本發(fā)明涉及鹿角霜的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗氧化活性的鹿角霜的制備方法。

背景技術(shù)：

鹿角盤指的是雄性鹿在鋸茸后殘留在角柄上的骨化物，到了第二年新茸長出前自動脫落的盤狀物質(zhì)，也命名為“鹿花盤”、“鹿角帽”，主要含有多種必需氨基酸及多種礦物質(zhì)元素。鹿角盤呈盔狀或扁盔狀，直徑2～5cm，高2～4.5cm，表面為灰黃色或灰褐色，呈蜂窩狀，底面較平并富有一定光澤，上部呈現(xiàn)出不規(guī)則的半球形形狀，質(zhì)地較為堅硬，顏色呈灰白色。近些年來，對于鹿角盤的成分主要從以下幾個部分進行研究，主要是氨基酸、無機元素、蛋白多肽類物質(zhì)等等，同時也有少量報道稱鹿角盤中含有甾體類、多糖類等物質(zhì)。

鹿角霜味咸、澀,性溫，歸腎、肝經(jīng)?！吨袊幍?010年版》將鹿角霜描述如下：表面灰白色，體輕，質(zhì)酥，氣徽，味淡，嚼之有粘牙感，有吸濕性。其具有補腎助陽、收斂止血、收澀治痢、秘精堅髓補虛等功效。用于治療腎陽不足,脾胃虛寒、食少便溏、陽痿遺精、尿頻遺尿、崩漏、帶下無子、創(chuàng)傷出血、瘡瘍久不愈合等。鹿角霜的主要成份為蛋白質(zhì)、鈣、磷及微量元素等。并含谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等17種氨基酸。近幾年的研究表明，鹿角霜能促進生長發(fā)育,振奮機體功能，能促進紅細胞、血紅蛋白及網(wǎng)狀紅細胞的生長，具有激素樣作用,能促進潰瘍傷口的再生過程,加速愈合。同時，鹿角霜對治療婦女乳房腫脹、乳腺增生、乳腺炎有明顯的效果，并對預防乳腺癌、子宮肌瘤也有很好的療效。

抗氧化是抗氧化自由基的簡稱，其作用機理是直接或間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)。越來越多的研究顯示抗氧化能夠預防衰老，因為自由基或氧化劑會將細胞和組織分解，影響代謝功能，研究抗氧化可以有效克服其所帶來的危害。因此，抗氧化作為化妝品、保健品等行業(yè)的主要研發(fā)方向，成為市場主要的需求之一。

目前，關(guān)于鹿角霜的抗氧化活性以及如何制備具有抗氧化活性的鹿角霜還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了研究鹿角霜的抗氧化活性，本發(fā)明提供一種具有抗氧化活性的鹿角霜的制備方法。

一種具有抗氧化活性的鹿角霜的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、將鹿角盤打磨成粉，稱取鹿角盤粉置于燒杯中，加入去離子水，100℃水浴熱提；

步驟二、提取完畢后，將提取液攪拌均勻倒入離心管中，8500-12000rpm、25℃離心12-20min；

步驟三、離心完畢后，收集沉淀，經(jīng)烘干、磨粉后獲得具有抗氧化活性的鹿角霜。

優(yōu)選的，鹿角盤粉與去離子水在初始階段的的用量比為1：(8-15)。

優(yōu)選的，水浴熱提三次，每次5h。

優(yōu)選的，提取過程中持續(xù)攪拌，及時補充去離子水，保持溶液的總量變化控制在5％以內(nèi)。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明首先利用熱提法制備鹿角霜，再分別采用Fe²⁺-水楊酸法、鄰苯三酚自氧化法及鐵氰化鉀還原比色法檢測分析鹿角霜的抗氧化活性。實驗結(jié)果顯示，鹿角霜具有一定的抗氧化活性，其中鹿角霜對羥自由基和超氧陰離子的清除作用較強。

