本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及童子益母草的新用途，尤其是童子益母草在制備降脂藥物的用途。
背景技術(shù)：
：高脂血癥是指血脂水平過高，可直接引起一些嚴(yán)重危害人體健康的疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等，尤其是心血管疾病。全世界每年3000萬人死于高血脂引起的相關(guān)疾病，最為嚴(yán)重的為心血管疾病。隨著生活水平的提高，我國冠心病的發(fā)病率、死亡率也明顯上升，高血壓患者10年內(nèi)增加了25％，目前已達(dá)2億人左右。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，我國心腦血管疾病患者首次發(fā)病年齡1/3在60歲以下，發(fā)病率高達(dá)13.6％，65歲以上的老人心腦血管疾病發(fā)病率達(dá)95％，都不同程度的存在心慌、胸悶、頭暈、血壓高、血脂高、疲倦、偏癱、心絞痛等癥狀，發(fā)病率高。每天以2萬人的速度遞增，占總死亡人數(shù)的40.72％。且死亡率高，致殘率高，復(fù)發(fā)率高都很高。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2001年統(tǒng)計(jì)：全球每年死于心腦血管疾病人數(shù)達(dá)1900萬人。心腦血管疾病是名副其實(shí)的“第一殺手”。為提高對心腦血管疾病的預(yù)防、治療能力和科研學(xué)術(shù)水平，從事降脂藥物的研究是近幾年人們比較關(guān)注的問題。目前降脂藥物主要從以下三個(gè)途徑發(fā)揮降脂作用，即外源性脂質(zhì)的吸收，內(nèi)源性脂質(zhì)的合成，體內(nèi)脂質(zhì)的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄。目前臨床上應(yīng)用最廣泛的一類降脂藥是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，即他汀類藥物。臨床常用的他汀類藥物有洛伐他汀(Lovastatin)、辛伐他汀(Simvastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、阿托伐他汀(Atorastatin)。該類藥物能抑制細(xì)胞內(nèi)的膽固醇合成早期階段的限速酶，造成細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇減少，并通過反饋性上調(diào)細(xì)胞表面低密度受體的表達(dá)，加速循環(huán)血液中低密度脂蛋白的清除，利于總膽固醇(TC)的清除和轉(zhuǎn)運(yùn)。然而長期應(yīng)用他汀類藥物時(shí)多出現(xiàn)頭痛、失眠、短暫性大便習(xí)慣改變、惡心等副作用。且此類藥在與吉非羅齊合用后會(huì)產(chǎn)生較嚴(yán)重的副作用，輕者肝功損害、肌肉酸痛，重者出現(xiàn)橫紋肌溶解、黑尿、腎功能損害等。降脂作用中藥近年來研究較多，具有降血脂作用的常見的有山楂、何首烏、澤瀉、決明子、大黃、靈芝、虎杖、三七、蒲黃、紅花、丹參、女貞子、月莧草、廣地龍、蟲草、荷葉、玉竹、桑寄生、麥芽、葛根、郁金、茵陳、銀杏葉等等。復(fù)方制劑或中成藥也很多，如山丹芍藥湯(山楂、丹參和赤芍)、百草降脂靈(山楂和丹參)、降脂寧、血脂康、地奧心血康等等。中藥降血脂的作用相對于西藥比較復(fù)雜，毒副反應(yīng)較少。然而降血脂中藥研究開發(fā)的主要瓶頸在于藥物有效成分、活性部位不清，作用機(jī)制不明或研究不夠透徹。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷提供一種具有降脂作用的中藥，并從基因水平闡明其作用機(jī)制，開發(fā)一種療效高，作用機(jī)制明確，無毒副作用的中藥類降脂藥物。本發(fā)明提供了童子益母草在制備具有降脂作用的藥物中的用途。其中，所述降脂作用為降低血清總膽固醇、甘油三酯和/或低密度脂蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述藥物包括童子益母草和藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，所述藥物包括童子益母草和其它具有降脂作用的化合物和/或中藥。按照本發(fā)明，所述藥物為任意一種臨床可接受的口服給藥劑型或注射給藥劑型。在一些實(shí)施方案中，所述藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、散劑、注射劑。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了童子益母草在制備具有降脂作用的藥物中的用途。