本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及主動靶向抗腫瘤納米藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是一種以局部表現(xiàn)為主的全身系統(tǒng)性疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率逐漸增高。隨著有關(guān)惡性腫瘤知識的普及、危險(xiǎn)因素的干預(yù)和普查的廣范開展，早期檢出率不斷提高，加上各種治療手段的進(jìn)步，病死率有所下降。但如何使病人獲得最合適的，即效果好，副反應(yīng)小的治療仍然是腫瘤科醫(yī)生所不懈追求的目標(biāo)。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療等治療手段都有其一定的局限性，新興的內(nèi)分泌治療、靶向治療、生物治療等不斷地顯示出其優(yōu)越性。

納米科學(xué)是一門涵蓋多學(xué)科跨領(lǐng)域的前沿交叉學(xué)科，近年來飛速發(fā)展，其與醫(yī)學(xué)的交叉碰撞產(chǎn)生了令人矚目的成果，如白蛋白紫杉醇、脂質(zhì)體阿霉素等納米載藥體系明顯提高了化療藥物的抗腫瘤療效，降低了毒副作用，臨床意義重大，經(jīng)濟(jì)、社會效益顯著。白蛋白結(jié)合型紫杉醇是唯一應(yīng)用白蛋白納米技術(shù)構(gòu)建的靶向化療藥物，利用獨(dú)特的納米技術(shù)使疏水性紫杉醇與白蛋白結(jié)合，無需使用有毒溶劑。在血液中以兩種形式存在:游離型紫杉醇(5％-10％)和白蛋白結(jié)合型紫杉醇(90-95％)，游離型紫杉醇體積很小，能夠以被動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙到達(dá)腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致其凋亡。白蛋白結(jié)合型紫杉醇利用白蛋白在體內(nèi)的天然轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制(gp60-caveolin-1-SPARC)，以主動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入腫瘤間質(zhì)，使紫杉醇更多分布于腫瘤組織，達(dá)到更高的腫瘤細(xì)胞內(nèi)濃度。(曲妥珠單抗)是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，特異性地作用于人表皮生長因子受體-2(HER2)的細(xì)胞外部位。通過抑制HER2下游的信號通路從而抑制HER2過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的增殖。納米藥物靶向治療腫瘤領(lǐng)域正不斷朝著更精準(zhǔn)更多重靶向的方向發(fā)展。本研究即受此思路啟發(fā)，充分拓展內(nèi)涵，在現(xiàn)有科技水平上，首次將與兩種臨床上市藥物進(jìn)行藥物重組，構(gòu)建一種精準(zhǔn)且雙重靶向HER2(+)惡性腫瘤細(xì)胞、組織的主動靶向納米載藥體系。預(yù)期獲得相比重組藥物中每一單一組分更有的抗腫瘤作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的在于秉承精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的理念，提供一種靶向HER2(+)腫瘤細(xì)胞的主動靶向抗腫瘤納米藥物及其制備方法和應(yīng)用，其中組分對HER2(+)腫瘤細(xì)胞具有靶向作用，且能通過抑制HER2下游信號通路來發(fā)揮抗腫瘤作用，組分具有對紫杉醇高載藥性能、EPR被動靶向腫瘤組織等特點(diǎn)，將廣譜的抗腫瘤藥物雙重靶向輸送至腫瘤組織、細(xì)胞。二者協(xié)同可實(shí)施精準(zhǔn)有力的雙重打擊，同時(shí)減少對正常組織、細(xì)胞的毒副作用。

技術(shù)方案：主動靶向抗腫瘤納米藥物的制備方法，步驟為：按比例，取5mg/mL白蛋白結(jié)合型紫杉醇0.5mL加入1mL PBS中，再加入5.75×10^-7g/mL NHS100μL，以10rpm速度反應(yīng)30min后，加入2.3×10^-7g/mL EDC10μL及0.2mg/mLAnti-ErbB 2單克隆抗體20μL，4℃層析柜中以10rpm反應(yīng)24小時(shí)后收集反應(yīng)物，高速離心機(jī)以10000rpm離心45min后收集沉淀，用1mL PBS重懸得偶聯(lián)化合物。