本發(fā)明的鹿角霜制備工藝簡單，原料價格便宜，鹿角霜具有一定的抗氧化活性，可應用于一些如保健品、化妝品等產(chǎn)業(yè)的開發(fā)利用。

本發(fā)明中選用的制備方法不僅可以將鹿角盤粉中的有效成分完全提取出來，而且還兼顧了能耗等因素，是一種優(yōu)選的制備工藝。

附圖說明

圖1為實施例2中鹿角霜對羥自由基清除作用結(jié)果圖。

圖2為實施例3中鹿角霜對超氧陰離子清除作用結(jié)果圖。

圖3為實施例4中鹿角霜和Vc還原能力的測定結(jié)果圖。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種具有抗氧化活性的鹿角霜及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。

實施例1鹿角霜的制備

一種具有抗氧化活性的鹿角霜的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、采用熱提法，將鹿角盤打磨成粉，準確稱取10g鹿角盤粉，置于干凈的250mL燒杯中，加入去離子水100g，100℃水浴熱提三次，每次5h，提取過程中采用玻璃棒不斷持續(xù)攪拌，并且及時用去離子水補充蒸發(fā)掉的水分，保持溶液的總量變化控制在5％以內(nèi)；

步驟二、提取完畢后，將熱提三次后的提取液放在一起攪拌均勻，倒入離心管中并放入離心機，條件為：10000rpm、25℃離心15min；

步驟三、離心完畢后，取出離心管(此時應輕拿輕放，防止震蕩使原本沉淀的提取物重新漂浮在上清中)，收集沉淀，將沉淀置于烘箱內(nèi)進行烘干并進行磨粉，獲得具有抗氧化活性的鹿角霜。

實施例2Fe²⁺-水楊酸法測定鹿角霜抗氧化活性

實驗原理：Fe²⁺與H²O²反應產(chǎn)生-OH，羥自由基易攻擊芳環(huán)化合物生成羥基化合物，因此，水楊酸可以捕捉-OH。在反應期間產(chǎn)生有色物質(zhì)，這種有色物質(zhì)在510nm下有最大吸收值。研究表明，鹿角霜加入反應體系后能夠清除-OH，使有色中間產(chǎn)物的形成受阻，導致吸光值下降，進而來表示鹿角霜的抗氧化活性能力的高低。

準確稱取20mg鹿角霜，加入20mL蒸餾水，37℃恒溫水浴加熱30min對鹿角霜進行溶解，期間要用玻璃棒進行不斷攪拌，用100目標準篩進行過濾，要求篩上無明顯大顆粒物，最后收集實驗所需的濾液。在該反應體系中，依據(jù)反應原理，取5組干凈的試管進行標號，在反應體系中分別加入1mL 9mmol/LFeSO₄和1mL 9mmol/L的水楊酸乙醇溶液，混勻后，加入1mL所測的樣品溶液(見表1)，最后加入1mL 8.8mmol/L的H₂O₂來啟動反應。在空白對照液中加入1mL的蒸餾水代替等體積的水解液，37℃條件下保溫30min，利用紫外分光光度計510nm測定相應吸光值。根據(jù)所測吸光光度值，與相應的鹿角霜的濃度進行比對，從而得出鹿角霜抗氧化活性的能力。

表1鹿角霜濃度梯度

所求清除率(％)＝(A₀-(A_X-A_x0))/A₀×100％ (1)

式(1)中：A₀為空白對照液的吸光度；A_X為加入樣品溶液后的吸光度；A_x0為水解液的本底吸光度。

將相應的空白對照液的吸光度值A(chǔ)₀、加入樣品溶液后的吸光度值A(chǔ)_X、水解液的本底吸光度值A(chǔ)_x0帶入公式，得到相應的清除率，清除率可間接代表該鹿角霜濃度條件下，相應的抗氧化能力高低，所得結(jié)果見表2。