試驗(yàn)表明，童子益母草對LDLR基因變化倍數(shù)為4.23，明顯高于其它中藥提取物。并且童子益母草還可以上調(diào)LDLR基因，下調(diào)HMGCR基因和HMGCS1基因的表達(dá)，從而降低膽固醇的合成。表明童子益母草具有降脂作用。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示實(shí)施例2童子益母草和益母草的qPCR結(jié)果比較結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。益母草為唇形科植物益母草LeonurusjaponicusHoutt.的新鮮或干燥地上部分，苦、辛，微寒。歸肝、心包、膀胱經(jīng)。具有活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫，清熱解毒的功能，主要用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，惡露不盡，水腫尿少，瘡瘍腫毒。童子益母草為益母草幼苗期至花前期采割未抽莖的干燥地上部分，功效與益母草相似，但不完全相同，童子益母草還具有補(bǔ)血、活血、強(qiáng)壯作用。目前童子益母草在調(diào)節(jié)血脂方面的作用未見報(bào)道。RASL-Seq技術(shù)是一種基于特征基因表達(dá)譜的藥物篩選方法，即利用RNA退火-選擇-連接策略，結(jié)合高通量測序，開發(fā)出的一種定量分析細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)量的高通量篩選方法。該技術(shù)對與特定的疾病表型相關(guān)基因進(jìn)行定量分析，特異性地檢測與疾病相關(guān)的大規(guī)模基因表達(dá)。利用該技術(shù)，特異性的檢測與高血脂相關(guān)的系列基因，可以篩選出降脂作用的藥物。本發(fā)明利用RASL-Seq技術(shù)對20種中藥提取物進(jìn)行篩選，根據(jù)其對脂合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)等基因的表達(dá)的影響，確定了童子益母草具有降脂作用。其中，與脂合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因有HMGCR、LDLR和HMGCS1。HMGCR基因所編碼的蛋白為3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶，是肝膽固醇合成的限速酶，抑制此基因的表達(dá)可抑制膽固醇的合成，從而降低血漿膽固醇，他汀類藥物就是此酶的抑制劑?；騆DLR所編碼的蛋白為低密度脂蛋白受體，可以結(jié)合載脂蛋白將低密度脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)代謝，可清除血中三分之二的低密度脂蛋白，同時(shí)還可以抑制3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶。HMGCS1所編碼的蛋白則為3-羥基-3-甲基戊二?；o酶A合酶1，催化乙酰輔酶轉(zhuǎn)化為3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A，此基因表達(dá)的降低可抑制3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A的合成，從而抑制膽固醇的合成。本發(fā)明進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)童子益母草可以上調(diào)LDLR，下調(diào)HMGCR，下調(diào)HMGCS1基因的表達(dá)，從而降低膽固醇的合成。而益母草不具備相同的作用。因此本發(fā)明提供了童子益母草在制備具有降脂作用的藥物中的用途。按照本發(fā)明，所述降脂作用為降低血清總膽固醇、甘油三酯和/或低密度脂蛋白。本發(fā)明所述藥物包括童子益母草和藥學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將所述童子益母草直接或間接加入制備不同劑型時(shí)所需的藥學(xué)上可接受的各種常用輔料，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成任意一種臨床可接受的口服給藥劑型或注射給藥劑型。如片劑、膠囊劑、顆粒劑、溶液劑、散劑、丸劑、注射劑等。其中，填充劑如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解劑如瓊脂，碳酸鈣，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽和碳酸鈉，低取代羥丙基纖維素；潤滑劑如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂硫酸鈉；粘合劑如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯膠。