本發(fā)明涉及化合物L(fēng)inderolide H的新用途，尤其涉及Linderolide H在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性白血病是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病。其克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時(shí)使正常造血受抑制，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3％左右，是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤。白血病的發(fā)病率在世界各國中，歐洲和北美發(fā)病率最高，其死亡率為3.2-7.4/10萬人口。尋找能夠防治急性白血病的藥物顯得非常迫切。
本發(fā)明涉及的化合物L(fēng)inderolide H是一個(gè)2014年發(fā)表(Qing Liu,et al.,Sesquiterpene lactones from the roots of Lindera strychnifolia.Phytochemistry,87(2013)112–118.)的新化合物，該化合物擁有全新的骨架類型，目前發(fā)現(xiàn)其能導(dǎo)致食物損壞(Qing Liu,et al.,Sesquiterpene lactones from the roots of Lindera strychnifolia.Phytochemistry,87(2013)112–118.)，對于本發(fā)明涉及的Linderolide H在制備治療白血病藥物中的用途屬于首次公開，由于屬于全新的結(jié)構(gòu)類型，而且其對于治療白血病活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于白血病的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有Linderolide H研究中未發(fā)現(xiàn)其具有治療白血病活性的報(bào)道的現(xiàn)狀，提供了Linderolide H在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
Linderolide H通過抑制白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)增殖和誘導(dǎo)白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)凋亡，來對白血病進(jìn)行治療。
所述化合物L(fēng)inderolide H,結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示：
本發(fā)明涉及的Linderolide H在制備治療白血病藥物中的用途屬于首次公開，而且由于骨架類型屬于全新的骨架類型,而且其對于白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性和凋亡誘導(dǎo)的生物活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于白血病的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)inderolide H的制備方法參見文獻(xiàn)(Qing Liu,et al.,Sesquiterpene lactones from the roots of Lindera strychnifolia.Phytochemistry,87(2013)112–118.)
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
實(shí)施例1：本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)inderolide H片劑的制備：
取20克化合物L(fēng)inderolide H,加入制備片劑的常規(guī)輔料180克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成1000片。
實(shí)施例2：本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)inderolide H膠囊劑的制備：
取20克化合物L(fēng)inderolide H，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉180克，混勻，裝膠囊制成1000粒。
下面通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步說明其藥物活性。
試驗(yàn)例：Linderolide H抑制HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡
1材料和方法
1.1材料 RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、羅丹明123為Sigma公司產(chǎn)品；Caspase-3,9分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60購于中科院上海細(xì)胞生物研究所，培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，青霉素100kU/L，鏈霉素100mg/L，37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.3人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離
無菌采集健康供者靜脈血，肝素抗凝(每毫升全血加0.1ml的200U/ml肝素鈉溶液)，PBS等倍稀釋血液，1:4加入人淋巴細(xì)胞分離液，2000rpm離心20min，收集乳白層后用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基1500rpm10min離心洗滌2次，獲得單個(gè)核細(xì)胞，臺盼藍(lán)拒染率大于95％，重懸于10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中備用。
1.4 Linderolide H對HL-60細(xì)胞和人PBMC生長的影響
接種HL-60細(xì)胞和人PBMC與96孔板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞(100ul)。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組一次加0.625、1.25、2.5、5.0、10.0ug/mL的Linderolide H，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72h后，終止培養(yǎng)，設(shè)只加培養(yǎng)液的對照組，每個(gè)劑量組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h，每孔加入20ul MTT溶液(5g/L)，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150uL DMSO，震蕩10min，選擇570nm波長，在自動(dòng)酶聯(lián)檢測儀上測定各孔吸光度(A)值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，并計(jì)算其生長抑制率(CI)。CI＝(陰性對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/陰性對照組A值×100％。
1.5流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率
收集0、2.5、5.0、10.0ug/mL Linderolide H處理48h的各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入預(yù)冷的70％乙醇于-20℃固定24h，離心洗滌后加入200uL PI染液，50ul RNA酶，4℃避光放置20min，1500rpm離心5min。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml～1×106個(gè)/ml，上流式細(xì)胞儀分析，激發(fā)光源為氬離子激光，激發(fā)波長為488nm。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析
軟件SPSS13.0處理，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。
2結(jié)果
2.1 Linderolide H對HL-60細(xì)胞及PBMC生長的影響對照組HL-60細(xì)胞生長活躍，經(jīng)0.625、1.25、2.5、5.0、10.0ug/mL的HouttuynoidB處理24、48、72h后，HL-60細(xì)胞生長均不同程度的減慢，并呈時(shí)間、濃度依賴性。在相同濃度下，培養(yǎng)72h Linderolide H對人PBMC幾乎無抑制作用，與HL-60細(xì)胞比較有顯著性差異(P<0.05)(見表1)。
表1 Linderolide H對HL-60細(xì)胞增殖的影響(x±s，n＝4)
與24h比較*p<0.05**p<0.01；與48h比較△p<0.05△△p<0.01；與72h比較▲p<0.05▲▲p<0.01
2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測HL-60細(xì)胞凋亡
HL-60細(xì)胞與不同濃度的Linderolide H作用48h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示G1期峰前均出現(xiàn)了代表細(xì)胞凋亡的亞二倍體峰，在一定濃度范圍內(nèi)隨著Linderolide H濃度增升高，HL-60細(xì)胞凋亡率升高，其中10.0ug/mL Linderolide H作用48h凋亡率達(dá)到(22.16±4.87)％(表2)。
表2 Linderolide H作用48h后對HL-60細(xì)胞凋亡率的影響(x±s，n＝3)
與陰性對照組比較*p<0.05,**p<0.01
結(jié)論：Linderolide H能夠抑制白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)增殖和誘導(dǎo)白血病細(xì)胞(HL-60細(xì)胞)凋亡，因此，可以用來對白血病進(jìn)行治療。