表2分光光度計數(shù)值及相應清除率

如圖1所示，通過計算得出鹿角霜在不同濃度條件下(0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL)羥自由基清除率分別為：25.2％、37.8％、53.9％、57.7％、62.7％。由此可見，隨著鹿角霜濃度的增加，抗氧化的能力逐漸增強，清除率逐漸增加。當鹿角霜濃度為1.0mg/mL時，羥自由基清除率達到62.7％。說明鹿角霜對羥自由基的清除作用較強。

實施例3鄰苯三酚自氧化法測定鹿角霜抗氧化活性

實驗原理：在一定條件下，鄰苯三酚能夠快速氧化并同時產(chǎn)生超氧化物陰離子，生成有色中間產(chǎn)物，吸光度也隨之增加，在反應體系加入鹿角霜后，能夠催化超氧化物陰離子生成H₂O₂，進而阻礙有色中間產(chǎn)物形成，降低鄰苯三酚反應速率，導致吸光值增長速率降低。

取五支干凈的試管，分別標記為“空白對照”、“1”、“2”、“3”、“4”，在“1”、“2”、“3”、“4”號試管中按順序依次加入不同濃度(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL)鹿角霜溶液0.2mL(空白管中加入0.2mL蒸餾水作為對照)。之后，向各管中分別加入5.6mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，充分混勻后加入7mmol/L鄰苯三酚溶液0.2mL，在325nm的條件下每隔30s記錄其吸光值，直到4.5min后反應結(jié)束。各個時間段內(nèi)，不同濃度的鹿角霜對應的分光光度計吸光度值見表3。

表3各時間段分光光度計相應吸光度值

所求超氧陰離子清除率(％)＝(B₀－B_Xn)/B₀×100％ (2)

式(2)中：B₀為空白對照鄰苯三酚的自氧化速率；B_Xn為不同濃度試管鄰苯三酚的自氧化速率，n＝1、2、3、4。根據(jù)所得數(shù)值進行計算，求得B₀＝0.054，B_x1＝0.031，B_x2＝0.023，B_x3＝0.020，B_x4＝0.019。

如圖2所示，通過所得的吸光度值進行計算，得出各個濃度條件下(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL)超氧陰離子清除率分別為：42.59％、57.41％、62.96％、64.81％。由此可見，隨著鹿角霜濃度的增加，抗氧化的能力逐漸增強，

清除率逐漸增加。當鹿角霜濃度為15mg/mL時，超氧陰離子清除率達到64.81％。說明鹿角霜對超氧陰離子的清除作用也較強。

實施例4鐵氰化鉀還原比色法測定鹿角霜還原能力

實驗原理：還原能力可以反映待測物提供電子的能力，一般而言，抗氧化劑的還原能力與其抗氧化能力呈正相關(guān)，可以通過測定抗氧化劑的還原能力來衡量其抗氧化活性。鐵氰化鉀還原比色法可以通過顏色改變反映出體系中氧化還原狀態(tài)的改變，是測定抗氧化劑還原能力的常規(guī)方法。待測的鹿角霜樣品溶液在弱酸性條件下可提供電子，將Fe³⁺還原為Fe²⁺，F(xiàn)e²⁺與Fe³⁺反應可生成藍色物質(zhì)使體系溶液顏色改變，在波長700nm條件下測得的吸光度A值變大。測定的A值越大，則樣品的還原能力越強。

按表4配置濃度梯度為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL和0.10mg/mL的鹿角霜樣品溶液。取五只試管分別標號，順序加入不同濃度梯度的鹿角霜樣品溶液0.5mL，加入lmL磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L、pH6.6)及l(fā)mL1％鐵氰化鉀溶液，充分混勻，并置于50℃水浴中反應20min，然后迅速冷卻，再加入1mL10％三氯乙酸溶液，取1mL該混合溶液，加入4mL蒸餾水及1mL0.1％三氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10min后于700nm處測定其吸光值。按表5配置濃度梯度為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL和0.10mg/mL的Vc溶液，作為對照組，重復上述步驟。

