加入包載0.1％香豆素-6的nlp和np(納米粒濃度400μg·ml^-1)，孵育2h后4％多聚甲醛固定，hoechst染細(xì)胞核；

b.流動(dòng)狀態(tài)下的孵育過(guò)程：采用brookfield錐板粘度計(jì)產(chǎn)生一定的剪切力，循環(huán)水浴保證恒溫37℃，4t1細(xì)胞懸液按照5×10⁴個(gè)/ml的密度加入樣品池中500μl，然后加入500μl的包載0.1％香豆素-6的nlp和np(納米粒濃度800μg·ml^-1)，在188s^-1的剪切速率下孵育2h之后將細(xì)胞離心棄上清，加入pbs洗滌并用新鮮培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)，按照每孔2×10⁴的密度接種到24孔板中，使細(xì)胞貼壁24h；

熒光顯微鏡下觀(guān)察上述兩種情況下的nlp和np在4t1細(xì)胞上的攝取差異，4％多聚甲醛固定，hoechst染細(xì)胞核；

定量分析

a.4t1細(xì)胞以每孔5×10³個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，孵育24h后，考察靜止?fàn)顟B(tài)下納米粒濃度、孵育時(shí)間、以及溫度對(duì)攝取的影響；

①納米粒濃度的影響：分別用不同濃度的入包載0.1％香豆素-6的nlp和np(納米粒濃度50-800μg·ml^-1)，孵育2h；

②溫度的影響：將入包載0.1％香豆素-6的nlp和np溶液分別按不同濃度(納米粒濃度50-800μg·ml^-1)每孔加入100μl，分別放入37℃及4℃孵育2h；

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄去納米粒溶液，細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，hoechst染核，最后用kineticscan全自動(dòng)高內(nèi)涵藥物篩選儀定量掃描；

b.采用brookfield錐板粘度計(jì)產(chǎn)生一定的剪切力，循環(huán)水浴保證恒溫模擬人體血流情況，將4t1懸液按照5×10⁴個(gè)/ml的密度加入500μl到樣品池中，流動(dòng)狀態(tài)下考察納米粒濃度、孵育時(shí)間、以及溫度對(duì)攝取的影響；

①納米粒濃度的影響：分別加入500μl不同濃度的入包載0.1％香豆素-6的nlp和np(納米粒濃度50-800μg·ml^-1)在樣品池中，在188s^-1的剪切速率下孵育2h；

②溫度的影響：將入包載0.1％香豆素-6的nlp和np溶液分別按不同濃度(納米粒濃度50-800μg·ml^-1)加入500μl到樣品池中，分別在37℃及4℃，188s^-1的剪切速率下孵育2h；

按照以上條件處理的細(xì)胞離心棄上清，加入pbs洗滌并用新鮮培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)，按照每孔5×10³的密度接種到96孔板中，使細(xì)胞貼壁24h之后棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用4％多聚甲醛固定，hoechst染核，最后用kineticscan全自動(dòng)高內(nèi)涵藥物篩選儀定量掃描；

結(jié)果顯示：在靜止?fàn)顟B(tài)下，直接孵育的培養(yǎng)孔板的4t1細(xì)胞攝取載香豆素-6作為熒光探針的nlp相比于np的綠色熒光強(qiáng)度具有一定的提高，但是并不明顯，而在流動(dòng)狀態(tài)下的4t1細(xì)胞的攝取中，nlp綠色熒光顯著強(qiáng)于np，定量結(jié)果與定性結(jié)果相一致，說(shuō)明4t1細(xì)胞對(duì)nlp的攝取在血液剪切力作用下相比于np更強(qiáng)，可能是由于細(xì)胞膜表面多種粘附分子發(fā)揮的協(xié)同性作用，介導(dǎo)了更加穩(wěn)固的粘附，從而增強(qiáng)其攝取；靜止和流動(dòng)狀態(tài)下4t1細(xì)胞在37℃時(shí)的攝取強(qiáng)于4℃說(shuō)明這是一種能量依賴(lài)的內(nèi)吞過(guò)程。