按照本發(fā)明，所述童子益母草還可以和其它具有降脂作用的化合物和/或中藥組合制成藥物組合物。所述其它具有降脂作用的化合物和/或中藥可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意一種降脂作用的化合物和/或中藥。如他汀類化合物、苯氧芳酸類化合物、煙酸類化合物以及已知的山楂、何首烏、澤瀉、決明子、大黃、靈芝、虎杖、三七、蒲黃、紅花、丹參、女貞子、月莧草、廣地龍、蟲草、荷葉、玉竹、桑寄生、麥芽、葛根、郁金、茵陳、銀杏葉等具有降脂作用的中藥。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了童子益母草在制備具有降脂作用的藥物中的用途。試驗(yàn)表明，童子益母草對LDLR基因變化倍數(shù)為4.23，明顯高于其它中藥提取物。并且童子益母草還可以上調(diào)LDLR基因，下調(diào)HMGCR基因和HMGCS1基因的表達(dá)，從而降低膽固醇的合成。表明童子益母草具有降脂作用。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。如無特殊說明，實(shí)施例中所用試劑均為市售產(chǎn)品。實(shí)施例1一、實(shí)驗(yàn)方法：1、設(shè)計(jì)基因的成對探針：針對所選基因的相鄰兩兩外顯子的結(jié)合點(diǎn)(junction)序列設(shè)計(jì)成對探針，以避免基因組的污染。2、20種中藥提取物處理細(xì)胞：HepG2細(xì)胞購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，培養(yǎng)條件為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長的細(xì)胞，接種在384孔板中，每孔含3000個(gè)細(xì)胞和80μL的培養(yǎng)基。37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后。在細(xì)胞培養(yǎng)孔定量加入0.4μL母液濃度為25mg/mL的益母草、童子益母草、大羽貫眾、雞血藤、長梗黃精、麥冬、昆明雞血藤、龍膽、單葉蔓荊、扁豆、白花敗醬草、白毛夏枯草、披針貫眾、薤白、黃花敗醬草、黃連、天冬、黃芩、苦參、重瓣梔子的提取物，與細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入到HTS2自動(dòng)化操作平臺(tái)(平臺(tái)包括以下幾部分：自動(dòng)化液體處理器，aglient公司；機(jī)械臂benchbot，aglient公司；塔式水浴儀，polyscience公司；測序儀器IlluminaHiSeq1500，Illumina公司)，進(jìn)行后續(xù)處理。3、RASL-Seq實(shí)驗(yàn)：具體操作如下。A.細(xì)胞裂解：藥物處理完成的384孔板細(xì)胞，放入自動(dòng)化操作平臺(tái)，吸棄70μL培養(yǎng)基/孔，余10μL培養(yǎng)基/孔，加入10μL細(xì)胞裂解液，室溫震蕩混勻10分鐘；B.探針退火于mRNA：使用自動(dòng)化平臺(tái)加入基因探針、oligo-dT、生物素磁珠的結(jié)合緩沖液于裂解細(xì)胞的384孔板，65℃舒展RNA結(jié)構(gòu)(平臺(tái)控溫塔)，45℃探針退火(平臺(tái)控溫塔)，探針特異結(jié)合到其靶標(biāo)基因mRNA上；C.mRNA富集：采用oligo-dT和生物素磁珠策略富集mRNA。oligo-dT特異的結(jié)合在富含polyA的核酸區(qū)域(此區(qū)域主要集中在mRNA的3’尾端)，生物素磁珠特異吸附oligo-dT，從而將全基因組mRNA富集在磁珠表面。配合使用自動(dòng)化平臺(tái)磁力架模塊，加入沖洗緩沖液，洗去過量的未結(jié)和的探針；D.探針的DNA連接：使用自動(dòng)化平臺(tái)加入T4DNA連接酶，混勻，37度孵育(平臺(tái)控溫塔)，將用于檢測基因的成對探針(donor和acceptor兩部分)連接成完整片段。F.連接探針產(chǎn)物的線性擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增，線性放大連接探針產(chǎn)物，同時(shí)引入二代測序的P7和P5序列由于每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)量很少，不能直接檢測到探針連接產(chǎn)物。上述設(shè)計(jì)的成對探針，分別引入了兼容二代測序的接頭，便于線性擴(kuò)大產(chǎn)物；同時(shí)通過PCR反應(yīng)，引入二代測序的P7和P5序列，達(dá)到了兼容二代測序反應(yīng)的目的。