上述制備方法所獲得的偶聯(lián)化合物。

上述偶聯(lián)化合物在制備主動靶向抗腫瘤納米藥物中的應(yīng)用。

上述的腫瘤指實(shí)體腫瘤。

有益效果：實(shí)驗(yàn)研究表明，通過使用重組新一代主動靶向抗腫瘤納米藥物，在細(xì)胞水平可以觀察到對HER2(+)腫瘤細(xì)胞相比兩種獨(dú)立組分較高的毒性、凋亡率及細(xì)胞周期阻滯效果。動物水平上可以觀察到其對荷瘤裸鼠更高的腫瘤抑制率及更小的毒副作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明藥物合成和作用機(jī)制示意圖，其中①：重組主動靶向抗腫瘤納米藥物結(jié)構(gòu)示意圖：白蛋白結(jié)合型紫杉醇是唯一應(yīng)用白蛋白納米技術(shù)構(gòu)建的靶向化療藥物，利用獨(dú)特的納米技術(shù)使疏水性紫杉醇與白蛋白結(jié)合，無需使用有毒溶劑。在血液中以兩種形式存在:游離型紫杉醇(5％-10％)和白蛋白結(jié)合型紫杉醇(90-95％)，游離型紫杉醇體積很小，能夠以被動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙到達(dá)腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致其凋亡。白蛋白結(jié)合型紫杉醇利用白蛋白在體內(nèi)的天然轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制(gp60-caveolin-1-SPARC)，以主動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入腫瘤間質(zhì)，使紫杉醇更多分布于腫瘤組織，達(dá)到更高的腫瘤細(xì)胞內(nèi)濃度。(曲妥珠單抗)是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，特異性地作用于人表皮生長因子受體-2(HER2)的細(xì)胞外部位。通過抑制HER2下游的信號通路從而抑制HER2過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的增殖。②、③：與通過EDC/NHS法“一步法”反應(yīng)生成偶聯(lián)物，通過尾靜脈注射重組主動靶向抗腫瘤納米藥物至荷瘤裸鼠模型中，綜合對Her2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的靶向作用以及納米制劑紫杉醇高載藥性能、EPR被動靶向腫瘤組織等特點(diǎn)，將廣譜的抗腫瘤藥物主動靶向性的輸送到HER2(+)腫瘤細(xì)胞中、實(shí)施精準(zhǔn)有力的雙重打擊，減少對正常細(xì)胞的毒副作用。

圖2為本發(fā)明藥物電鏡照片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了重組新一代主動靶向抗腫瘤納米藥物及其制備方法，將(白蛋白結(jié)合型紫杉醇)與(曲妥珠單抗)兩種臨床上市藥物通過EDC/NHS法進(jìn)行“一步法”偶聯(lián)構(gòu)建藥物傳輸系統(tǒng)，本發(fā)明主要運(yùn)用于實(shí)體腫瘤，如HER2(+)乳腺癌、胃癌等。本發(fā)明的新一代主動靶向抗腫瘤納米藥物可以制成靜脈注射的凍干粉制劑。綜合對HER2(+)腫瘤細(xì)胞的靶向作用以及納米制劑紫杉醇高載藥性能、EPR被動靶向腫瘤組織等特點(diǎn)，將廣譜的抗腫瘤藥物雙重靶向輸送至腫瘤組織、細(xì)胞實(shí)施精準(zhǔn)有力的雙重打擊，同時(shí)減少對正常組織、細(xì)胞的毒副作用。總之，本發(fā)明將兩種臨床上市藥物進(jìn)行重組，制備步驟簡單，開發(fā)成本低，生物相容性高，在現(xiàn)代腫瘤靶向治療中具有重要的價(jià)值。

實(shí)施例1

(1)重組新一代主動靶向抗腫瘤納米藥物及其制備方法

利用中的白蛋白組分與中的氨基或羧基末端通過EDC/NHS法將二者進(jìn)行一步法偶聯(lián)。具體步驟：取1mL(5mg/mL，貨號：6109342)加入1mL PBS中，再加入100μL NHS(5.75×10^-7g/mL)以10rpm速度反應(yīng)30min后，加入10μL EDC(2.3×10^-7g/mL)及10μL Anti-ErbB2單克隆抗體(0.2mg/mL，貨號ab2428)，4℃層析柜中以10rpm反應(yīng)24小時(shí)后收集反應(yīng)物，高速離心機(jī)以10000rpm離心45min后收集沉淀，用1mL PBS重懸，分裝保存。并通過動態(tài)光散射(DLS)檢測其水和粒徑、透射電鏡檢測觀察復(fù)合物的粒徑大小。結(jié)果顯示所制得的藥物具有良好的穩(wěn)定性，粒徑大小約為130±30nm(如圖2所示)

(2)體外對腫瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究

通過CCK-8檢測重組藥物對HER2(+)乳腺癌及胃癌細(xì)胞抑制率的影響、AnnexinⅤ/PI雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況、DAPI染料觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，上述結(jié)果顯示重組藥物相比單一組分具有更高的體外殺傷力。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果摘要如下：CCK-8法檢測得出PTX、處理乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞48H后得出其IC50分別為0.04、0.02、0.004ug/ml,上述三種劑型藥物取紫杉醇等效濃度處理SK-BR-3細(xì)胞48H后其晚期凋亡率分別為6.2％、11.4％、18.2％。

(3)體內(nèi)抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

建立HER2(+)乳腺癌及胃癌裸鼠移植瘤原位接種模型并觀察裸鼠生存曲線及腫瘤抑制率，近紅外染料預(yù)染藥物并通過小動物活體成像觀察其在裸鼠體內(nèi)分布情況。結(jié)果表明，重組藥物具有比單一組分更大的體內(nèi)腫瘤抑制率，且能改善裸鼠的生存質(zhì)量、延長生存期。小動物活體成像表明重組藥物在腫瘤部位具有更高的蓄積性，提示重組藥物較高的靶向性。

綜上所述：我們經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究，構(gòu)建了新一代主動靶向抗腫瘤納米藥物及其制備方法，對細(xì)胞和動物的實(shí)驗(yàn)表明，該藥物相比單一組分抗腫瘤效應(yīng)更顯著，因此，這種技術(shù)可望用于臨床惡性腫瘤的綜合治療。本發(fā)明將大大加快新藥開發(fā)的速度，對腫瘤精準(zhǔn)治療具有重要的價(jià)值。