實(shí)施例4納米粒在huvec細(xì)胞上的攝取定性和定量結(jié)果

將人huvec細(xì)胞按照每孔2×10⁴個(gè)的密度接種于底部鋪有蓋玻片的24孔板中，使其在蓋玻片上貼壁24小時(shí)，加入tnf-α的溶液刺激2小時(shí)，用鑷子將蓋玻片取出，生長(zhǎng)有細(xì)胞的一面朝上，用動(dòng)物油脂固定于brookfield錐板粘度計(jì)樣品杯中央，加入含有香豆素-6的nlp，np納米粒(800μg·ml^-1的pbs溶液，在188s^-1的剪切速率下孵育2小時(shí)，循環(huán)水浴保證恒溫37℃，之后將蓋玻片放回孔板中，加入pbs洗滌3次，4％多聚甲醛固定，hoechst染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀(guān)察上述兩種情況下的nlp和np在經(jīng)過(guò)tnf-α激活前后的huvec細(xì)胞上的攝取差異。定量檢測(cè)是按照以上條件處理的huvec用kineticscan全自動(dòng)高內(nèi)涵藥物篩選儀定量掃描；

定性和定量結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)tnf-α刺激后的huvec細(xì)胞對(duì)兩種納米制劑的攝取都有所提高，且在細(xì)胞內(nèi)的分布呈簇狀。nlp的攝取明顯強(qiáng)于np，但是未經(jīng)過(guò)刺激的huvec細(xì)胞對(duì)nlp和np的攝取無(wú)顯著性差異，前者稍強(qiáng)。此結(jié)果說(shuō)明處于炎癥刺激下的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)所有納米制劑的攝取均有提高，但是對(duì)于包被了中性粒細(xì)胞膜的納米制劑靶向炎癥部位內(nèi)皮細(xì)胞的能力較強(qiáng)，該仿生納米粒具有類(lèi)似于中性粒細(xì)胞的生物學(xué)特性。

實(shí)施例5游離cfz，np-cfz和nlp-cfz納米粒誘導(dǎo)流動(dòng)狀態(tài)下的4t1細(xì)胞凋亡定量結(jié)果

將4t1細(xì)胞按照1×10⁶個(gè)/ml的密度加入brookfield錐板粘度計(jì)的樣品池中，加入游離cfz，np-cfz和nlp-cfz納米粒三種制劑(卡非佐米濃度400ng·ml^-1)，在188s^-1的剪切速率下孵育2h之后將細(xì)胞離心棄上清。用預(yù)冷的pbs洗滌3遍并用pbs重懸細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。一組立即參照annexinv-fitc細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，取0.5-1×10⁵個(gè)細(xì)胞重懸于200μl結(jié)合液，加入5μlannexinv-fitc和10μlpi染色液，室溫避光放置15min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀(guān)察細(xì)胞凋亡情況。另外一組以1×10⁵個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，孵育24小時(shí)后，進(jìn)行消化，處理同第一組；

結(jié)果顯示：對(duì)椎板粘度計(jì)中流動(dòng)2小時(shí)之后立刻進(jìn)行流式定量檢測(cè)，觀(guān)察到對(duì)照組流動(dòng)2小時(shí)之后細(xì)胞的活力，凋亡細(xì)胞數(shù)目很少，說(shuō)明機(jī)械力對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷。流動(dòng)2小時(shí)之后各個(gè)給藥組出現(xiàn)不同程度的晚期凋亡，早期凋亡很少。繼續(xù)低濃度給藥孵育24小時(shí)，監(jiān)測(cè)到加入游離的cfz之后晚期凋亡數(shù)目驟升，達(dá)到30.2％左右，早期凋亡為11.9％左右。普通納米粒cfz-np組晚期凋亡僅為18.9％左右，早期凋亡明顯增加至20.2％，但cfz-nlp組晚期凋亡和早期凋亡均顯著增加，分別為25.3％和39.9％左右。推測(cè)其原因，很可能是在流動(dòng)狀態(tài)下中性粒細(xì)胞膜介導(dǎo)了納米粒攝取的增加，介導(dǎo)細(xì)胞大量凋亡。

