本發(fā)明涉及實驗動物模型領(lǐng)域，具體提供了一種繼發(fā)齲動物模型。

背景技術(shù)：

齲病是口腔最常見疾病之一，充填治療是其最常規(guī)治療方式。充填治療的充填材料對于繼發(fā)齲的抑制作用的評估急需解決但尚無可行性方案。自1928年mccollum將動物實驗引入齲病研究，齲病的動物實驗研究方法不斷改進(jìn)，直至1958年keyes建立了至今仍是最為廣泛承認(rèn)和使用的齲病研究的“keyes齲病動物模型”。keyes模型建立了一套完整的齲病發(fā)生，發(fā)展和評估的動物模型，多用于各種致齲因素的探究。但隨著時代的發(fā)展，此方法也逐漸暴露出一些不能與時俱進(jìn)的問題。最典型的就是，keyes模型適用于自然齲病的評估，并不適用于充填后的繼發(fā)齲研究，當(dāng)今用于齲病充填口腔材料層出不窮，對于它們的體外實驗也種類繁多，唯獨沒有一種動物實驗?zāi)Ｐ湍軌驖M足充填繼發(fā)齲的評估，更不要說抑制繼發(fā)齲的充填材料的評估。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于現(xiàn)有技術(shù)僅能滿足原發(fā)齲病研究，對于抑制口腔繼發(fā)齲及其藥物效用的評估并沒有可行動物實驗?zāi)Ｐ偷倪@一問題，本發(fā)明提供了一種繼發(fā)齲動物模型，它包括如下操作：

(1)取除人外的易產(chǎn)齲動物，抗生素處理三天，同時以spf級飼料喂養(yǎng)；

(2)抗生素處理完后，使用spf級飲用水和飼料喂養(yǎng)一天；

(3)麻醉后，在第一磨牙的第一裂隙處制備直徑約0.6mm，深0.3-0.6mm的洞型，再在洞型內(nèi)填入填充物；

(4)從第5日起，在易產(chǎn)齲動物口內(nèi)接種可致齲的細(xì)菌，同時，換用蔗糖水、致齲飼料，飼養(yǎng)3周，即得繼發(fā)齲動物模型。

本發(fā)明所述“易產(chǎn)齲動物”，是指容易產(chǎn)生齲齒的動物。

本發(fā)明一個具體實施方式中，蔗糖水的濃度為5％g/ml，致齲飼料為2000#。

其中，步驟(1)中，所述除人外的易產(chǎn)齲動物為嚙齒動物或靈長類動物。

其中，所述嚙齒選自大鼠，進(jìn)一步為wistar大鼠或sd大鼠，優(yōu)選使用wistar大鼠。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所使用的wistar大鼠為3周齡。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述抗生素為廣譜抗生素；進(jìn)一步選擇青霉素類抗生素，優(yōu)選為氨芐青霉素。本發(fā)明一個具體實施方式中，針對相對應(yīng)的大鼠，給予氨芐青霉素水溶液濃度為1g/l。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，分別在上頜或下頜左右第一磨牙的第一裂隙處制備洞型。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，選擇在上頜左右第一磨牙制備洞型。理論上，上下頜都可以，但是下頜的操作性極差，最后使用上頜第一磨牙也是綜合了上下頜所有牙做出的選擇。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述填充物是已知填充材料、待測材料或/和待測藥物。填入填充材料后產(chǎn)生的齲稱為繼發(fā)齲。本發(fā)明一個具體實施方式中，一側(cè)洞型選用材料為日本可樂麗公司(kuraray)生產(chǎn)的樹脂粘結(jié)劑(sebond)，另一側(cè)為加個一種抗菌藥物dmaddm的sebond，其結(jié)果可測評兩種藥物的抗菌差異。在實際使用的過程中，同一只大鼠的兩側(cè)分別為不同藥物，可形成在同一個體的左右對照，其數(shù)據(jù)更具說服力。

進(jìn)一步地，步驟(4)中所述接種變異鏈球菌，是將10^8cfu/ml變異鏈球菌混懸液涂布于口腔內(nèi)，每日涂布兩次，間隔20-40分鐘(本發(fā)明一個具體實施方式中間隔30分鐘)，連續(xù)三日。