表4

表5

由圖3可知，鹿角霜濃度分別為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL和0.10mg/mL，測得反應體系的吸光值依次為：0.092、0.116、0.142、0.149、0.176。VC濃度分別為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL和0.10mg/mL時，測得反應體系的吸光值依次為：0.147、0.216、0.298、0.339、0.465。鹿角霜和Vc都呈現(xiàn)出隨著濃度增加，還原能力隨之上升的趨勢，說明鹿角霜和Vc的還原能力都具有一定的量效關(guān)系。還原能力越強，說明其抗氧化能力越強，還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)。

實施例5提取次數(shù)對鹿角霜最終制備產(chǎn)量的影響。

將實施例1中提取次數(shù)進行調(diào)整，研究最終得到的鹿角霜的產(chǎn)量與提取次數(shù)之間的關(guān)系。

表6：鹿角霜的產(chǎn)量與提取次數(shù)之間的關(guān)系

表6可以知道，提取次數(shù)為3次和4次時，鹿角霜的產(chǎn)量的差別已經(jīng)小于1％，為控制成本，降低能耗，優(yōu)選的提取次數(shù)為3次。

實施例6提取前的鹿角盤粉與提取后的鹿角霜抗氧化活性的區(qū)別。

將實施例2中鹿角霜替換為提取前的鹿角盤粉，得到鹿角盤粉對-OH的清除率，并與實施例2的鹿角霜對-OH的清除率進行對比。

表7：鹿角盤粉與鹿角霜對-OH的清除率的對比數(shù)據(jù)。

以上對比數(shù)據(jù)可以知道，將鹿角盤粉提取后的鹿角霜，對-OH的清除率大大提高，即使考慮到鹿角盤粉中鹿角霜提取率約為80％，將鹿角盤粉的濃度提高至1.25倍進行對比，提取后的鹿角霜對-OH的清除率仍要高出50％以上，說明鹿角盤粉中的一些其它成分對其抗氧化活性有一定的抑制作用，采用本發(fā)明的制備方法得到的鹿角霜抗氧化活性得到顯著提高。

綜上所述：近年來，對于鹿角盤抗氧化活性的相關(guān)研究較少，其熱提后剩余物即鹿角霜的開發(fā)利用更是少之又少。根據(jù)當今市場需求，越來越多的人想要保持青春，這與人體自身抗氧化能力有著密不可分的關(guān)系。本發(fā)明的鹿角霜可以充當這樣的角色，其具有一定的食用、藥用等應用價值，可經(jīng)過一些簡單的加工，制成保健品、化妝品等，原料制作工藝簡單，價格便宜，又可起到人們所需的效果。

本發(fā)明的具有抗氧化活性的鹿角霜，它是向鹿角盤粉中加入去離子水，100℃水浴熱提三次所得的提取液，10000rpm、25℃離心15min，收集沉淀，經(jīng)烘干、磨粉后獲得的。分別采用Fe²⁺-水楊酸法、鄰苯三酚自氧化法及鐵氰化鉀還原比色法檢測分析鹿角霜的抗氧化活性，結(jié)果顯示，鹿角霜具有一定的抗氧化活性，其中鹿角霜對羥自由基和超氧陰離子的清除作用較強。

根據(jù)上述實施例所得出的實驗結(jié)果中可以看出，鹿角霜濃度越高的溶液，其抗氧化能力越強，證明鹿角霜具有一定的抗氧化活性。通過鐵氰化鉀還原比色法測定鹿角霜還原能力可知，還原能力越強，說明其抗氧化能力越強，還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)。

實施例中所用儀器：722可見分光光度計選用上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)，數(shù)顯恒溫水浴鍋選用金壇市富華儀器有限公司生產(chǎn)，管式高速離心機選用德國賽多利斯有限公司生產(chǎn)，保溫箱選用東莞市立顯儀器科技有限公司生產(chǎn)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步的詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案和發(fā)明構(gòu)思，做出相應改變和替代，而且得到與本發(fā)明具有相同抗氧化活性的鹿角霜，其性能也必然相同，都應當視為本發(fā)明的保護范圍。