G.二代測序：分為錨定橋接，預(yù)擴(kuò)增，單堿基延伸測序等步驟。錨定橋接指測序的DNA片段變性成單鏈后與測序通道flowcell的每個(gè)lane的內(nèi)表面上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用；預(yù)擴(kuò)增是指添加未標(biāo)記的dNTP和普通Taq酶進(jìn)行固相橋式PCR擴(kuò)增，單鏈橋型待測片段被擴(kuò)增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會(huì)在Flowcell的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段；單堿基延伸測序，是指在測序的flowcell中加入四種熒光標(biāo)記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測序簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對應(yīng)的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計(jì)算機(jī)軟件將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。二、數(shù)據(jù)分析：首先對測序得到的短序列(rawreads)進(jìn)行質(zhì)控，去除帶接頭、含N(N表示無法確定堿基信息)及低質(zhì)量序列，得到cleanreads；接下來將cleanreads映射到參考基因集相應(yīng)探針序列上去，并對映射結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，去除不飽和、比對率低等樣品；同時(shí)通過定位到參考基因集的測序序列(reads)的計(jì)數(shù)來估計(jì)基因的表達(dá)水平，根據(jù)文庫大小及基因長度等信息對表達(dá)值進(jìn)行歸一化處理后，將藥物處理組與空白對照組進(jìn)行比較，以空白對照組為1，計(jì)算基因表達(dá)變化倍數(shù)為藥物對該基因的影響倍數(shù)。20種中藥提取物對LDLR基因的影響結(jié)果見表1。表1、20種藥物對LDLR基因的影響結(jié)果提取物名稱LDLR基因變化倍數(shù)益母草1.06童子益母草4.23大羽貫眾1.18雞血藤1.84長梗黃精0.94麥冬1.27昆明雞血藤0.97龍膽1.29單葉蔓荊1.29扁豆1.39白花敗醬草1.06白毛夏枯草1.39披針貫眾1.03薤白1.24黃花敗醬草1.13黃連4.49天冬1.04黃芩1.72苦參1.42重瓣梔子1.11結(jié)果顯示，童子益母草對LDLR基因變化倍數(shù)為4.23，明顯高于其它中藥提取物。實(shí)施例2利用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)，即qPCR方法驗(yàn)證HMGCR、LDLR、HMGCS1基因的表達(dá)，同時(shí)驗(yàn)證益母草，具體實(shí)驗(yàn)過程為：1.分別采用童子益母草、益母草提取物處理細(xì)胞。2.利用試劑盒提取RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA。3.RT-qPCR反應(yīng)，程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40個(gè)循環(huán)。其中，引物序列為：HMGCR：上游引物TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG，下游引物TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG；LDLR：上游引物ACCAACGAATGCTTGGACAAC，下游引物ACAGGCACTCGTAGCCGAT；HMGCS1：上游引物CATTAGACCGCTGCTATTCTGTC，下游引物TTCAGCAACATCCGAGCTAGA；4.數(shù)據(jù)處理：以空白對照組的基因表達(dá)量為1，藥物處理組基因表達(dá)量大于1為基因表達(dá)上調(diào)，小于1為下調(diào)。qPCR3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和圖1。表2、童子益母草和益母草的qPCR結(jié)果比較qPCR結(jié)果顯示童子益母草可以顯著性上調(diào)LDLR基因，顯著性下調(diào)HMGCR基因和HMGCS1基因，而益母草不具備相同的作用。p值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)前第1頁1 2 3