本發(fā)明提供的繼發(fā)齲動物模型，解決了現(xiàn)無模型適用于充填體抑制繼發(fā)齲效用評估的弊端，對繼發(fā)齲填充材料或藥物的研究提供了基礎(chǔ)。

本發(fā)明中，口腔科一切可用于牙齒備洞的器材均可用于制備洞型，進(jìn)一步地，根據(jù)動物口腔的大小，對于大鼠，推薦齒科直機(jī)配合長柄求鉆，直徑約0.6mm。

本發(fā)明中選用的洞型尺寸大小，是通過大量的實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在操作便捷的情況下，同時滿足備洞的固位型和不穿髓，只能采用本發(fā)明記錄的尺寸范圍，也僅有在此范圍內(nèi)才能成功造模。另外，本發(fā)明造模過程中，大鼠死亡是前期實驗中遇見的一個障礙，實驗發(fā)現(xiàn)，備洞是導(dǎo)致死亡的最重要操作過程。不僅如此，某些程度的備洞失敗(如穿髓)，雖然不會導(dǎo)致死亡，但也導(dǎo)致樣本的剔除，所以本發(fā)明造模過程中最核心和最“危險”的操作就是備洞。通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，備洞最重要的就是器械選用和備洞位點，備洞位點如上所述，而器械則選用長柄球鉆，球鉆直徑0.6mm。

基于上述動物模型，本發(fā)明還提供了對繼發(fā)齲藥物活性的評估方法，它包括如下操作步驟：

(1)按照上述方法制備繼發(fā)齲動物模型中，不同的是，在同一動物模型左右制備的洞型中分別填入待測藥物或?qū)φ瘴?，但至少有一個洞型填入了待測藥物；

(2)3周后，處死模型動物，取出備洞磨牙，染色，劈開，顯微鏡下觀察并評分；評分標(biāo)準(zhǔn)如下：

第一，將洞型內(nèi)全層厚度等分三份，外1/3為淺層(記為s)，1/3-2/3為中層(記為m)，2/3以上為深層x(記為x)；第二，每一層沿著洞緣的總長度等分三份，每一等份設(shè)為1個單位，長度的評估在每一層下單獨評定，單位最小為1，不可再分；劈開的磨牙最終評分將取決于得分大的一側(cè)；

(3)得到的左右磨牙評分將用于比較繼發(fā)齲的嚴(yán)重程度，評分越高，說明在此層下齲病越重；比較左右磨牙高低，即可得出待測藥物對于繼發(fā)齲的抑制作用。

本發(fā)明各步驟參數(shù)和條件環(huán)環(huán)相扣，是一個有機(jī)的整體，只有在本發(fā)明所提供的一系列條件下制作模型，才能夠達(dá)到較為準(zhǔn)確的齲齒分級，滿足對藥物評估的需求。如果隨意改變參數(shù)條件，例如延長致齲時間、增加菌株接種頻率或抗生素處理不足等，齲病情況會有顯著影響，例如可能齲病會嚴(yán)重到使雙側(cè)的評分都達(dá)到最高級(3單位，三層)，導(dǎo)致雙側(cè)的對比性消失，左右評估對比失敗，所以，本發(fā)明所給出的最佳條件，并非是致齲的最佳條件，而是追求達(dá)到對齲病程度的控制，使其既不會太嚴(yán)重也不會太輕，保證達(dá)到左右可對比的目的。

本發(fā)明中3個等級的劃分，在理論上具有“不大不小”的程度，如若劃分過細(xì)(如5個等級)則會大大降低人眼的分辨率，而過粗(如2個等級)則會降低模型的檢驗效能。

使用本發(fā)明評估方法，首次實現(xiàn)了在動物模型中對繼發(fā)齲藥物的活性評價，并且，該方法可以在同一個體上同時進(jìn)行藥物組和對照組的比較，能夠較為準(zhǔn)確地反映待測藥物對繼發(fā)齲的影響效果。

本發(fā)明所述“第一裂隙”(英文為sulci)，在1958年keyes研究中被報道，是指從近中向遠(yuǎn)中數(shù)的第一個裂隙，此為口腔領(lǐng)域術(shù)語。