實(shí)施例6采用近紅外成像檢測(cè)np和nlp納米粒在小鼠肺轉(zhuǎn)移模型上的組織分布。

將2×10⁶個(gè)luc-4t1細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射入12只18-22g的balb/c鼠體內(nèi)，待第14天時(shí)，進(jìn)行生物發(fā)光成像檢測(cè)，選取肺轉(zhuǎn)移瘤情況和程度相近的裸鼠(8只)分為2組(n＝4)。分別尾靜脈注射包載近紅外探針dir的nlp，np納米粒，第24小時(shí)進(jìn)行近紅外成像和生物發(fā)光檢測(cè)，并解剖各個(gè)主要臟器((心、肝、脾、肺、腎)進(jìn)行兩種模式下的檢測(cè)，觀(guān)察靶向性；

結(jié)果顯示：尾靜脈注射luc-4t1細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移造模成功率90％以上，選取相同轉(zhuǎn)移情況的裸鼠進(jìn)行成像，消除了其他因素的干擾，例如epr效應(yīng)等。np組的裸鼠整體近紅外熒光強(qiáng)度低于nlp組，從解剖得到的肺部腫瘤圖像上看，兩種成像模式并無(wú)太多相關(guān)性，說(shuō)明np對(duì)轉(zhuǎn)移瘤特異性較低。而nlp組信號(hào)在兩種成像模式下相關(guān)性較好，幾乎轉(zhuǎn)移部位的腫瘤都具有較強(qiáng)的近紅外熒光信號(hào)。說(shuō)明包被了中性粒細(xì)胞膜之后，轉(zhuǎn)移部位靶向性大大提高。

實(shí)施例7制劑在尾靜脈注射luc-4t1細(xì)胞的小鼠肺轉(zhuǎn)移模型的藥效結(jié)果

取體重20±2g的健康裸鼠12只，隨機(jī)分為3組，尾靜脈注射相同量(2×10⁶個(gè))的luc-4t1細(xì)胞，半小時(shí)后尾靜脈注射等量藥物的游離cfz，np-cfz和nlp-cfz納米粒(5mg/kg)，分別于第7天和第14天給予相同量的三種制劑，于第八天開(kāi)始每天注射底物進(jìn)行生物發(fā)光活體成像檢測(cè)和記錄。在第16天獲解剖取裸鼠各個(gè)主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)后進(jìn)行生物發(fā)光活體成像檢測(cè)；

結(jié)果顯示：生物發(fā)光熒光強(qiáng)度與體內(nèi)瘤體的大小呈很好的正相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在腫瘤細(xì)胞注射進(jìn)體內(nèi)30分鐘后立刻給藥，游離的cfz對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并無(wú)顯著的作用，第8天多數(shù)裸鼠肺部已經(jīng)形成了較大的轉(zhuǎn)移病灶。按照兩周給藥3次的方案進(jìn)行治療，最終肺部轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)展并未得到控制。而cfz-np組的裸鼠在第8天出現(xiàn)了較強(qiáng)程度的轉(zhuǎn)移，但在后續(xù)治療中腫瘤體積出現(xiàn)了縮小，很可能是由于早期缺乏循環(huán)腫瘤細(xì)胞的靶向性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移成功，但是后期由于epr效應(yīng)，納米制劑能夠在腫瘤部位蓄積，從而發(fā)揮療效。cfz-nlp組療效最為顯著，最開(kāi)始第8天到結(jié)束第16天腫瘤體積明顯縮小，相比于其他兩種制劑，說(shuō)明該中性粒細(xì)胞膜包被的納米遞送系統(tǒng)藥效最為明顯。