本發(fā)明中記載的“第5日”，是從大鼠第一次使用抗生素處理之日起計。

附圖說明

圖1評分示意圖。圖中黑色區(qū)域用以代替鏡下染紅的齲壞組織，評分將厚度分為三層，分層評估長度：外層(厚度外1/3)總長度累及約2/3，即3個單位中的2個，中層累及約1個單位，內(nèi)層為1個單位。最終評分記為(2，1，1)。

圖2驗證實驗評分?jǐn)?shù)據(jù)圖。評估分為三層，即淺層(s-plane)，中層(m-plane)，深層(x-plane)，藥物將在三層上的評分分別被左右配對比較，圖2中的a，b，c為三層的比較結(jié)果，橫坐標(biāo)：control組是為添加藥物的純粹粘結(jié)劑組，dmaddm為加入了此藥的粘結(jié)劑組；縱坐標(biāo)：score為評分法的評分，評分越高，說明在此層下某組的齲病越重。最高為3，最低為0。

具體實施方式

實施例1模型的制作方法

1.選取wistar品系大鼠，3周齡，spf級別環(huán)境飼養(yǎng)，性別不限，建議雄性。

2.抗生素處理：廣譜抗生素水(推薦氨芐青霉素1g/l)；普通spf級別飼料，喂養(yǎng)3天。

3.洗脫：普通spf級別飲用水和飼料喂養(yǎng)一天。

4.充填處理：在洗脫期間完成，腹腔注射麻醉大鼠(推薦10％水合氯醛，根據(jù)體重劑量為0.5ml/kg)，使用球鉆在其左右上頜第一磨牙的第一裂隙處制備直徑約0.6mm，深0.3-0.6mm的洞型，左右洞型內(nèi)分別充填待測充填材料和對照藥物。

5.致齲：從第5日，國際標(biāo)準(zhǔn)變異鏈球菌ua159，濃度調(diào)至10^8cfu/ml，使用棉簽蘸取涂于大鼠口內(nèi)，每日兩次，間隔30分鐘，連續(xù)三日。

6.從第5日，換用5％蔗糖水，2000#致齲飼料，飼養(yǎng)3周即可。

按照實施例1方法，本發(fā)明已經(jīng)成功造模26例，證明該方法重復(fù)性較好。

實施例2使用該模型進(jìn)行評分的方法

(1)3周后，安樂死處死，取出上頜骨(上面包含備洞牙齒)樣本用0.4％紫脲酸銨染色12小時，然后沿近遠(yuǎn)中方向劈開(用于劈頜骨的切割機(jī)刀片不厚于0.1毫米)，將處理后的樣本置于體視顯微鏡下觀察并評分。

(2)評分：包含兩方面，第一，對于洞型內(nèi)全層厚度的三等分(外1/3為淺層s，1/3-2/3為中層m，2/3以上為深層x)；第二，每一層沿著洞緣的總長度三等分(每一等分設(shè)為1個單位)。長度的評估(單位數(shù))將在每一層下單獨評定，單位最小為1，不能進(jìn)一步再分，劈成2側(cè)的樣本最終評分將取決于得分大的一半。

(3)鏡下，齲壞組織將被染成紅色。得到的左右雙側(cè)磨牙評分將用于比較雙側(cè)繼發(fā)齲的嚴(yán)重程度，評分越高，說明在此層下某組的齲病越重。從評分比較雙側(cè)充填物對于繼發(fā)齲抑制作用的效用。相關(guān)案例評分示意圖見圖1。

實施例3驗證一種季銨鹽添加的口腔粘結(jié)劑對繼發(fā)齲的抑制效用

按實施例1、2實施，左右上頜洞型內(nèi)分別充填季銨鹽粘結(jié)劑和普通粘結(jié)劑，經(jīng)過致齲，處死，制備樣本等過程，評分后統(tǒng)計學(xué)檢驗得到以下結(jié)果(圖2)。繼發(fā)齲在三層皆有差異，說明添加季銨鹽的粘結(jié)劑在淺中深三個層次深度比普通粘結(jié)劑有更強的抑制繼發(fā)齲的效用。

三級的繼發(fā)齲評分如圖2，統(tǒng)計學(xué)上顯示在三級上左右皆有差異(p<0.05)，說明藥物對抑制繼發(fā)齲有效，三級劃分具有可識別的科學(xué)性，且有效性能被此方法檢出。